RNA-ha basato riprogrammazione dei fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte

Sommario

Qui descriviamo un metodo clinicamente rilevante, ad alta efficienza e privo di alimentatore per riprogrammare i fibroblasti primari umani in cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando modificate mRNA che codificano per fattori di riprogrammazione e maturo microRNA-367/302 imita. Sono inoltre inclusi metodi per valutare l'efficienza di riprogrammazione, espandere le colonie clonali iPSC e confermare l'espressione del marcatore pluripotenza TRA-1-60.

Abstract

Cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) hanno dimostrato di essere uno strumento prezioso per studiare la malattia e lo sviluppo umano. Ulteriore avanzando iPSCs come un rigeneratore terapeutico richiede un sicuro, robusto e opportuno protocollo di riprogrammazione. Qui, presentiamo un protocollo clinicamente rilevante, passo-passo per la riprogrammazione di fibroblasti cutanei umani estremamente ad alta efficienza in iPSCs utilizzando un approccio non-integrazione. Il nucleo del protocollo consiste di esprimere fattori di pluripotenza (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A, NANOG, OCT4-MyoD fusione) da in vitro RNA messaggero trascritto sintetizzato con modificato nucleotidi (mRNAs modificate). Il riprogrammazione mRNAs modificate transfected in fibroblasti primari ogni 48 h insieme maturo imita di microRNA-367/302 specifico delle cellule staminali embrionali per due settimane. Le colonie di iPSC risultante possono essere isolate e ampliate direttamente in condizioni prive di alimentatore. Per massimizzare l'efficienza e la coerenza del nostro protocollo di riprogrammazione attraverso campioni del fibroblasto, abbiamo ottimizzato i vari parametri tra cui il regime di transfezione di RNA, tempi di transfezioni, condizioni di coltura e densità di semina. D'importanza, il nostro metodo genera alta qualità iPSCs da più fonti del fibroblasto, compresi i campioni di difficile riprogrammare malati, invecchiati, e/o senescenti.

Introduzione

Riprogrammare le cellule somatiche in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) richiede espressione estesa di un insieme di fattori di trascrizione che sono importanti nel mantenimento della pluripotenza^1,2. Quando si producono iPSCs per applicazioni cliniche, è essenziale che il carico mutazionale nelle celle di input è ridotta a icona durante l'elaborazione e l'efficienza della generazione di iPSC è mantenuta ad un livello relativamente elevato attraverso campioni di pazienti. Tuttavia, la maggior parte della riprogrammazione metodi, inclusi i protocolli di integrazione-libero, soffre molto minor efficienza riprogramma, quale limite di utilità clinica di questi si avvicina a³. La bassa efficienza di riprogrammazione può anche promuovere riprogrammazione selettiva delle cellule portatrici di mutazioni di preesistenza, aumentando il carico mutazionale in iPSCs risultante. Inoltre, tutti i metodi riprogrammazione basati sul DNA, come lentivirus ed episomal-approcci, soffrono il problema di sicurezza che DNA in modo casuale può integrare nel genoma e creare l'opportunità per mutagenesi inserzionale nociva e indesiderati ( potenzialmente oncogeno) espressione di geni di pluripotenza in tessuto a valle derivati⁴.

Un promettente approccio per raggiungere induzione efficiente della pluripotenza in cellule somatiche e ridurre carico mutazionale in iPSCs risultante consiste nell'utilizzare sintetici con un massimo di RNA messaggeri contenenti modificati basi azotate (modificate mRNA) per la riprogrammazione⁵. L'efficacia di approcci riprogrammazione mRNA modificati può essere ulteriormente migliorata con l'aggiunta di cellule staminali embrionali (ESC)-specifici microRNA (Mirna)-367/302s³, che sono stati indicati per riprogrammare le cellule somatiche con maggiore efficienza^{6 ,7}. Tuttavia, anche con l'aggiunta di Mirna-367/302, l'approccio di riprogrammazione basato su mRNA modificata spesso non riesce durante l'applicazione di recente isolate cellule paziente³. Incoerenze di indirizzo di questo approccio basato su mRNA modificato, recentemente abbiamo segnalato una strategia ottimizzata, privo di integrazione che utilizza entrambe modificate mRNA che codifica e induce la pluripotenza in fibroblasti umani primari con un alto tasso di successo riprogrammazione di fattori e maturo miRNA-367/302 imita⁸. Nel nostro metodo, la riprogrammazione mRNA modificate cocktail include una versione modificata di OCT4 fusa con il MyoD transactivation dominio (chiamato M₃O)⁹ e cinque altri fattori riprogrammazione (SOX2, KLF4, cMYC, LIN28A e NANOG). Combinando la modificate mRNA codificanti i fattori di pluripotenza con il miRNA imita è sembrato avere un effetto sinergico sulla riprogrammazione efficienze in questo protocollo. Ulteriori ottimizzazioni del regime di transfezione di RNA, cellule semina e coltura condizioni anche erano necessarie per aumentare l'efficienza di riprogrammazione dell'approccio ad un ultra-alto livello⁸.

