Fluorescente macchiatura d'argento delle proteine nel gel di poliacrilammide

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo dettagliato che delinea una fluorescente nuova tecnica per la rilevazione di proteine totali in gel di poliacrilammide di pittura. Il protocollo utilizza una sonda d'argento dello ione specifico fluorescenza accensione, rileva Ag⁺-complessi della proteina ed Elimina alcune limitazioni dei tradizionali cromogeniche macchie d'argento.

Abstract

Macchiatura d'argento è una tecnica colorimetrica ampiamente utilizzata per visualizzare le bande proteiche in gel di poliacrilammide dopo elettroforesi del gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide (SDS-PAGE). Le macchie d'argento classiche hanno alcuni inconvenienti, come alta priorità bassa che macchia, recupero di proteina povera, scarsa riproducibilità, una gamma dinamica lineare stretta per la quantificazione e la limitata compatibilità con spettrometria di massa (MS). Ora, con l'uso di una sonda di fluorogenic Ag⁺ , TPE-4TA, abbiamo sviluppato un fluorescente argento che macchia il metodo per la visualizzazione di proteine totali in gel di poliacrilammide. Questa nuova macchia evita il passaggio di riduzione d'argento fastidioso in tradizionali macchie d'argento. Inoltre, la macchia d'argento fluorescente dimostra buona riproducibilità, sensibilità e quantificazione lineare nella rilevazione della proteina, rendendolo una macchia di gel di proteina utile e pratico.

Introduzione

Molti metodi di colorazione sono state usate per visualizzare proteine elettroforesi su gel in seguito, ad esempio utilizzando coloranti colorimetrici come Coomassie Brilliant Blue, macchia d'argento, fluorescenza, o radioattivo etichettatura^{1,2, 3 , 4}. macchiatura d'argento è considerata una delle tecniche più sensibili per la rilevazione di proteine che richiedono reagenti semplici ed economici. Possono essere classificato in due famiglie principali: la macchia d'argento ammoniacale e il nitrato d'argento macchia^5,6. Nel metodo d'argento ammoniacale alcalino, il complesso di argento-diammina è prodotta con idrossido di sodio e ammoniaca e ridotto ad argento metallico durante lo sviluppo utilizzando una soluzione di formaldeide acide. La macchia può ospitare in modo efficiente per proteine basiche ma mostra una prestazione compromessa per le proteine acide e neutre ed è, inoltre, limitata ai sistemi elettroforetiche della taurina e glicina classica. In confronto, le macchie di nitrato d'argento sfruttano l'alta bio-affinità degli ioni d'argento per proteine, principalmente la solfidrilico e carbossilico gruppi da catene laterali e tendono a macchiare le proteine acide in modo più efficiente⁷. Dopo agli ioni d'argento vincolante, una soluzione in via di sviluppo (in genere in una soluzione di carbonato di metallo contenente formaldeide e sodio tiosolfato) viene applicata per ridurre gli ioni d'argento a grani d'argento metallici, che costruire un colore marrone-scuro per visualizzare la fasce della proteina.

Sebbene macchiatura d'argento è stato ben nota per la sua versatilità e l'alta sensibilità dal suo sviluppo nel 1970s⁸, il metodo è spesso considerato come difficile. Metodi di colorazione argento hanno passaggi di tempo-limitato e mostrano scarsa riproducibilità. Poiché il colore della macchia d'argento non è solitamente uniforme e dipende il passo di riduzione, che è difficile da controllare, la macchia d'argento non è un metodo quantitativo e, quindi, non raccomandato per gel confronto studio e proteina quantificazione⁹. Metodi ottimizzati nella sensibilità possono utilizzare aldeidi che possono anche fornire un aspetto più uniforme colorazione¹⁰. Tuttavia, questo è a scapito di ulteriore analisi a valle a causa la reticolazione delle proteine di aldeidi. Protocolli di veloce principalmente combinano o accorciano alla seguente procedura per ridurre il tempo di compromettere la riproducibilità e l'uniformità della macchia⁵. Di conseguenza, ci sono numerosi argento colorazione varianti all'interno di gel di proteina che macchia, ciascuno ottimizzato per soddisfare determinati requisiti; ad esempio, semplicità, sensibilità o peptide tasso di recupero per analisi a valle. Questi attributi possono anche avere un impatto su ogni altro, e soddisfare tutte le esigenze in un protocollo può essere difficile.

