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Articolo metodologico

Immunoprecipitazione della cromatina del tessuto adiposo marrone murino

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DOI:

10.3791/58682

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21 novembre 2018

 ,  ,  , 
1Biochemistry Department, Boston University School of Medicine, 2Bioinformatic Hub, Boston University

In questo articolo

Sommario

Qui descriviamo un protocollo per immunoprecipitazione efficiente della cromatina (ChIP) seguito da sequenziamento del DNA di alto-rendimento (ChIP-seq) del tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Questo protocollo è adatto sia per mappatura modificazioni istoniche e indagando genoma localizzazione delle proteine non istoniche di interesse in vivo.

Abstract

Processi più cellulari sono regolati dalla modulazione trascrizionale dei programmi di gene specifico. Tale modulazione è raggiunto attraverso l'azione combinata di una vasta gamma di fattori di trascrizione (TFs) e cofattori che mediano l'attivazione trascrizionale o repressione attraverso cambiamenti nella struttura della cromatina. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare utili per la mappatura modificazioni istoniche e profilatura di fattori di trascrizione/cofattori vincolante al DNA, fornendo così un'istantanea dei cambiamenti nucleari dinamiche che si verificano durante diversi processi biologici.

Per studiare la regolazione trascrizionale nel tessuto adiposo, campioni provenienti da colture di cellule in vitro di immortalato o linee cellulari primarie sono spesso favorite nelle analisi di ChIP per l'abbondanza di materiale di partenza e ridotta variabilità biologica. Tuttavia, questi modelli rappresentano un'istantanea limitata dello stato effettivo della cromatina negli organismi viventi. Così, c'è un bisogno fondamentale per protocolli ottimizzati eseguire ChIP su campioni di tessuto adiposo derivati da modelli animali.

Qui descriviamo un protocollo per efficiente ChIP-seq di modificazioni istoniche e di proteine non istoniche in tessuto adiposo marrone (pipistrello) isolato da un mouse. Il protocollo è ottimizzato per lo studio di genoma la localizzazione delle proteine di interesse e marcatori epigenetici nel pipistrello, che è un tessuto morfologicamente e fisiologicamente distinti tra i depositi di grasso.

Introduzione

Mentre il tessuto adiposo bianco (WAT) è specializzato per accumulo di energia, il tessuto adiposo bruno (BAT) dissipa energia sotto forma di calore grazie alla sua capacità di convertire carboidrati e lipidi in energia termica tramite disgiungente mitocondriale1. A causa di questa funzione specializzata, il deposito BAT è necessario per il mantenimento della temperatura corporea in condizioni fisiologiche e in risposta all'esposizione fredda. Mentre i cambiamenti di espressione genica durante il differenziamento BAT e termogenico a stress sono stati studiati estesamente in vitro ed in vivo, i meccanismi molecolari alla base di questi cambiamenti sono stati principalmente dissecato in linee cellulari immortalizzate e primario pre-adipociti, con l'eccezione di diversi studi in vivo2,3,4,5.

Regolazione dei programmi di espressione genica specifica attraverso regolazione trascrizionale è ottenuta dai coordinati cambiamenti nella cromatina struttura tramite trascrizione vari fattori e co-fattori azioni. Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un approccio di biologia molecolare prezioso per indagare il reclutamento di questi fattori per DNA e per profilare i cambiamenti collegati nel paesaggio della cromatina. Fattori chiave per il successo degli esperimenti di ChIP includono ottimizzazioni delle condizioni di reticolazione e cromatina tosatura uniformità tra i diversi campioni, disponibilità del materiale di partenza adeguato e, soprattutto, qualità degli anticorpi. Durante l'esecuzione di ChIP da tessuti tutta, è anche importante considerare la eterogeneità dei campioni e ottimizzare il protocollo per migliorare l'efficienza dell'isolamento di nuclei, con quest'ultimo essendo un passo particolarmente sensibile quando si lavora con il tessuto adiposo dovuto il contenuto di lipidi elevati. In realtà, tecniche di isolamento molecolare da depositi adiposi intero sono complicati dalla presenza di alti livelli di trigliceridi e protocolli devono essere ottimizzati per aumentare la quantità di isolamento della cromatina. Infine, quando sequenziamento ad alte prestazioni viene eseguita dopo l'isolamento di DNA-ChIP, la profondità di sequenziamento è fondamentale per determinare il numero di picchi che vengono rilevati con fiducia.