A differenza di molti altri protocolli, il nostro approccio riprogrammazione richiede in genere solo pochi mille input fibroblasti. Inoltre, molti non-integrazione di strategie comuni utilizzando plasmidi episomal, Sendai virus, o RNA autoreplicante coinvolgono vasto passaggio per diluire il vettore di riprogrammazione in iPSCs generato. Al contrario, modificate mRNA e miRNA maturo Mimi hanno una breve emivita e vengono rapidamente eliminati dalle cellule. Presi insieme, la quantità di tempo della coltura cellulare cumulativo tra la raccolta di campioni dei pazienti e la generazione di iPSCs utilizzabile è minima in questo approccio, un'efficace limitazione accumulo di mutazione in iPSCs risultante e incrementare l'economicità.

Qui, presentiamo il protocollo dettagliato passo-passo per ottenere alta efficienza riprogrammazione dei fibroblasti umani adulti in iPSCs utilizzando il nostro approccio basato su mRNA/miRNA modificato combinatoria⁸. Questo protocollo di riprogrammazione RNA-ha basato fornisce un metodo semplice, conveniente e affidabile per la generazione di iPSCs privo di integrazione per ricerca e potenziali applicazioni cliniche. Inoltre, è applicabile per la riprogrammazione di una varietà di linee di fibroblasti compreso difficile a riprogrammare, malattia-collegati, fibroblasti senescenti e invecchiati. Un disegno schematico del protocollo per la riprogrammazione di fibroblasti umani è illustrato nella Figura 1. Il protocollo descrive in modo specifico un metodo per la riprogrammazione di tre pozzi di fibroblasti primari adulti umani in un piatto formato da 6 pozzetti. Due pozzi in genere producono un numero sufficiente di colonie di iPSC di alta qualità. In molti casi, unico bene è necessario, e il terzo bene può essere utilizzato per l'analisi dell'efficienza di riprogrammazione. Se richiesto, il numero di pozzetti può essere scalato.

Protocollo

Lavorare in condizioni di RNAsi-libera e utilizzare tecniche asettiche quando possibile. Effettuare tutte le manipolazioni di legate alla cultura delle cellule in un armadietto utilizzando tecniche asettiche di sicurezza biologica. Seguire le norme di biosicurezza istituzionale per il lavoro con le cellule umane.

