Method Article

Registrazioni simultanee di potenziali di campo locale corticale ed Electrocorticograms in risposta a stimoli nocicettivi Laser da liberi di muoversi

DOI:

10.3791/58686

⸱

January 7th, 2019

 ,  ,  ,  , 
1CAS Key Laboratory of Mental Health, Institute of Psychology, 2Department of Psychology, University of Chinese Academy of Sciences, 3Research Center of Brain Cognitive Neuroscience, Liaoning Normal University, 4Neuroscience Research Institute, Peking University, 5Department of Neurobiology, School of Basic Medical Sciences, Peking University, 6Key Laboratory for Neuroscience, Ministry of Education/National Health and Family Planning Commission, Peking University, 7Department of Pain Management, State Key Clinical Specialty in Pain Medicine, Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato una tecnica che registra simultaneamente sia electrocorticography e potenziali di campo locale in risposta a stimoli nocicettivi laser da liberi di muoversi. Questa tecnica aiuta a stabilire un rapporto diretto di electrocortical segnali a livello macroscopico e mesoscopiche che facilita l'indagine nocicettive di elaborazione delle informazioni nel cervello.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Electrocortical risposte, indotte da impulsi di calore laser che attivano selettivamente terminazioni nervose gratis nocicettivo, sono ampiamente utilizzate in molti studi animali ed umani per indagare l'elaborazione corticale dell'informazione nocicettiva. Questi potenziali cerebrali evocati laser (LEPs) consistono di parecchie risposte transitorie che sono tempo-bloccata per l'insorgenza di stimoli laser. Tuttavia, le proprietà funzionali delle risposte LEP sono ancora in gran parte sconosciute, a causa della mancanza di una tecnica di campionamento che può registrare simultaneamente attività neurali alla superficie della corteccia (cioè, electrocorticogram [ECoG] e cuoio capelluto elettroencefalogramma [cuoio capelluto EEG]) e all'interno del cervello (cioè, potenziali di campo locale [LFP]). Per risolvere questo problema, vi presentiamo qui un protocollo animale utilizzando ratti liberamente commoventi. Questo protocollo è composto di tre procedure principali: (1) animale preparazione e procedure chirurgiche, (2) una registrazione simultanea di ECoG e LFP in risposta a stimoli nocicettivi laser, (3) estrazione dei dati e analisi e funzionalità. In particolare, con l'aiuto di un guscio protettivo 3D-stampato, sia ECoG e LFP elettrodi impiantati sul cranio del ratto erano saldamente tenuti insieme. Durante la raccolta dati, impulsi laser sono stati trasportati sulle zampe anteriori del ratto attraverso lacune nella parte inferiore della camera quando l'animale era in quiete spontaneo. Rumore bianco in corso è stato interpretato per evitare l'attivazione del sistema uditivo dagli ultrasuoni generati dal laser. Di conseguenza, solo risposte nocicettive selettivamente sono state registrate. Utilizzando le procedure analitiche standard (ad es., filtro passa-banda, estrazione di epoca e correzione della linea di base) per estrarre le risposte correlate a stimolo del cervello, abbiamo ottenuto risultati che sono stati LEPs con un elevato rapporto segnale-rumore contemporaneamente registrate dagli elettrodi ECoG e LFP. Questa metodologia permette la registrazione simultanea delle attività ECoG e LFP, che fornisce un ponte di segnali electrocortical, a livello macroscopico e mesoscopica, facilitando in tal modo l'indagine di elaborazione dell'informazione nocicettiva nel cervello.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

EEG è una tecnica per registrare i potenziali elettrici e attività oscillatoria cervello generate dalle attività sincronizzata di migliaia di neuroni nel cervello. Esso è comunemente usato in molti studi di base e applicazioni cliniche1,2. Per esempio, risposte EEG a laser intenso calore impulsi (cioè, LEPs) sono ampiamente adottato per studiare l'elaborazione periferico e centro di input nocicettivo sensoriale3,4,5. In esseri umani, LEPs consistono principalmente di tre deviazioni distinti: il componente in anticipo (N1) che è la maniera organizzata e in grado di riflettere l'attività della corteccia somatosensoriale primaria (S1)6e gli elementi tardi (N2 e P2) che occupano una posizione centrale distribuita e più probabile riflettere l'attività della corteccia somatosensoriale secondaria, insula e corteccia anteriore del cingulate7,8. In precedenti studi9,10, abbiamo dimostrato che ratto LEPs, campionato utilizzando ECoG (un tipo di EEG intracranico) da elettrodi posizionati direttamente sulla superficie esposta del cervello, anche costituite da tre distinti deviazioni ( cioè, somatotopically organizzato N1 e N2 distribuito centralmente e P2). La polarità, l'ordine e topografia dei componenti LEP ratto sono simili a umano LEPs11. Tuttavia, a causa della limitata risoluzione spaziale del cuoio capelluto EEG e subdurale ECoG registrazioni12, nonché la natura imprecisa del EEG fonte analisi tecniche13, il contributo dettagliato delle attività neurale ai componenti LEP è molto dibattuta. Ad esempio, è poco chiaro se e nella misura in cui contribuisce alla prima parte della risposta corticale (N1) suscitata da laser stimoli6S1.