Qui, ci riferiamo agli standard di lavoro e linee guida generali per gli esperimenti di ChIP-seq consigliati da ENCODE e modENCODE consorzi6 per best practices, e ci concentriamo su una descrizione dettagliata di un protocollo ottimizzato per ChIP-seq da BAT. Il protocollo descritto permette di eseguire il sequenziamento del genoma per fattori DNA-binding con picchi ben definiti, nonché marchi di istone con segnali più diffusi per efficiente isolamento della cromatina dal tessuto adiposo.

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Protocollo

La procedura di gestione degli animali del protocollo è stata approvata dalla Boston University istituzionale Animal Care ed uso Committee (IACUC).

1. giorno 1: Dissezione e preparazione di pipistrello per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP)

  1. Eutanasia di topi utilizzando una camera di anidride carbonica (CO2) ed eseguire la dissezione immediatamente in seguito. Spruzzo del mouse pelliccia con etanolo al 70% prima incisione. Posizionare il mouse con la schiena rivolta verso l'alto, quindi tagliare aperto la pelle lungo il collo. Individuare il pipistrello direttamente sotto la pelle tra le spalle (interscapolare; appare come due lobi, a forma di farfalla, con un sottile strato di grasso bianco che deve essere accuratamente rimosso7).
    Nota: Per un mouse di C57BL/6J mesi 3 è alimentato una dieta regolare chow (peso del mouse a questo range di età compresa tra 27 e 30 g), ogni lobo BAT è lunga circa 1 cm. Il peso totale del deposito BAT è circa 0,15 g nei topi maschi e femminili.
  2. Utilizzare 1 BAT pad per 3 circuiti integrati. Più pastiglie BAT possono essere elaborate contemporaneamente fino a sonicazione.
  3. Crosslink ogni BAT pad in 10 mL di tampone fosfato salino (PBS) contenente 1% di formaldeide per 15 min a 150 giri/min a temperatura ambiente (TA) girevole.
  4. Placare la reticolazione con l'aggiunta di 2,5 M glicina ad una concentrazione finale di 125 mM per 5 min, rotante a 150 rpm a TA.
  5. Trasferire il pad BAT a 500 µ l di tampone di Lisi ipotonica (10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PMSF) e aggiungere 2 perle di acciaio inox (dimensioni: diametro di 3,2 mm, Vedi Tabella materiali) per ciascun pad BAT. Utilizzare un omogeneizzatore del branello-basata del tessuto (Vedi Tabella materiali) per distruggere il tessuto.
  6. Iniziare con 5 min alla massima potenza. Se necessario, estendere il tempo fino a quando il tessuto è omogeneizzato e singole cellule sono separate. Trasferire i campioni in una nuova provetta e centrifugare a 4 ° C a 16.000 x g per 10 min.
  7. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta e tenere il pellet cellulare sul ghiaccio. Centrifugare il supernatante a 4 ° C a 16.000 x g per 10 min prevenire la perdita di cellule di galleggiamento. Scartare il surnatante finale e risospendere entrambi pellet cellulare insieme a 300 µ l di tampone di lisi di SDS (SDS 1%; EDTA 10 mM; PH Tris-HCl 8, 50 mM) con 1 x inibitore della proteasi (Vedi Tabella materiali). Incubare in ghiaccio per 10 min.
  8. Sonicare i lisati per generare DNA frammenti 200 – 500 paia di basi. Dopo sonicazione, rimuovere detriti mediante centrifugazione per 10 min a 16.000 x g a 4 ° C e verificare il successo di sonicazione tramite l'elettroforesi del DNA su gel di agarosio 1%. Per un gel di medie dimensioni, eseguito a 120 V; una buona separazione è raggiunto dopo 45 min.
    Nota: Ottimizzazione di sonicazione può essere necessaria per ottenere la corretta dimensione dei frammenti. Con il sonicatore selezionato (Vedi Tabella materiali), ciò richiede 2 volte a 320 W potenza di uscita e frequenza di 20 KHz per 10 min, utilizzando cicli di 30 s 30/s off.
  9. Diluire il surnatante 10 volte (volume finale è di 3 mL per ciascun pad BAT) in tampone di diluizione dei ChIP (SDS 0,01%; Triton 1,1%; EDTA 1.2 mM; Tris-HCl pH 8, 16,7 mM; NaCl 167 mM) con 1 x inibitore della proteasi. Tenere da parte 1% di questa soluzione di cromatina (pari a 30 µ l per 3 mL) come l'input di ChIP. Mantenere gli ingressi durante la notte a 4 ° C (fino al punto 2.4).
    Nota: La frazione di cui sopra fornirà il riferimento in ingresso per quantificazione relativa del materiale immunoprecipitati rispetto alla quantità di DNA presente in ciascun campione prima di immunoprecipitazione.
  10. Aggiungere l'anticorpo di ChIP (Vedi Tabella materiali per gli anticorpi utilizzati qui come esempio) a 1 mL di soluzione di cromatina e incubare per una notte a 4 ° C con rotazione. Eseguire parallelo immunoprecipitazione con corrispondente pre-immunitario IgG, se disponibile, o IgG normale della stessa specie (ad es., regolare coniglio IgG se l'anticorpo è prodotta in un coniglio). In alternativa, salvare 1 mL di soluzione di cromatina per un controllo no-anticorpo.
    Nota: La quantità ottimale di anticorpo dovrebbe essere determinata sperimentalmente per ogni nuovo anticorpo, se la concentrazione di anticorpi non è noto. In caso contrario, 2-5 µ g di anticorpo è una quantità ragionevole di partenza da utilizzare. Utilizzare anticorpi ChIP-grado quando possibile, o anticorpi che sono stati convalidati per immunoprecipitazione.