1. reagenti e attrezzature per la preparazione di riprogrammazione iniziazione

1. Preparare i fattori riprogrammazione codifica cocktail di mRNA per volta.
   1. Seguire il protocollo precedentemente pubblicato¹⁰ per eseguire la trascrizione in vitro , tappatura e defosforilazione procedure per ogni modificate mRNA che codifica per il fattore individuale di riprogrammazione. Dopo la fase di purificazione finale, eluire il mRNA modificate con acqua priva di nucleasi, integrare la soluzione purificata di mRNA modificate con 1 inibitore di RNAsi U / µ l, quantificare i mRNAs modificati utilizzando uno spettrofotometro e conservare a-80 ° C fino a 6 mesi. Preparare diverse aliquote di ogni mRNA modificate per ridurre al minimo il numero di cicli di gelo-disgelo.
      Nota: Protocolli simili per modificate mRNA produzione sono stati segnalati altrove^5,8,11. Modelli per trascrizione in vitro possono essere generati dall'amplificazione di PCR da corrispondenti modelli del plasmide utilizzando primers elencati nella Tabella materiali secondo il protocollo precedentemente pubblicato¹⁰. Modelli del plasmide per ogni fattore di riprogrammazione (M₃O⁹, SOX2, KLF4, cMYC, NANOG, LIN28A) e mWasabi (controllo per la transfezione) sono disponibili da Addgene, un repository di plasmide senza scopo di lucro.
   2. Mescolare insieme tutti i mRNA modificati con un rapporto molare di 3:1:1:1:1:1 (M₃O: SOX2: KLF4: cMYC: NANOG: LIN28A) e includono il 10% mWasabi per volta mRNA come controllo per l'efficienza di trasfezione. Regolare la concentrazione del mRNA modificate completa riprogrammazione mix per una concentrazione finale di 100 ng / µ l con l'aggiunta di acqua priva di nucleasi completato con 1 inibitore di RNAsi U / µ l. Preparare sette 33 aliquote µ l dei completi per volta mRNA cocktail. Conservare le aliquote di riprogrammazione miste a-80 ° C.
      Nota: per ogni trasfezione, 1.000 ng del cocktail modificate mRNA viene aggiunto per pozzetto (cioè, un totale di 3.000 ng per 3 pozzi). Ogni 33 µ l aliquota viene ridimensionato per transfect 3 pozzetti di una piastra di formato da 6 pozzetti e include 3 µ l di volume in eccesso di compensare errori di pipettaggio. Preparare sette 33 aliquote µ l è sufficiente per completare una riprogrammazione del fibroblasto completo di 3 pozzetti in una piastra di formato da 6 pozzetti.
2. Preparare il cocktail di riprogrammazione miRNA imita.
   1. Sciogliere liofilizzato miRNA imita (Syn-ha-miR-302a - 3P, Syn-ha-miR-302b - 3P, Syn-ha-miR - 302c - 3P, Syn-ha-miR-302d-3 p, Syn-ha-miR-367-3 p.) a una concentrazione finale di 5 pmol / µ l (5 µM) in acqua privo di nucleasi completata con 1 U / µ l di inibitore di RNAsi. Preparare diverse aliquote di ogni mimica di miRNA e conservare a-80 ° C per la conservazione a lungo termine.
   2. Mescolare tutti i miRNA imita in un rapporto molare di 1:1:1:1:1 ad una concentrazione finale di 5 pmol / µ l (5 µM). Preparare sette 14 aliquote µ l del quieto imita mix. Conservare le aliquote miste a-80 ° C.
      Nota: Per ogni trasfezione, 20 pmol del miRNA imita mix viene aggiunto per pozzetto (cioè, un totale di 60 pmol per 3 pozzi). Ogni 14 µ l aliquota viene ridimensionato per transfect 3 pozzetti di una piastra di formato da 6 pozzetti e include 2 µ l di volume in eccesso di compensare errori di pipettaggio. Preparare sette 14 aliquote µ l è sufficiente per completare una riprogrammazione del fibroblasto completo di 3 pozzetti in una piastra di formato da 6 pozzetti.
3. Preparare il tampone di transfezione.
   1. Pre-riscaldare una bottiglia da 500 mL e una bottiglia da 100 mL di terreno nuovo siero ridotto a temperatura ambiente (TA) per circa 2 h. Non utilizzare un bagno d'acqua.
   2. Trasferire un pH-metro a una cappa di biosicurezza. Lavare l'elettrodo di vetro con acqua priva di nucleasi. Calibrare il misuratore di pH secondo le istruzioni del produttore. Lavare l'elettrodo nuovo con acqua priva di nucleasi.
   3. Trasferire entrambe le bottiglie del siero ridotto mezzo nella cappa di biosicurezza. Utilizzare la bottiglia da 500 mL RT per aggiustare il pH.
   4. Misurare il pH di base del mezzo siero ridotto inserendo elettrodo di pH-metro vetro nel buffer. Attendere fino a 1 min prima di leggere il pH sul misuratore.
   5. Aggiungere 3-4 mL di NaOH M 1 in 500 mL di siero ridotto medio, chiudere la bottiglia e mescolare bene. Attendere fino a 5 min prima apertura del flacone per la misurazione del pH. Inserire l'elettrodo di pH nel buffer e attendere che si stabilizzi la lettura il pH-metro.
   6. Continuare ad aggiungere piccoli volumi di 1 M NaOH fino a quando il pH del mezzo di siero ridotto raggiunge 8,15 – 8,17. Tarare il pH-metro più volte durante il processo. Se in qualsiasi punto il pH diventa superiore a 8,18, ridurre aggiungendo mezzo ridotto-siero fresco dalla bottiglia 100ml pre-riscaldato (punto 1.3.1).
      Nota: Il pH del tampone siero ridotto medium-basato transfezione è fondamentale. Riprogrammazione avrà esito positivo se il pH del tampone transfezione è circa 8,2 ± 0,05 ma potrebbe non riuscire se il pH è superiore a 8,25. Pertanto, si consiglia di interrompere l'aggiunta di NaOH pH di tampone raggiunge 8,15 – 8,17. Questo farà sì che il pH finale del buffer transfezione è circa 8,2 – 8,22 dopo la sterilizzazione.
   7. Filtro sterilizzare il buffer di transfezione utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto 0,22 µm. Aliquota buffer sterilizzato in provette da 5 o 15 mL con uno spazio minimo di aria.
   8. Conservare le aliquote del buffer transfezione per fino a 3 mesi a 4 ° C. Misurare periodicamente il pH delle aliquote. Scartare le aliquote se il pH è superiore a 8,25. Limitare l'utilizzo aliquota a 2 transfezioni solo dal momento che l'esposizione del buffer transfezione di aria atmosferica aumenta il pH del tampone.
4. Preparare il supporto di espansione del fibroblasto (FEM): minimo essenziale supplementato con 10% siero bovino fetale (FBS), 1 x 1 x penna/mal/fungizone, 55 µM 2-mercaptoetanolo, 1 integratore di glutammina x, gli aminoacidi non essenziali. Memorizzare la FEM a 4 ° C.
5. Preparare il supporto di riprogrammazione: DMEM/F12 (nessun HEPES) completati con knockout 20% siero sostituzione (KOSR), 0,5 x gli aminoacidi non essenziali, integratore di glutammina x 0,5, 55 µM 2-mercaptoetanolo, 50 µ g/mL di acido ascorbico, 1 x penna/mal/fungizone, bFGF 100 ng/mL e 200 ng/mL B18R. Preparare il supporto all'inizio della riprogrammazione senza bFGF e B18R e conservarlo a 4 ° C. Non utilizzarlo oltre 1 mese dopo la preparazione. Aggiungere bFGF e B18R immediatamente prima di ogni utilizzo ad un'aliquota dimensionata per l'uso di quel giorno.
6. Preparare il supporto di placcatura con l'aggiunta di 5% inattivati al calore (HI) FBS nel mezzo di riprogrammazione contenente 20% KOSR senza bFGF e B18R da passo 1,5. Preparare il medium fresco il giorno della destinazione d'uso. Aggiungere bFGF e B18R immediatamente prima dell'uso il giorno 0 di riprogrammazione.
7. Calibrare le incubatrici di coltura del tessuto prima dell'inizio della riprogrammazione secondo le istruzioni del produttore utilizzando un palmare digitale CO₂ analyzer. Utilizzare un incubatore di basso-O₂ per la procedura di riprogrammazione per garantire la generazione di successo iPSC.