Diverso dalla tecnica di registrazione presso il macroscopico recordings intracranica livello, diretto mediante matrici microwire aiutate da un apparato di stereotassiche e Microdrive14,15 potrebbe misurare attività neurali (ad es., LFPs ) di regioni specifiche. LFPs riflettono principalmente la sommatoria dei potenziali postsinaptici eccitatori o inibitori delle locali popolazioni neuronali16. Poiché l'attività neurale LFP-campionati riflette processi neuronali che si verificano all'interno di centinaia di micrometri intorno all'elettrodo di registrazione, questa tecnica di registrazione è ampiamente usata per analizzare le informazioni di elaborazione nel cervello a livello mesoscopico. Tuttavia, solo si concentra su precisi cambiamenti locali di attività del cervello e non può rispondere alla domanda di come sono integrati i segnali provenienti da più regioni (ad esempio, come componenti di LEP sono integrati alle regioni multiple del cervello).

Vale la pena notare che la registrazione simultanea di un ECoG e corticale LFPs da liberi di muoversi potrebbe facilitare l'indagine corticali di elaborazione delle informazioni a livello macroscopico e mesoscopico livelli. Inoltre, questa metodologia fornisce un'eccellente opportunità per indagare la misura in cui l'attività neurale delle regioni del cervello predefiniti contribuiscono ai LEPs. Infatti, parecchi studi precedenti hanno valutato la coerenza fra i punti, corticale LFP, ECoG segnali e17,18 e ha dimostrato che il LFP19,20 adiacente all'elettrodo EEG contribuisce per il Formazione di risposte cerebrali correlate a stimolo. Tuttavia, la tecnica esistente viene solitamente utilizzata per registrare le risposte del cervello da animali anestetizzati a causa della mancanza di un guscio protettivo per impedire gli elettrodi di essere danneggiata dalla collisione. In altre parole, manca ancora la tecnica che potrebbe costruire il ponte di electrocortical segnali a livello macroscopico (EEG ed ECoG) in e mesoscopica (corticale LFP) liberi di muoversi.

Per risolvere questo problema, abbiamo sviluppato una tecnica che potrebbe registrare un ECoG e LFPs corticale in regioni multiple del cervello simultaneamente da liberi di muoversi. Questa tecnica aiuta a stabilire il rapporto diretto dei segnali electrocortical, a livello macroscopico e mesoscopica, facilitando così l'inchiesta nocicettive di elaborazione delle informazioni nel cervello.

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Protocol

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Nell'esperimento sono stati utilizzati ratti Sprague-Dawley maschio adulto (400-450 g di peso). Tutte le procedure chirurgiche e sperimentale seguito la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. Le procedure sono state approvate dal comitato etico di ricerca presso l'Istituto di psicologia, Accademia cinese delle scienze.