In questo lavoro, vi presentiamo un nuovo fluorescente argento che macchia il metodo per la rilevazione di proteine nel gel di poliacrilammide. In questo metodo, utilizziamo una sonda fluorogenic per ioni d'argento, TPE-4TA (Figura 1), per visualizzare le proteine impregnato di argento¹¹. TPE-4TA è stato progettato dal principio di emissione indotta da aggregazione (AIE). È non-emissivo quando disciolto in soluzione acquosa, ma è altamente emissivo in presenza di ioni d'argento. Sostituendo lo sviluppo cromogeno in tradizionali macchie d'argento con un fluorogenic sviluppando passo, il metodo d'argento fluorescente consente la macchiatura robusta delle proteine totali con uno sfondo ridotto.

Inoltre, la macchia d'argento fluorescente ha mostrato una buona gamma dinamica lineare per quantificazione della proteina, che è paragonabile con la macchia di SYPRO Ruby ampiamente utilizzato e non ottenibile con le macchie d'argento tradizionale. Il gel può essere ripreso il gel comunemente utilizzati sistemi di documentazione con lampada a raggi ultravioletti (lunghezza d'onda di eccitazione: canale di 302/365 nm; emissione: ~ 490-530 nm) presso molti laboratori biologici.

Protocollo

1. preparazione del Gel

Nota: La dimostrazione segue un protocollo standard per preparare il gel per la colorazione poco dopo SDS-PAGE¹². In breve, i passaggi seguenti descrivono la preparazione dei campioni e l'elettroforesi del gel.

1. Eseguire SDS-PAGE con gel di proteina 4% - 12% Bis-Tris (1 mm, 15-bene) usando un carro armato del gel mini riempiti di 2-(N -morfolino) buffer di ethanesulfonic acido (MES).
2. Diluire i campioni con una miscela di acqua distillata, litio dodecil solfato (LDS) buffer e un agente di riduzione del campione.
3. Caricare la prima corsia con il doppio della quantità di stock (10 µ l), seguita dalla normale quantità di stock (5 µ l) e una serie di diluizioni dello stock da allora in poi (13 diluizioni, 2 x a 8192 x).
4. Esegua il gel a una tensione costante di 200 V per 30 min.

2. fissazione del Gel

1. Dopo l'elettroforesi, immergere il gel in una soluzione di 100 mL di acido acetico al 40% ethanol/10% su agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente 2 x (ogni 30 min), o durante la notte a 4 ° C.
2. Lavare il gel 3 x 10 min ciascuno in acqua ultrapura in un recipiente pulito. La fase di lavaggio è critica. Se l'acido dalla soluzione di fissaggio non viene rimosso correttamente nel passaggio fluorogenici in via di sviluppo, l' eccessiva TPE-4TA verrà attivato dall'acido e portare alla fluorescenza di fondo forte nel gel.

3. preparazione dell'AgNO₃soluzione e impregnazione d'argento del Gel

1. Per rendere la soluzione di₃ di AgNO (0,0001%) per l'impregnazione, in primo luogo, sciogliere 0,01 g di AgNO₃ in 10 mL di acqua ultrapura per preparare una soluzione stock di AgNO₃ 0,1%. Successivamente, aggiungere 100 µ l di soluzione madre₃ AgNO 0.1% in 100 mL di acqua ultrapura per rendere la soluzione di lavoro.
   Nota: La soluzione di AgNO₃ deve essere conservata al buio prima dell'uso.
2. Impregnare il gel con 100 mL di soluzione per 1 h di lavoro su agitatore orbitale a 50 rpm in un contenitore di vetro sigillato di argento. È fondamentale effettuare l'impregnazione d'argento sotto cappa aspirante, protetta dalla luce con carta stagnola.
3. Lavare il gel con acqua ultrapura (circa 100 mL) in un contenitore pulito per 2 x 60 s.

