Descriviamo la istituzione di un modello murino per la malattia di Parkinson utilizzando MPTP e valutazioni comportamentali mediante cilindro e campo aperto test per misurare la funzione motoria. Usiamo quindi l-dopa come un esempio per mostrare come applicare questo modello nello studio delle droghe di PD.
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Articolo metodologico
Valutazioni del comportamento di locomozione spontanea in un modello murino indotto MPTP del morbo di Parkinson
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattia di Parkinson (MDP) è una malattia comune di disordine neurodegenerative, causando il fenomeno dell'agitazione, rigidità, lentezza dei movimenti e demenza. 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) può portare ad alcuni sintomi del Parkinson-come distruggendo i neuroni dopaminergici nel nigra di substantia del cervello. Esso è stato così utilizzato per stabilire modelli PD in vari studi su animali. Qui, topi ricevano iniezioni di MPTP (20 mg/kg/giorno) per sette giorni e i test comportamentali vengono eseguite l'ottavo giorno. Questo modello è adattato in modo efficiente nello studio del PD. I test comportamentali qui includono il cilindro test e il test di campo aperto. L'esperimento di cilindro è utilizzato per rilevare la capacità degli animali di alzare i loro paws anteriori quando sia messo in un ambiente diverso. Come il PD modello topi mostrano inarcando — il mouse inarca la schiena — il numero di diminuzione di sollevamenti di zampa. Questo test è facile da eseguire. Il test di campo aperto è utilizzato per rilevare la quantità di tempo che trascorrono i topi su esecuzione, a piedi e rimanendo immobile. Analizziamo i movimenti degli animali in campo aperto utilizzando il software e ottenere dati. Infine, usiamo l-dopa, uno dei più comunemente usati farmaci PD, come un esempio che Mostra come applicare questo modello per lo studio delle droghe di PD. I nostri risultati indicano che la neurotossicità di MPTP induce deficit del motore che può essere mitigato da l-dopa.
Introduzione
Malattia di Parkinson (PD), una delle malattie più comuni tra gli individui più anziani, è un lungo termine disordine neurodegenerative1. I pazienti mostrano sempre il fenomeno dell'agitazione, rigidità, lentezza dei movimenti e demenza che peggiorano nel tempo2. Altri sintomi compreso sensoriale, sonno e problemi emotivi sono anche comunemente osservato2. La causa del PD è ancora poco chiara, ma si crede generalmente per coinvolgere fattori sia genetici che ambientali, che inducono la perdita di neuroni dopaminergici nel nigra di substantia3e sviluppo di corpi di Lewy e i neurites di Lewy in varie regioni della cervello4.
Tra gli studi di PD, 1-Methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)5 è adattato ampiamente nel ricreare alcuni sintomi di PD in modelli sperimentali. Nel 1984, Langston et al trovato prima che le iniezioni di MPTP in scimmie scoiattolo è provocato da parkinsonismo6. Anche se il modello del roditore di MPTP non Mostra la presenza di corpi di Lewy, che è il biomarcatore di PD, MPTP causa Parkinson-come i sintomi distruggendo i neuroni dopaminergici nel nigra di substantia del cervello7. Rispetto ad altro modello di droga per PD, come quelli indotti dalla 6-idrossidopamina (6-OHDA)8 e 1-metil-4-phenylpyridinium (MPP +)9, iniezione di MPTP è facile da eseguire e il modello MPTP richiede meno tempo. Topi ricevano iniezioni di MPTP (20-30 mg/kg/giorno) per sette giorni e i test comportamentali vengono eseguite sull'ottavo giorno10.