1. l'impianto di elettrodi

  1. Anestetizzare il ratto in una camera con 5% isoflurane e una portata di 1 L/min prima della chirurgia.
  2. Utilizzando un'apparecchiatura stereotassica, fissare la testa del ratto con il relativo naso inserito nella maschera anestetica. Amministrare isoflurano tramite la maschera anestetica ad una concentrazione del 2% con un tasso di flusso di aria di 0,5 L/min per mantenere la profondità anestetica durante l'intervento chirurgico. Si noti che la tolleranza chirurgica è raggiunto quando il topo non riesce a rispondere a punta-pizzicamento.
  3. Applicare unguento oftalmico agli occhi per evitare la disidratazione corneale.
  4. Radere la parte superiore del cuoio capelluto ratto utilizzando un rasoio standard.
  5. Sterilizzare il cuoio capelluto con l'alcool medico iodophor disinfettante soluzione e 75% per rimuovere lo iodio.
  6. Iniettare lidocaina (2%) nel cuoio capelluto per analgesia locale. Somministrare atropina (0,2 mL i.p.) per inibire l'ipersecrezione delle vie respiratorie.
  7. Fare un'incisione mediana di circa 2-3 cm sul cuoio capelluto usando un bisturi. Tagliare e rimuovere parte del cuoio capelluto lungo la linea mediana ed esporre il cranio. Utilizzare il electrocoagulator per fermare l'emorragia, quando necessario.
  8. Contrassegnare le posizioni degli elettrodi ECoG basati sulle coordinate stereotassiche predefinite (disposto in base alla posizione di Bregma) e le posizioni degli elettrodi di riferimento e terra sulla linea mediana (posizionata 2 e 4 mm caudalmente a Lambda, rispettivamente).
  9. Praticare fori (diametro: 0,5 mm) per le viti di ECoG, utilizzando un trapano elettrico cranico sul cranio presso i siti segnalati, senza distruggere la dura madre.
  10. Avvitare una vite in acciaio inox (diametro esterno: 0,6 mm), che collega il filo di rame rivestite con isolamento, nel foro di circa 1 mm di profondità senza penetrare il dura sottostante. Queste viti fungono da ECoG, riferimento e gli elettrodi a terra durante l'esperimento.
  11. Posto un guscio protettivo base sul cranio. Fissare la base con le relative viti adiacenti sul cranio usando l'acrilico dentale. Utilizzare cotone medica che potrebbe essere rimosso in seguito per proteggere l'area che è destinato a essere utilizzato per l'impianto del filo di profondità da essere coperto.
    Nota: Il guscio protettivo è un prodotto appositamente polilattico 3D-stampato, che consiste di tre parti: una base, un muro e un berretto. La parete è rivestita di rame conicità per costruire come una gabbia di Faraday.
  12. Contrassegnare le posizioni degli elettrodi filo profondità basati sulle coordinate stereotassiche predefinite.
  13. Piccoli fori (diametro: 0.2 mm) sul cranio intorno ai siti segnalati per l'impianto del filo e rimuovere con cautela il lembo osseo per esporre la dura madre. Lavare il craniotomy frequentemente, con normale soluzione salina. Figura 1 descrive la messa a punto prima dell'impianto degli elettrodi filo profondità.
  14. Utilizzando un ago, sollevare e tagliare il dura senza danneggiare la superficie della neocorteccia, vasi e la pia madre.
  15. Abbassare gli elettrodi filo profondità alla superficie della neocorteccia e, poi, lentamente penetrare il cervello fino alla profondità di destinazione. Si fermano spesso in movimento verso il basso gli elettrodi corticali e resilienza. Nello studio presente, la profondità della punta del filo è 0,5 mm sotto la superficie corticale.
  16. Sigillare il craniotomy con una miscela di olio di paraffina e cera per assicurarsi che gli elettrodi del legare di profondità possono essere spostati per successive manipolazioni sperimentali.
  17. Difficoltà apparato elettrodo usando l'acrilico dentale sul cranio.
  18. Saldare ogni filo di rame che collega alla vite ECoG al canale corrispondente sul modulo connettore. Coprire i punti di saldatura usando l'argilla per evitare il contatto con potenziale tra i diversi canali.
  19. Montare la parete di guscio protettivo alla base e saldare gli elettrodi di riferimento e terra ai canali corrispondenti.
  20. Fissare la calotta per il guscio protettivo utilizzano i nastri per evitare la contaminazione.
  21. Iniettare il ratto con penicillina (60.000 U, i.p.) immediatamente dopo l'intervento chirurgico per prevenire le infezioni postsurgical.
  22. Singole case il ratto in una temperatura e umidità controllata della gabbia e tenerlo in un ciclo giorno/notte di 12 h dopo l'intervento chirurgico, con cibo e acqua ad libitum per almeno una settimana prima dell'esperimento LEP.
    Nota: Per registrare simultaneamente ECoG e corticale LFP attività, un apparecchio è stato utilizzato qui che è stato assemblato con due tipi di elettrodi collegati a un modulo connettore, che conteneva diverse microdrives allegato per le matrici di filo di tungsteno. I pin dorati sono stati utilizzati per collegare i fili di tungsteno alla scheda di interfaccia di elettrodo (BEI) del modulo connettore premendo i fili in metallo piccoli fori alla BEI. Due fori in metallo alla BEI sono stati saldati con fili di rame rivestiti e l'estremità aperta di ogni filo di rame è stato saldato con il filo di rame corrispondente collegato alla vite di ECoG. I dettagli di fabbricazione sono stati descritti altrove21.