2. giorno 2: Raccolta dei complessi immuni

  1. Aggiungere 50 µ l di proteina A agarosio 50% dei residui per i complessi immuni e incubare per 1 h a 4 ° C con rotazione a 150 giri/min.
  2. Pellet i branelli di centrifugazione per 1 min a 100 x g a 4 ° C. Eseguire lavaggi sequenziale delle perline con buffer di crescente rigore.
    1. In primo luogo, lavare con tampone di lavaggio di basso contenuto di sale (150 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2 mM; Triton-X 1%; SDS 0.1%), poi con tampone di lavaggio del alto-sale (500 mM NaCl; Tris-HCl pH 8, 20 mM; EDTA 2mm, Triton-X1%; SDS 0.1%), poi con LiCl lavaggio (0,25 M LiCl; Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA 1 mM; Igepal 1%; deoxicholate 1%) e infine con 1 x TE (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA).
    2. Eseguire tutti i lavaggi su colonne di 0,45 µm PVDF filtro centrifugo (Tabella materiali) trasferendo prima le perle nelle colonne utilizzando 500 µ l di tampone di lavaggio di basso contenuto di sale. A pellet le perle nelle colonne per 3 min a 2.500 x g. Scartare il flusso continuo e ripetere 1 volta per tutti i buffer di lavaggio elencati al punto 2.2.1.
  3. Dopo i lavaggi sono stati completati, eluire i complessi immuni con l'aggiunta di 300 µ l di eluizione buffer 1% SDS, 0.1 M NaHCO3) ai talloni pellettati nelle colonne. Incubare per 30 minuti su un agitatore a 400 giri/min a RT. Raccogliere l'eluato di rotazione verso il basso le colonne per 3 min a 2.500 x g in una nuova provetta.
  4. Invertire le reticolazioni incubando l'eluato e ingressi raccolti nel passaggio da 1,9 a 65 ° C durante la notte.

3. giorno 3: Recupero di DNA con fenolo/cloroformio estrazione

  1. Aggiungere 300 µ l di fenolo: cloroformio: IAA, 1:1 per gli ingressi e l'eluato. Vortexare per 10 s.
  2. Rotazione a 4 ° C per 15 min a 21.000 x g. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. 3 µ l di glicogeno, 30 µ l di acetato di sodio 3 M e 750 µ l di etanolo freddo 100%. Vortexare per 10 s. Conservare a-80 ° C per 2 h.
  3. Rotazione verso il basso a 21.000 x g a 4 ° C per 20 min, tenere il pellet e scartare il surnatante. Pellet di lavare con 1 mL di freddo 70% EtOH, poi con lo spin down a 21.000 x g a 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante e asciugare all'aria il pellet.
  4. Risospendere il pellet in 70 µ l di acqua priva di dnasi.
  5. Procedere al passaggio 4 per il testing occupazione della cromatina su specifiche regioni genomiche da reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) o al passaggio 5 per preparare i campioni per la sequenziazione.