Il campo aperto test11 è stato sviluppato da Calvin S. Hall, un americano12. In vari studi, diversi tipi di comportamenti sono testati. Nella ricerca che si concentra sulle malattie di Parkinson, comportamenti come attività di locomozione e la velocità di locomozione sono testati per verificare se la capacità dell'animale di muoversi è interessata. Rispetto ad altri metodi utilizzati per testare l'istituzione degli animali PD, campo aperto test è facile da realizzare perché l'attrezzatura necessaria è semplice, e software di analisi dati e prototipazione (ad es., MATLAB, Excel) può essere utilizzato facilmente raccogliere e rappresentare graficamente la dati. Inoltre, il coefficiente di variazione è relativamente piccolo13, che significa che il risultato del test in campo aperto è affidabile. Un altro vantaggio rispetto ad altri metodi è che i comportamenti inclusi in questo esperimento sono facili da distinguere; i topi possono essere correre, camminare o ancora in piedi. Solitamente la prova sul campo aperto può essere utilizzata su roditori, quando il ricercatore ha bisogno per valutare la mobilità del soggetto.
Al test del cilindro viene anche chiamato la prova di uso asimmetrica delle zampe anteriori. Quando questo test è stato progettato, fu utilizzato per testare l'uso asimmetrico del ratto arti anteriori14. Qui, usiamo questo test per analizzare la capacità dell'animale di allungare e utilizzare entrambi gli arti anteriori per esplorare nuovi ambienti. Quando la substantia nigra e corpo striato sono danneggiati da MPTP nel cervello, l'animale tende a inarcare la schiena e diventa meno probabile per distendervi ed esplorare l'ambiente sconosciuto. Questo test è facile da eseguire e può dare un risultato preliminare. Tuttavia, questo test presenta elevata variabilità interna, quindi è generalmente usata con insieme ad altri esperimenti di comportamento.
Assunzione di l-dopa, che è anche conosciuto come levodopa o L-3,4-diidrossifenilalanina, è un modo comune per trattare il morbo di Parkinson dal momento che una delle cause del PD è la diminuzione di dopamina nella. L-dopa è il precursore a dopamina. Ma a differenza di dopamina, può attraversare la barriera sangue - encefalica, che significa che sarà più efficiente in aumento della concentrazione di dopamina nella zona del cervello. Dopo esso attraversa la barriera emato - encefalica, l-dopa è convertito in dopamina da di decarbossilasi acida L-amminica15.
Qui descriviamo la misurazione e l'analisi della funzione motoria nei topi modello MPTP-indotto-PD utilizzando un cilindro test14 e una prova di campo aperto modificato. Amministriamo il l-dopa come un esempio che Mostra come applicare questo modello nello studio delle droghe di PD. I nostri risultati indicano che il MPTP induce deficit del motore che può essere mitigato da l-dopa.
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Protocollo
Questo studio è stato svolto secondo le regole internazionali, nazionali e istituzionali, considerando gli esperimenti sugli animali. Il protocollo di studio è stato approvato dal comitato di etica animale dell'Università di Nankai.
1. MPTP e l-dopa amministrazione
Nota: Topi BALB/c femminili Ten-settimana-vecchio sono stati forniti dall'Istituto di zoologia, Accademia cinese delle scienze. Topi sono stati alloggiati sei a gabbia sotto un ciclo luce/buio di 12 h (luci accese alle 08:00-20:00), una temperatura costante di 21-22 ° C e un'umidità relativa del 55% ± 5%. Chow del mouse standard in autoclave della stessa formulazione e acqua ad libitum è stato dato a tutti gli animali.
- Dopo una settimana di acclimatazione, dividere gli animali in tre gruppi di sei topi ogni.
- Al 1 ° gruppo, amministrare le iniezioni intraperitoneali (Vedi punto 1.5) di 250 µ l/mouse/giorno di soluzione fisiologica da giorno 1 a giorno 7 e quindi eseguire l'amministrazione intragastrica (Vedi punto 1.6) del mouse/250 µ l di soluzione fisiologica il giorno 8.
- A gruppo 2, amministrare le iniezioni intraperitoneali di 20 mg/kg/giorno di MPTP ogni giorno dal giorno 1 al giorno 7 e quindi eseguire l'amministrazione intragastrica di mouse/250 µ l di soluzione fisiologica il giorno 8.