2. raccolta dei dati

  1. Solleticare il ratto almeno 1 volta al giorno per tre o più giorni consecutivi prima dell'esperimento per garantire che il topo diventa familiare con sperimentatore22.
  2. Posizionare il ratto nel comportamento di misurazione per almeno 1 h prima dell'esperimento per garantire che il ratto ambiento la registrazione all'ambiente circostante.
    Nota: La camera è un cubo di plastica con una lunghezza laterale di 30 cm. Il fondo della camera è costituito da un'inferriata in ferro con lacune ~ 8 mm.
  3. Collegare l'headstage di registrazione con il modulo elettrodo delicatamente, per evitare di spaventare il ratto e danneggiare la centralina dell'elettrodo.
  4. Impostare il generatore laser, collegare la fibra ottica e regolare la dimensione di punto del laser secondo il manuale d'uso di attrezzature. Collegare l'uscita digitale dal generatore trigger alla porta di ingresso digitale della scheda di registrazione.
    Nota: fare attenzione non per arricciare la fibra ottica eccessivamente per evitare di rompere la fibra. Prima della registrazione, assicurarsi che i segnali di trigger vengono visualizzati e registrati dal software di registrazione. In questo protocollo, calore stimoli generati da un infrarosso al neodimio ittrio alluminio perovskite (Nd: YAP) laser con lunghezza d'onda di 1,34 μm. Il diametro della dimensione dello spot laser è impostato a circa 5 mm da lenti messa a fuoco. Un laser He-Ne ha sottolineato l'area stimolata, che è definita in funzione dell'obiettivo dell'esperimento. Inoltre, l'energia di stimolo degli impulsi laser è determinato secondo il disegno sperimentale. La durata dell'impulso laser è di 4 ms.
  5. Impostare la videocamera sotto l'angolo della camera sperimentale per registrare continuamente i comportamenti nocicettivi del ratto quando la zampa riceve stimoli nocicettivi laser. Regolare la posizione e la direzione della fotocamera per assicurarsi che i comportamenti nocicettivi sono completamente registrati in tutto l'esperimento.
    Nota: Una macchina fotografica ad alta velocità charge coupled device (CCD) è altamente raccomandata, come può trasportare i segnali operativi per la scheda principale del sistema di registrazione per registrare il tempo di inizio e la durata del comportamento nocicettivo precisamente. Nocicettivi comportamenti saranno valutati dallo sperimentatore dopo ogni stimolo laser, secondo criteri definiti in precedenza basati sul movimento degli animali23,24, come segue: nessun movimento (Punteggio = 0), far girare la testa (tra cui agitazione o elevando la testa; Punteggio = 1), flinching (vale a dire, un piccolo corpo brusco movimento di strappi; Punteggio = 2), ritiro (cioè, zampa retrazione dallo stimolo laser; Punteggio = 3), leccare e al corpo intero movimento (Punteggio = 4).
  6. Consegnare in corso rumore bianco (50 dB SPL) tramite un altoparlante nella parte superiore della camera.
    Nota: Come indicato in precedenti studi10,25, stimolazione del laser consegnata sulla pelle genera ultrasuoni che possono essere rilevati dal sistema uditivo del ratto. Per questo motivo, in corso di rumore bianco è giocato durante l'esperimento per evitare l'attivazione del sistema uditivo in risposta agli ultrasuoni generati dal laser. Questa procedura permette la registrazione selettiva delle risposte del cervello legate all'attivazione del sistema nocicettivo.
  7. Raccogliere i dati elettrofisiologici da sia l'ECoG e gli elettrodi di profondità filo, usando il sistema di registrazione secondo il manuale d'uso di attrezzature.
    Nota: I segnali operativi della fotocamera e il grilletto segnali degli impulsi laser vengono campionati simultaneamente con i dati elettrofisiologici allo stesso frequenza di campionamento (tutti i dati vengono amplificati e digitalizzati utilizzando una frequenza di campionamento di 20.000 Hz), che assicura che tutti i dati sono sincronizzati a tempo.
  8. Consegnare gli impulsi laser per il plantare della zampa del ratto attraverso le lacune nella parte inferiore della camera.
    Nota: Lo stimolo laser viene recapitato solo quando il ratto è quiete spontaneo per più di 2 s basata sull'osservazione dello sperimentatore, per ridurre al minimo la contaminazione di segnale degli artefatti legati al movimento. Per evitare affaticamento dei nocicettori o sensibilizzazione, la destinazione del fascio laser viene spostata manualmente dopo ogni stimolo, e l'intervallo di interstimulus non è mai inferiore a 40 s. ECoG e LFP segnali possono essere registrati più volte da ogni ratto. Il ratto ha bisogno di essere messo in camera sperimentale 1 h prima di ogni sessione di registrazione. Dopo tutto le sessioni di registrazione, il ratto era anestetizzato ed irrorato via con soluzione salina tampone fosfato ghiacciata seguita da paraformaldeide al 4%. Il cervello è stato rimosso dal cranio e sezionato per identificare le posizioni degli elettrodi.