4. analisi di ChIP utilizzando qPCR (Single/Multiple la lettura dei geni)

  1. Diluire l'ingresso del DNA dal passaggio 3.4 per generare una curva standard di riferimento. Diluizioni seriali 1/10, 1/100 e 1/1000 sono in genere sufficienti per catturare la gamma lineare, ma ulteriori diluizioni possono essere richiesti per campioni più concentrati.
  2. Per ogni coppia di primer (qui, abbiamo usato primer promotori NDUFV1 e TOMM20 di targeting), preparare due serie di reazioni di qPCR: uno utilizzando i campioni diluiti inpui dal punto 4.1 e un secondo con i campioni di DNA isolati da immunoprecipitazione da punto 3.4. Eseguire ogni reazione in triplice copia.
    Nota: Le reazioni possono essere impostare in parallelo per geni multipli utilizzando piastre da 96 o 384 pozzetti.
  3. Impostare un volume di reazione di 10 μL per pozzetto con 5 μL di 2 x PCR mix (Tabella materiali), 1 µ l di primer mix (1 μM primer forward e reverse primer 1 μM) e 4 μL di DNA da ChIP (o il controllo di input).
  4. Brevemente rotazione verso il basso la piastra.
  5. Eseguire le reazioni di qPCR su un sistema PCR in tempo reale utilizzando il protocollo consigliato dal produttore per il rilevamento di reagente (Tabella materiali). Qui abbiamo utilizzato le seguenti condizioni: 1) 1s a 95 ° C per 1 ciclo; 2) 1 s a 95 ° C seguita da 20 s a 60 ° C per 45 cicli; 3) 15 s a 95 ° C seguita da 60 s a 60 ° C seguita da 15 s a 95 ° C per 1 ciclo.
    Nota: Verifica della curva di dissociazione: la presenza di un picco nella trama dissociazione termica suggerisce un amplicone singolo viene generato dalla reazione di PCR. Se viene visualizzato più di un picco, questo è potenzialmente indicativo di multipli, non specifici ampliconi; nel qual caso, si consiglia il design di coppie di primer alternativi.
  6. Determinare la fase lineare dell'amplificazione esponenziale della reazione di PCR per ogni set calcolando la curva standard utilizzando la serie di DNA genomic diluito nel passaggio 4.1 di primer. in base al valore di Ct (ciclo soglia).
  7. Se il valore di Ct del DNA da ChIP e controllo di input è all'interno del valore di gamma lineare di Ct, è possibile calcolare l'arricchimento del DNA da ChIP rispetto l'ingresso, secondo il fattore di diluizione del DNA da ChIP e controllo di input al punto 4.1.

5. l'amplificazione del DNA da ChIP per High-throughput sequenziamento (Genome-wide lettura)

Nota: Questo passaggio possa essere esternalizzato in un impianto di nucleo accademico o società commerciale sequenziamento quando le funzionalità di ordinamento non sono disponibili in azienda.

  1. Preparare una libreria di DNA dal DNA estratto con un'adeguata preparazione libreria ChIP kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore.
  2. La libreria su un sistema di sequenziamento ad alte prestazioni, utilizzando 50 bp single-end come lettura di sequenza (Vedi Tabella materiali).
    Nota: Secondo le linee guida di ChIP-seq suggerite da ENCODE6, un minimo di 10 milioni di letture è consigliato per i genomi dei mammiferi.