- Gruppo 3, amministrare le iniezioni intraperitoneali di 20 mg/kg/giorno di MPTP dal giorno 1 al giorno 7 e quindi eseguire l'amministrazione intragastrica di 5 mg/kg di l-dopa il giorno 8.
- Eseguire l'iniezione intraperitoneale come segue.
- Caricare il farmaco in una siringa sterile da 1 mL con ago 26 G. Eliminare l'aria dalla siringa.
- Collottola il mouse con la pancia rivolta verso l'alto. Tenere la testa, il collo e il corpo del mouse in una linea retta pure con la testa fissata.
- Angolo dell'ago di penetrare il peritoneo. Spingere l'ago per una distanza corretta fino a quando c'è poca resistenza e poi iniettare il farmaco. Estrarre l'ago senza intoppi.
- Eseguire l'amministrazione intragastrica come segue.
- Preparare il farmaco in una siringa sterile da 1 mL con una siringa orale-sonda gastrica. Eliminare l'aria dalla siringa.
- Impugnare il mouse con la pancia rivolta verso l'alto. Tenere la testa, il collo e il corpo del mouse in una linea retta con la testa fissata.
- Tenere l'ago parallelo al corpo del mouse e inserirla dall'angolo della bocca del mouse, premendo la linguetta e spingere verso l'interno contro la mascella superiore.
- Con poca resistenza, che mostra l'ago sta entrando l'esofago senza intoppi, spingere con cautela l'ago in a debita distanza. Prima che la punta dell'ago raggiunge la parte inferiore del petto, iniettare il farmaco.
- Estrarre l'ago senza intoppi.
2. test del cilindro
Nota: I test comportamentali sono stati eseguiti il giorno 8. L-dopa è stata iniettata al terzo gruppo di topi 40 min prima dei test comportamentali. Se il test comportamentali non è fatto nella stessa stanza dove sono alloggiati gli animali, gli animali devono essere acclimatati per la nuova camera per 30-60 min prima prova.
- Eseguire il test 24 h dopo l'ultima dose di MPTP.
- Posizionare un cilindro di vetro trasparente (altezza = 19,5 cm, diametro = 15 cm, peso ≥ 1 kg) al centro di una tabella. Circondano il cilindro su tre lati con cartoncino nero per ridurre l'effetto di illuminazione ambientale. Lasciare un lato del cilindro di fronte alla telecamera per la registrazione video.
Nota: La distanza tra il cartone e il cilindro dovrebbe essere circa 4 a 8 cm. - Collegare una fotocamera (> 1 milione-pixel di risoluzione) a ~ 40-60 cm di distanza il cilindro per garantire che il cilindro completo è visibile.
Nota: Questo è troppo vicino né troppo lontano in modo da non disturbare il mouse durante la registrazione il video del suo movimento. - Posizionare un mouse nel cilindro in un momento e iniziare le riprese in una sola volta. Interrompere le riprese dopo 3 min.
Nota: Durante questo processo, cercare di evitare il rumore o luce cambia in ordine evitare che influenzano il comportamento del mouse. - Posizionare il mouse nuovamente dentro la gabbia a casa dopo il test.
- Pulire il cilindro con acqua e poi spruzzare 70% v/v etanolo sopra la parete interna per igienizzare e rimuovere profumi del mouse. Asciugare il cilindro prima di un altro mouse viene inserito in.
- Riprodurre il video a un tasso pari a 0,5 volte la velocità normale e contare il numero di ascensori di zampa contro il muro di ogni mouse.
Nota: Zampa ascensori si verificano quando il mouse si impenna sulle sue zampe posteriori, solleva entrambi gli arti anteriori sopra il livello della spalla e terre. Un ascensore di zampa anteriore non viene conteggiato. Di solito, un mouse genera i suoi arti a toccare le pareti del cilindro. Se il mouse genera i suoi arti sopra il livello più volte continuamente senza atterraggio, devono essere considerato solo come una volta.
3. aperto campo di prova
- Eseguire il test di campo aperto 24 h dopo la somministrazione di MPTP.