4. Fluorogenic sviluppo del Gel

1. Per preparare la soluzione di riserva di tintura (0,1 mM), è necessario aggiungere 3,0 mg della tintura TPE-4TA in 50 mL di acqua ultrapura. Sonicare la soluzione per qualche minuto e aggiungere qualche soluzione di NaOH (ad esempio 1 M) per aiutare a sciogliere il colorante.
2. Controllare la fluorescenza della soluzione sotto una lampada di 365 nm UV per garantire che la molecola di colorante è completamente dissolto. Solo soluzioni deboli o nonemissive indicano la completa dissoluzione.
   Nota: La tintura che TPE-4TA è stato sintetizzato seguendo il protocollo recentemente segnalato da Xie et al. ¹⁰ la soluzione TPE-4TA è molto stabile e può essere tenuta all'oscuro per mesi.
3. Per preparare 100 mL di soluzione di sviluppo fluorogenic (10 µM), aggiungere 10 mL della soluzione madre TPE-4TA in 90 mL di acqua ultrapura. Controllare il pH della soluzione utilizzando un pH-metro e sintonizzare per 7-9 usando una soluzione di idrossido di sodio (1 µM).
4. Trasferire il gel in un contenitore pulito e sigillabile con 100 mL di soluzione di sviluppo fluorogenic. Assicurarsi che il gel è totalmente immerso nella soluzione. Sigillare il contenitore. Coprire dalla luce e scuoterlo durante la notte in un agitatore orbitale a 50 giri/min a temperatura ambiente. In alternativa, la fase di incubazione può anche essere ridotto a circa ~ 2 h di preriscaldamento la soluzione di sviluppo AIE a 80 ° C per la colorazione e poi lasciarlo a temperatura ambiente.

5. decolorante e Imaging

1. Trasferire il gel in un contenitore pulito e decolorare esso in 100 mL di etanolo al 10% per 30 min.
   Nota: Acqua da solo può essere usata per lavare il gel. Tuttavia, è più tempo-efficiente di utilizzare una soluzione di etanolo di 10% per la decolorazione. Questo vi aiuterà a ridurre il processo di decolorante da ore a 30 min.
2. Risciacquare il gel in acqua ultrapura per 5 min.
3. Immagine del gel presso il canale di nm 365 o 302 nm da una macchina di documentazione del gel.

Risultati

Le bande proteiche macchiate dalla macchia d'argento fluorescente presentano una fluorescenza verde intensa sotto una lampada a UV 365 nm. Tutte le bande di proteina 14 (10-200 kDa), da cima a fondo, erano chiaramente visibili, che correlano bene con 14 quelli colore rosso macchiati dalla SYPRO Ruby tintura (Figura 2)¹⁰.

Per quanto riguarda la rilevazione quantitativa della p...

Discussione

Presentato qui è un romanzo fluorescente argento che macchia il metodo per le proteine nel gel di poliacrilammide. Questa strategia integra le macchie d'argento convenzionale e la colorazione fluorescente. Le gesta di colorazione il legame selettivo di ioni d'argento per proteine come in altri argento macchie ma impiega un argento altamente sensibile fluorogenic sonda TPE-4TA per illuminare le proteine rilegate d'argento. Poiché la sonda fluorogenic TPE-4TA può percepire gli ioni d'argen...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
LDS Sample Buffer (4X)	Thermo Fisher Scientific	NP0007	Reagente
4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 pozzetti	Thermo Fisher Scientific	NP0323BOX	campione in gel prefabbricato
(10X)	Thermo Fisher Scientific	NP0004	Reagente
MES SDS Running Buffer (20X)	Thermo Fisher Scientific	NP0002	Reagente
Mini Gel Tank	Thermo Fisher Scientific	A25977	Attrezzatura
Alimentatore 300W (230 VAC)	Thermo Fisher Scientific	PS0301
Attrezzatura Scala di proteine non colorate	Thermo Fisher Scientific	26614	Campione
Nitrato d'argento	Sigma-Aldrich	31630-25G-R	Reagente
Etanolo	Bragg e co.	42520J	Reagente
Acido acetico	J.T. Baker	103201A	Reagente
Sintesi Milli-Q A10	Merk-Fornisce		18,2 MΩ. sistema di documentazione su gel d'acqua cm
(modello c600)	Azure biosystems-Equipment

Agente riducente del