3. analisi dei dati

  1. Filtrare i dati continui con un filtro passa-banda tra 1 e 30 Hz.
  2. Epoca i dati utilizzando una finestra di analisi di 3 s, estesa da 1 s prima a 2 s dopo l'inizio di stimoli laser. Correzione della linea di base viene eseguita sottraendo l'ampiezza media entro l'intervallo di prestimulus.
  3. Manualmente e rifiutare le epoche che sono contaminate dai manufatti lordi.
  4. Calcolare le forme d'onda media di LEP che sono tempo-bloccata per l'insorgenza di stimoli laser per ogni condizione sperimentale.
  5. Calcolare che la coerenza di trasformazione wavelet (WTC) di forme d'onda LEP registrato da ECoGs e profondità filo elettrodi.
    Nota: WTC è una tecnica per eseguire la coerenza tra coppie di elettrodi in funzione del tempo e frequenza. Il WTC tra due segnali può essere calcolato per qualsiasi punto di tempo-frequenza, che ha il vantaggio di generare valori di coerenza per l'intero spettro di tempo-frequenza. I dettagli della metodologia sono stati descritti altrove26.

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Results

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Nell'esperimento rappresentativo, sono stati registrati i dati elettrofisiologici da cinque ratti. Gli stimoli del laser sono stati consegnati per la zampa anteriore destra di ogni ratto per 20 volte con > 40 intervalli di interstimulus s. Il cervello di laser-ha evocato le risposte sono state registrate utilizzando sia ECoG viti e fili di profondità e i fili di profondità sono stati impiantati nelle cortecce somatosensoriale primarie bilaterale (S1) e cortecce di motore primarie (M1)....

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Discussion

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Nello studio presente, abbiamo descritto una tecnica per registrare contemporaneamente ECoGs e risposte corticali LFP ha suscitate da stimoli nocicettivi laser da liberi di muoversi. I risultati hanno mostrato che le risposte LEP potrebbero essere rilevate chiaramente dopo l'insorgenza di stimoli laser in segnali ECoG sia LFP. La registrazione simultanea di ECoG e corticale LFP segnali consentirà agli scienziati di valutare la loro associazione per meglio comprendere il contributo delle attività di un neurone per i compo...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da CAS Key Laboratory of Mental Health, Istituto di psicologia, Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31671141 e 31822025), il 13th piano quinquennale informatizzazione dell'Accademia cinese delle scienze (XXH13506), e il progetto fondamento scientifico dell'Istituto di psicologia, Accademia cinese delle scienze (Y6CX021008).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Ratti maschi di Sprague-DrawleyVital River
IsofluranoRWD Scienze della
Sistema di anestesia con isoflurano per piccoli animaliRWD ScienzeCompresa la maschera antigas per anestesia per ratti
Apparecchio stereotassicoRWD Scienze
L'apparecchio con elettrodicombinati ECoG e LFPL'apparecchio è fatto in casa, che assembla gli elettrodi ECoG e a filo di profondità in un guscio
protettivo stampato in 3DLa trama del guscio è polilattica e il guscio è fatto in casa e contiene tre parti: una base, una parete e un tappo. La parete è coperta da coni di rame per costruire come una gabbia di Faraday fili di
tungsteno (diametro: 50 mm)California Fine Wires CompanyGli elettrodi per la registrazione corticale LFP
  Viti in acciaio inossidabile
(diametro: 0,6 mm)		Gli elettrodi per la registrazione ECoG
Trapano cranico elettricoRWD Life Science
  Punta da trapano (diametro: 0,5 mm)RWD Life ScienceIl trapano viene utilizzato per praticare i fori delle viti ECoG
  Punta da trapano (diametro: 0,2 mm)RWD Life ScienceIl trapano viene utilizzato per praticare i fori dei fili di profondità 
Polvere arilica dentaleSNC dentale dentale
arilicoSNC dentale
ScientificLa miscela viene utilizzata per sigillare la craniotomia per garantire il seguente movimento di array di microfili
Olio mineraleFisher Scientific
Elettrocoagulatore Bovie medical Corporation
RHD2132 Schede di amplificazione Intan Technologiesheadstage a 32 canali
Intan TechnologiesIl sistema di acquisizione dati
Generatore laser a infrarossi al neodimio ittrio e alluminio perovskite (Nd:YAP) Ingegneria
Matlab R2016bThe MathWorks 
vita della vita della vita del modulo connettore liquido Paraffina Fisher Un sistema di RHD2000 elettronica

References

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