Nota: Può essere portato allo stesso tempo al test del cilindro. - Preparare una scatola di reazione trasparente campo aperto (45 cm L x 45 cm W x 25 cm H) con coperchio di legno nella parte inferiore da un panno nero. Difficoltà una macchina fotografica (> 1 milione-pixel di risoluzione) sopra il campo ad un'altezza di 1 m.
Nota: Il colore di fondo di campo aperto scatola dovrebbe essere diverso dal colore del mouse testati per garantire il contrasto dei colori nel video. - Regolare la fotocamera per assicurarsi che la casella di reazione di campo aperto è proprio nel centro del video.
- Mettere una prova mouse nella casella e lasciare che il mouse familiarizzarsi con l'ambiente per circa 1 min.
- Registrare un video di 5 minuti utilizzando la fotocamera collegata al computer.
- Analizzare il video utilizzando strumenti software (ad es., MATLAB) per ottenere la cifra di traccia di movimento, la distribuzione di elettricità statica (velocità < 1 cm/s), a piedi (velocità 1-20 cm/s) e l'esecuzione (velocità > 20 cm/s) del tempo, il totale viaggiato distanza e media velocità del mouse ogni testata.
Nota: Quando si analizza il video, seguiamo tutto il corpo del mouse. La velocità media di un corpo significa la lunghezza totale del percorso coperto, diviso per il tempo trascorso. Pertanto, se un mouse non si muove, la velocità istantanea sarebbe considerato come zero. - Pulire qualsiasi feci nella finestra di reazione campo aperto. Spruzzare etanolo al 70% sulla scatola e pulirlo.
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Risultati
In al test del cilindro, la diminuzione delle parti posteriori contro il muro è stata osservata nei topi (gruppo 2) trattati con MPTP dal giorno 1 al giorno 7 e salino il giorno 8 rispetto ai topi trattati con soluzione fisiologica (gruppo 1), mentre un aumento di parti posteriori è stato osservato nei topi (gruppo 3) trattati con MP TP dal giorno 1 al giorno 7 e l-dopa il giorno 8 rispetto ai topi (gruppo 2) curati con MPTP dal giorno 1 al giorno 7 e Salina il giorno 8 (
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Discussione
A causa della distruzione dei neuroni dopaminergici nella substantia nigra del cervello, MPTP causa Parkinson-come i sintomi in topi7. L-dopa è il farmaco più preferito per PD fin dal suo uso clinico, perché aiuta a mantenere normali attività quotidiane in pazienti con PD, con efficace soppressione delle anomalie del motore quali acinesia e rigidità15. I topi trattati con MPTP ha mostrato i danni nei test comportamentali come cilindro test e test di campo aperto, che potreb...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Il nostro lavoro è finanziato da Tianjin Undergraduate programmi di formazione per l'innovazione e l'imprenditorialità (Grant No. 63183004). Questo progetto è stato avviato in stato chiave laboratorio di medicinali chimica biologia all'Università di Nankai. Gli autori dichiarano che non esistano conflitti di interessi.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 70% Etanolo | Ruiboxing Company | RBX-64175 | |
| Fotocamera | BASLER | acA645-100gm | |
| Test del cilindro | Realizzato internamente presso l'Università di Nankai | N/A | |
| Excel | Microsoft | N/A | |
| Levodopa | Sigma-Aldrich | 72816 | |
| Matalb 2017a | Mathworks | N/A | |
| Topi Istituto di Zoologia, Accademia Cinese delle Scienze | Balb/c | Topi femmina adulta (10 settimane) | |
| MPTP | Yuanye Biological Technology Company Ltd., Shanghai | S31504-500mg | |
| Test in campo aperto | Realizzato internamente presso l'Università di Nankai | N/A | |
| Siringa | Solelybio | S-xsgwz-w | Siringa per irrigazione |
| Jiangxi Fenglin Medical Applicazione Co. | hc3824 | Iniezione intraperitoneale |
Riferimenti
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