Articolo metodologico
Questo protocollo descrive un flusso di lavoro dettagliato per la generazione ed ex vivo caratterizzazione dei virus oncolytic per espressione di immunomodulatori, usando i virus di morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio. Applicazione e adattamento ad altre piattaforme di vettore e transgeni accelererà lo sviluppo di nuovi immunovirotherapeutics per la traduzione clinica.
Immunoterapia del cancro di successo ha il potenziale per raggiungere il controllo a lungo termine del tumore. Nonostante recenti successi clinici, ci rimane un urgente bisogno di terapie sicure ed efficaci su misura per profili immune tumore specifico. Virus oncolitici abilitare l'induzione delle risposte immunitarie antitumorali come pure l'espressione genica del tumore limitato. Questo protocollo descrive la generazione ed ex vivo analisi di immunomodulatori oncolytic vettori. Concentrandosi sui virus vaccino morbillo codifica anticorpo cellula T ager come esempio, la metodologia generale può essere adattata ad altre specie del virus e transgeni. Il flusso di lavoro presentato comprende la progettazione, clonazione, salvataggio e propagazione di virus ricombinanti. Saggi per analizzare la cinetica di replica e l'attività litica del vettore così come funzionalità dell'immunomodulatore isolato ex vivo sono inclusi, facilitando così la generazione di nuovi agenti per un ulteriore sviluppo in modelli preclinici e, infine, traduzione clinica.
Virus oncolitici (OVs) stanno sviluppandi come terapie anti-cancro che specificamente replicano all'interno e uccidere le cellule tumorali mantenendo intatti i tessuti sani. Esso è ormai diventato comune comprensione che Oncolitica oncolytic (OVT), nella maggior parte dei casi, non affidarsi esclusivamente alla lisi completa del tumore replica efficiente e la diffusione del virus, ma richiede ulteriori meccanismi di azione per il successo del trattamento, tra cui vascolare e stromal di targeting e, soprattutto, stimolazione immune1,2,3,4. Me....
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Nota: [O], [P] e [M] indicare applicabili alle sottosezioni: OVs in generale, paramyxoviruses (la maggior parte) o MV solo, rispettivamente. [B] indica le sezioni specifiche per BTE transgeni.
1 clonazione dei transgeni immunomodulatore-codifica in vettori del Virus di morbillo
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La figura 1 illustra il meccanismo di azione del virus di morbillo oncolitici codifica anticorpo cellula T ager. Un diagramma di flusso che descrive il flusso di lavoro del presente protocollo è presentato nella Figura 2. Figura 3 Mostra un esempio di un genoma di virus di morbillo oncolytic modificate. Questo fornisce una rappresentazione visiva dei cambiamenti specifici applicati .......
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L'immunoterapia oncolytic (vale a dire., OVT in combinazione con immunomodulazione) rappresenta una grande promessa per il trattamento del cancro, chiedendo ulteriori sviluppo e ottimizzazione di virus oncolitici codifica proteine immunomodulatori. Questo protocollo descrive i metodi per generare e convalidare tali vettori per la prova successiva in modelli preclinici rilevanti e potenziale futuro traduzione clinica in nuove terapie anti-cancro.
Numerose piattaforme di virus oncolytic.......
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C.E. Engeland è elencato come co-inventore di un brevetto per quanto riguarda virus del RNA per cancro Immunovirotherapy posseduto dall'Università di Heidelberg. J.P.W Heidbuechel non ha nulla a rivelare.
