Qui presentiamo un protocollo per studiare l'effetto di annullamento dei geni legati al gustazione sulle risposte immunitarie in un sodio del solfato del dextrano (DSS)-infiammatorie intestinali (IBD) la malattia del mouse modello indotto.
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Articolo metodologico
Effetti del gusto segnalazione proteina Abolishment su infiammazione dell'intestino in un modello murino di malattia infiammatoria intestinale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattia infiammatoria intestinale (IBD) è uno dei disturbi gastrointestinali immuno-correlati, tra cui la colite ulcerosa e morbo di Crohn, che incide sulla qualità di vita di milioni di persone in tutto il mondo. IBD sintomi includono dolore addominale, diarrea e sanguinamento rettale, che possono derivare da interazioni tra microbiota dell'intestino, componenti alimentari, cellule epiteliali intestinali e le cellule immunitarie. È di particolare importanza per valutare come ogni gene chiave espressa in cellule epiteliali ed immune intestinale colpisce l'infiammazione del colon. Recettori del gusto accoppiati a proteine G, tra cui G proteina subunità α-gustducin e altre proteine di segnalazione, sono stati trovati nell'intestino. Qui, usiamo α-gustducin come rappresentante e descrivere un sodio del solfato del dextrano (DSS)-modello IBD per valutare l'effetto delle mutazioni del gene gustativo su immunità mucosa dell'intestino e infiammazione indotto. Questo metodo combina la tecnologia di knockout del gene con il modello IBD chimicamente indotto e quindi può essere applicato per valutare l'esito della nullificazione gene gustativo come pure altri geni che possono exuberate o smorzare la risposta immunitaria indotta da DSS nel colon. Topi mutanti vengono somministrati con DSS per un certo periodo durante il quale loro peso corporeo, sgabello e sanguinamento rettale sono monitorati e registrati. Presso diversi punti temporali durante l'amministrazione, alcuni topi sono euthanized, quindi le dimensioni e i pesi dei loro milze e i due punti sono misurati e tessuti dell'intestino sono raccolti e trattati per istologico e analisi dell'espressione genica. I dati mostrano che i risultati di knockout di α-gustducin in eccessiva perdita di peso, diarrea, sanguinamento intestinale, danno tissutale e topi infiammazione vs wild-type. Poiché la gravità dell'infiammazione indotta è influenzata da diversi ceppi di topi, habitat e dieta, ottimizzazione della durata di concentrazione e amministrazione di DSS in un esperimento pilota è particolarmente importante. Regolando questi fattori, questo metodo può essere applicato per valutare sia gli effetti anti - e pro-infiammatorie.
Introduzione
Le due forme principali di malattia infiammatoria intestinale (IBD), morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) sono caratterizzate da condizioni infiammatorie croniche remittente o progressive dell'intestino con eziologia multifattoriale1,2 . Lo sviluppo delle IBD dipende dalla genetici, nonché determinati fattori ambientali quali dieta, uso di antibiotici e soprattutto, infezioni da patogeni. Tuttavia, l'eziologia e la regolamentazione dei meccanismi molecolari implicati IBD sono ancora poco chiari. Da qui, numerosi modelli animali chimicamente indotte di IBD sono stati costruiti e applicati per delineare la....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti coinvolgenti topi sono stati esaminati e approvati dal istituzionale Animal Care e comitati di uso dell'Università di Zhejiang. Si consiglia di indossare adeguati dispositivi di protezione personali prima di eseguire questo protocollo.
1. preparazione di topi e DSS
- Tenere i topi knockout (α-gustducin- / -) ed età - sesso- e controllo di selvaggio-tipo di pari peso di corpo (α-gustducin+ +) topi C57BL/6 singolarmente in gabbie pulite.
Nota: I topi knockout sono stati backcrossed con topi C57BL/6 per più di 20 generazioni e hanno uno sfondo di genetica C57BL/6 di 100% quasi. - S....
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Risultati
È stata stabilita una procedura IBD DSS indotta attraverso la somministrazione di 3% DSS in acqua potabile per α-gustducin-knockout (KO) e topi wild-type (WT). Rispetto ai topi WT, i topi knockout ha esibito più grave colite con eccessiva perdita di peso, diarrea e sanguinamento intestinale (Figura 1). Dopo una somministrazione di DSS di 7 giorni, le differenze nell'integrità del tessuto sono state analizzate usando la macchiatura di H & E come il metodo .......
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Discussione
Questo metodo può essere impiegato per quantità determinare l'effetto delle mutazioni di specifici geni gustativi su infiammazione in un modello murino IBD indotta da DSS. Per sfruttare al meglio, induzione ottimale di IBD è un passo fondamentale. Lo sviluppo di colite è influenzato da diversi fattori, tra cui topo, housing ambiente, microflora intestinale, così come i geni di interesse. Si consiglia di eseguire un esperimento pilota con un piccolo numero di topi per testare diversi dosaggi e durate di amministrazione DS.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Ringraziamenti
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni da parte del National Natural Sciences Foundation of China (81671016, 31471008 e 31661143030) e il National Institutes of Health (DC010012, DC015819) e dalla Fondazione Siyuan.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Anticorpo | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| < forte>Reagente | |||
| destrano solfato sale di sodio (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| complesso streptavidina-HRP | BD Pharmingen | 551011 | |
| H& Kit di colorazione | BBI Life Sciences | E607318 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master (ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Trascrittasi inversa, GPR | Clontech, TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Kit universale per l'estrazione dell'RNA... | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 mL Siringa | BD Biosciences | 309604 | |
| Strumenti e attrezzature | |||
| balance | |||
| forbici | |||
| centrifuga | |||
| qPCR macchina | |||
| colorazione barattoli | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Cibernetica dei media, Inc. |
Riferimenti
- Kaser, A., Zeissig, S., Blumberg, R. S. Inflammatory Bowel Disease. Annual Review of Immunology. 28 (1), 573-621 (2010).
- Benoit, C., D, A. J., Madhu, M., Matam, V. K. Dextran Sulfate Sodium (DSS)-Induced Colitis in Mice. Current Protocols in Immunology. 104 (1), 11-14 (2014).
- Chassaing, B., Darfeuille-Michaud, A.
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Ristampe e permessi