6. analisi dei dati raw

  1. Eseguire il controllo di qualità il sequenziamento crudo letture utilizzando FastQC8.
    Nota: Metriche di qualità di sequenziamento comuni includono per qualità di sequenze di base, al contenuto di sequenze di base, al contenuto sequenza GC, lunghezza della sequenza e livelli di duplicazione di sequenza. In genere, un punteggio di qualità di lettura di Q > 30 in ogni posizione di base è indicativo di risultati di sequenziamento di alta qualità. La distribuzione di contenuti di GC attraverso tutte le letture dovrebbe essere all'incirca simile una distribuzione normale, con un picco centrato intorno percentuale contenuto GC genomica della specie effettiva.
  2. Rimuovere qualsiasi contaminazione adattatore di sequenziamento e letture di bassa qualità attraverso la lettura di rifilatura utilità Trimmomatic9.
    Nota: Specificano i parametri di default implementata la rimozione delle schede dipendente dalla piattaforma, rimozione delle basi di bassa qualità iniziali e finali e l'uso di una finestra scorrevole largo 4-base per profili legge quando la qualità media a base scende sotto una determinata soglia.
  3. Allineare trasformate letture per il genoma di riferimento del mouse MM1010 con l' allineatore Bowtie211 utilizzando i parametri predefiniti.
  4. Filtro allineate letture rimuovendo quelli con una qualità di mappatura Bowtie2 Punteggio ottenuto (MAPQ) di meno di 10 con Samtools12.
  5. Determinare vari parametri di post-allineamento qualità come percentuale letture mappate, strand cross-correlazione, cumulativo letto copertura e campione di replicare riproducibilità.
    Nota: Vari pacchetti tra cui SPP13, ChIPqc14e Deeptools15 sono disponibili per calcolare queste metriche di qualità.
  6. Eseguire analisi chiamata di picco con un controllo di input o esempio KO appropriato utilizzando l' algoritmo (MACS2) Mac16 con i parametri predefiniti.
  7. Rimuovere eventuali picchi chiamati che si sovrappongono con regioni nella lista nera note17 dall'annotazione di mm10 utilizzando Bedtools18.
    Nota: Aree incluse nella lista nera sono aree nel genoma che sono stati indicati per avere segnale alto o lettura conta indipendente di linea cellulare o tecnica di sequenziamento. Queste regioni visualizzare segnali artefatto artificialmente elevati in alcune regioni del genoma che possono essere filtrati fuori esperimenti di sequenziamento genomico funzionale. Tutte le repliche devono essere elaborate in modo indipendente attraverso la pipeline e quindi possono essere utilizzate per il tasso di scoperta di irriproducibilità (IDR). IDR è impiegato per misurare la riproducibilità dei risultati tra replicati attraverso il metodo, come descritto da Li, Brown, Huang e Bickel19,20. Il metodo IDR quantitativamente valuta la coerenza tra repliche ed è consigliato da ENCODE e modENCODE come parte dei loro orientamenti di ChIP-seq.
  8. Utilizzare picchi statisticamente significativi per varie analisi a valle come gene ontology21,22, arricchimento o motivo analisi23.

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Risultati

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Figura 1: convalida di ChIP di qPCR. Analisi di chIP-qPCR di rappresentante GPS2 geni NDUFV1 (a sinistra) e TOMM20 (a destra) dell'obiettivo nel pipistrello di topi WT e GPS2-AKO, mostrando variazioni relative del livello di metilazione di H3K9 e GPS2 e Pol2 vincolante. I grafici a barre rappresentano la media del campione di 3 replicati con * p < 0.05 e * * p < 0.0...

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Discussione

Il protocollo descritto qui rappresenta un prezioso strumento per l'esecuzione di ChIP da tessuti murini, specificamente ottimizzati per tessuto adiposo marrone. Una delle maggiori sfide nell'esecuzione di ChIP da tessuto sta riprendendo un numero sufficiente di cellule durante la preparazione del campione. Taglio del blocco utilizzando un frullatore omogeneizzatore del tessuto accoppiato con perline in acciaio inox anziché un pestello di vetro canonico significativamente riduce il numero di cellule perdita a causa del t...

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Omogeneizzatore tissutale Bullet Blender Prossima avventura BBX24
Perline in acciaio inossidabile 3,2 mm di diametroNext Advence SSB32
Bioruptor SonicatorDiagenode
1.5 mL Micro Provetta TPX Plastica DiagenodeC30010010-5
Inibitore completo della proteasiRoche
Proteina A Impasto di agarosioInvitrogen 
Anticorpo GPS2In housePoliclonale di coniglio, anticorpo Ct (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Anticorpo Pol2 DiagenodeC15100055 l'anticorpo
h3K9me3Millipore 05-1242
Fast Syber Green Master MixAplied Biosytem 4385612
ViiA7Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Kit di preparazione libreriaIllumina IP-202-1012
HiSeq 2000 Illumina 
11836145001101041

Riferimenti

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