Questi metodi sono stati stabiliti nel gruppo Oncolitica guidato dal Prof. Dr. Dr. Guy Ungerechts presso il centro nazionale per patologie tumorali a Heidelberg. Siamo grati a lui e tutti i membri del team di laboratorio, soprattutto Dr. Tobias Speck, Dr. Rūta Veinalde, Judith Förster, Birgit Hoyler e Jessica Albert. Questo lavoro è stato supportato dall'altro Kröner-Fresenius-Stiftung (Grant 2015_A78 al C.E. Engeland) e la Fondazione di scienza nazionale tedesca (DFG, concedere EN 1119/2-1 al C.E. Engeland). J.P.W Heidbuechel riceve uno stipendio da Helmholtz International Graduate School for Cancer Research.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DNA rapido Dephos & Kit di legatura | Roche Life Science, Mannheim, Germania | 4898117001 | |
| Kit di clonazione PCR CloneJET | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | K1231 | |
| Agarosio | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | A9539-500G | |
| Kit di estrazione su gel QIAquick | QIAGEN, Hilden, Germania | 28704 | |
| NEB 10-beta Competente E. coli | New England Biolabs (NEB), Francoforte sul Meno, Germania | C3019I | |
| LB medium dopo Lennox | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | X964.1 | |
| Ampicillina | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | HP62.1 | |
| QIAquick Miniprep Kit | QIAGEN, Hilden, Germania | 27104 | |
| Enzima di restrizione HindIII-HF | New England Biolabs (NEB), Francoforte sul Meno, Germania | R3104S | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Invitrogen, Darmstadt, Germania | 31966-021 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Biosera, Boussens, Francia | FB-1280/500 | |
| FugeneHD | Promega, Mannheim, Germania | E2311 | può essere sostituito dal reagente di trasfezione di scelta |
| Kanamicina | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | K0129 | |
| Vero cells | ATCC, Manassas, VA, USA | CCL81 | |
| B16-CD46/ B16-CD20-CD46 | J. Heidbuechel, DKFZ Heidelberg | disponibile su richiesta | |
| Granta-519 | DSMZ, Braunschweig, Germany | ACC 342 | |
| Opti-MEM (terreno senza siero) | Gibco Life Technologies, Darmstadt, Germany | 31985070 | |
| Colorimetric Cell Viability Kit III (XTT) | PromoKine, Heidelberg, Germania | PK-CA20-300-1000 | include il reagente XTT |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) di DulbeccoGibco | Life Technologies, Darmstadt, Germania | 14190-094 | |
| QIAquick Ni-NTA Spin Columns | QIAGEN, Hilden, Germania | 31014 | |
| Cloruro di sodio | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | 3957.3 | |
| Imidazole | Carl Roth, Karlsruhe, Germania | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | Merck, Darmstadt, Germania | proteine BCA UFC901024 | |
| Merck Milipore | 71285-3 | ||
| IgG da siero umano | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | I4506 | |
| Anti-HA-PE | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania | 130-092-257 | RRID: AB_871939 |
| IgG1 di topo, controllo dell'isotipo kappa, coniugata con ficoeritrina, clone MOPC-21 anticorpo | BD Biosciences, Heidelberg, Germania | 555749 | RRID: AB_396091 |
| Anticorpo anti-HA-biotina, clone 3F10 | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germania | 12158167001 | RRID: AB_390915 |
| Microsfere anti-biotina | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania | 130-090-485 | |
| MS Columns | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-201 | |
| Separatore MiniMACS | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-102 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germania | 130-042-303 | |
| tampone RIPA | Rockland Immunochemicals, Gilbertsville, PA, USA | MB-030-0050 | |
| CytoTox 96 Saggio di citotossicità non radioattiva | Promega, Mannheim, Germania | G1780 | include 10 volte la soluzione di lisi, la soluzione di substrato (miscela di substrato e tampone di analisi) e la soluzione di arresto |
| Sollevatore di celle | Corning, Reynosa, Messico | 3008 | |
| Piastre da 10 cm | Corning, Oneonta, NY, USA | 430167 Piastre da | |
| 15 cm | Greiner Bio-One, Frickenhausen, Germania | 639160 | |
| Piastre a 96 pozzetti, U-bottom | TPP, Trasadingen, Svizzera | 92097 | |
| Piastre a 96 pozzetti, fondo piatto | Neolab, Heidelberg, Germania | 353072 | |
| Piastre a 6 pozzetti | Neolab, Heidelberg, Germania | 353046 | |
| Piastre a 12 pozzetti | Neolab, Heidelberg, Germania | 353043 | |
| provette da 50 mL | nerbe plus, Winsen/Luhe, Germania | 02-572-3001 | |
| Palloni per colture cellulari T175 | Thermo Fisher Scientific, St. Leon-Rot | 159910 | |
| 0,22 & micro; m filtri | Merck, Darmstadt, Germania | SLGPM33RS |
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