Descriviamo un metodo di utilizzo polyethyleneimine (PEI)-rivestito di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico per macrofagi trasfezione con siRNA. Queste nanoparticelle è in grado di fornire in modo efficiente siRNA di espressione del gene bersaglio macrofagi in vitro e in vivo e silenzio.
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Articolo metodologico
Nanoparticelle di ossido di ferro rivestite con Polyethyleneimine come un veicolo per la consegna di piccolo RNA interferente ai macrofagi In Vitro e In Vivo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
A causa del loro ruolo critico nella regolazione della risposta immunitaria, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca e rappresentano un promettente bersaglio terapeutico in molti disturbi, quali malattie autoimmuni, aterosclerosi e cancro. Silenziamento genico RNAi-mediata è un valido approccio di scelta per sonda e modificare la funzione del macrofago; Tuttavia, la transfezione di macrofagi con siRNA è spesso considerata di essere tecnicamente impegnativo e, attualmente, sono disponibili alcune metodologie dedicati al trasferimento siRNA ai macrofagi. Qui, presentiamo un protocollo di utilizzo di nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico rivestite con polyethyleneimine (PEI-SPIONs) come veicolo per la somministrazione mirata di siRNA di macrofagi. PEI-SPIONs sono capaci di legare e di condensazione completamente siRNA quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiunge 4 e sopra. In vitro, queste nanoparticelle possono fornire in modo efficiente siRNA in macrofagi primari, così come nella linea cellulare del 264,7 macrofago-come, senza compromettere la vitalità cellulare presso la dose ottimale per la transfezione, e, in definitiva, essi inducono destinazione di siRNA-mediata del silenziamento genico. Oltre ad essere usato per trasfezione con siRNA in vitro , PEI-SPIONs sono anche uno strumento promettente per la consegna di siRNA a macrofagi in vivo. In considerazione di sue caratteristiche unite di proprietà magnetiche e capacità di silenziamento genico, sistematicamente amministrati PEI-SPION/siRNA particelle dovrebbero non solo di modulare la funzione dei macrofagi, ma anche per attivare i macrofagi a essere imaged e tracciati. In sostanza, PEI-SPIONs rappresentano una piattaforma nonviral semplice, sicura ed efficace per la consegna di siRNA ai macrofagi sia in vitro che in vivo.
Introduzione
I macrofagi sono un tipo di cellule immuni innate distribuiti in tutti i tessuti del corpo, anche se in quantità diverse. Producendo una varietà di citochine e altri mediatori, giocano ruoli critici nella difesa ospite contro l'invasione di microrganismi patogeni, nella riparazione del tessuto dopo la lesione e nel mantenimento di omeostasi del tessuto1. A causa della loro importanza, i macrofagi sono stati continuamente oggetto di intensa ricerca. Tuttavia, nonostante la sua prevalenza negli studi di funzione e regolazione genica, silenziamento genico siRNA-mediata è meno probabilità di riuscire a macrofagi perché queste cellule — in particola....
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Protocollo
Tutti i metodi che coinvolgono animali vivi sono stati eseguiti in conformità con l'animale con cautela e linee guida di Southeast University, Cina.
1. preparazione del PEI-SPIONs
-
Preparazione dell'acido oleico-modificato SPIONs
- Sciogliere FeCl3•6H2O e FeSO4•7H2, O nell'acqua sotto la protezione di N2.
- Aggiungere 28 g di FeCl3•6H2O e 20 g di FeSO4•7H2O in 80 mL di acqua deionizzata in un becher. Introdurre l'acqua attraverso una condotta di vetro N2 e mescolare fino a sciolta la materia ....
- Sciogliere FeCl3•6H2O e FeSO4•7H2, O nell'acqua sotto la protezione di N2.
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Risultati
La dimensione e la zeta potenziale di PEI-SPIONs preparato con questo protocollo sono stati nella gamma di 29-48 nm (indice di polidispersione: 0.12 - 0.23) e 30-48 mV, rispettivamente. Erano stabili in acqua a 4 ° C per oltre 12 mesi senza aggregazione ovvio. Per valutare la loro capacità di associazione di siRNA, PEI-SPIONs sono stati mescolati con siRNA a vari rapporti di peso Fe: siRNA. La figura 1 Mostra che quando il rapporto di peso di Fe: siRNA raggiu.......
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Discussione
I macrofagi sono refrattari a transfect da approcci nonviral comunemente utilizzati, quali l'elettroporazione, liposomi cationici e specie del lipido. Qui abbiamo descritto un metodo affidabile ed efficiente per transfect macrofagi con siRNA. Utilizzando il presente protocollo, oltre 90% di macrofago-come 264.7 celle grezze (Figura 2B) e macrofagi peritoneali di ratto18 può essere trasfettate con siRNA senza significativa compromissione dell'attuabilità delle cellule........
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal National Natural Science Foundation of China (81772308) e nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina (n. 2017YFA0205502).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | C11995500BT | caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso |
| Siero fetale bovino | Gibco | A31608-02 | |
| Penicillina/streptomicina (1,5 ml) | Gibco | 15140122 | |
| Kit di test MTS a base di tetrazolio | Promega | G3582 | Per l'analisi della citotossicità |
| Linea cellulare RAW 264.7 | Banca cellulare dell'Accademia cinese delle scienze, Shanghai, Cina | TCM13 | |
| (6 pozzetti) | Corning | 3516 | |
| Piastre per coltura tissutale (10 cm) | Corning | 430167 | |
| Provette prive di RNasi (1,5 ml) | AXYGEN | MCT-150-C | |
| Provette da centrifuga (15 ml) | Corning | 430791 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | |
| Wistar ratti | Shanghai Experimental Animal Center of Chinese Academy of Scienze | ||
| Bacillus Calmette– Gué rin polvere liofilizzata | National Institutes for Food and Drug Control, Cina | per indurre l'artrite adiuvante nei ratti | |
| siRNA | GenePharma (Shanghai, Cina) | ||
| Cy3-siRNA | RiboBio (Guangzhou, Cina) | ||
| Polietilenimmina (10 kDa) | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Acqua di ammoniaca | Aladdin Reagente chimico Co., Ltd. | ||
| oleico | Aladdin reagente chimico Co., Ltd. | ||
| Dimetilsolfossido | Aladino Reagente Chimico Co., Ltd. | ||
| FeSO4&toro; 7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10012118 | |
| FeCl3• 6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10011918 | |
| Acido dimercaptosuccinico | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| provetta per ultrafiltrazione | Millipore | UFC910096 | |
| soluzione di idrossido di tetrametilammonio | Aladdin Chemical Reagent Co., Ltd. | ||
| Analizzatore di dimensioni delle particelle e potenziale zeta | Malvern, Inghilterra | Nano ZS90 |
Riferimenti
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nature Reviews Immunology. 11 (11), 723(2011).
- Maeß, M. B., Wittig, B., Lorkowski, S. Highly efficient transfection of human THP-1 macrophages by nucleofection.
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Ristampe e permessi