2. coltura fibroblasti per riprogrammazione

1. Preparare i fibroblasti prima dell'inizio della riprogrammazione (giorno -2).
   1. Cappotto una nuova piastra di coltura del tessuto di 10 cm con 5 mL di 0,1% di gelatina. Tocca o la piastra per garantire che l'intera superficie è rivestita di turbinio. Incubare per 15 min a 37 ° C. Aspirare la gelatina e aggiungere 10 mL di FEM. Set da parte. Non consentono la superficie rivestita della piastra ad asciugare prima di aggiungere FEM.
   2. Aspirare accuratamente il medio speso dai fibroblasti. Sciacquare le cellule una volta con 5 mL di DPBS per rimuovere il siero residuo. Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Scuotere delicatamente la piastra per garantire una copertura completa sulle celle.
   3. Aspirare il liquido in eccesso, lasciando ~ 500 µ l di tripsina. Non aspirare troppo, poiché questo può asciugare e uccidere i fibroblasti. Incubare i fibroblasti con tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C.
   4. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e con fermezza, ma delicatamente toccare il lato della piastra per sloggiare le cellule. Controllare le cellule sotto il microscopio. Se le cellule sono staccati e galleggianti, procedere. Se le cellule sono ancora collegate, incubare per altri 3 min.
   5. Risciacquo/raccogliere rapidamente le cellule indipendenti con 5 mL di soluzione FEM per neutralizzare la tripsina-EDTA. Spostare la sospensione del fibroblasto in una provetta conica da 15 mL. Assicurarsi che le celle siano ben miscelate.
   6. Mescolare delicatamente la sospensione cellulare per rompere grandi ciuffi di celle, quindi contare su un emocitometro. Trasferimento 2.5 x 10⁵ celle nel piatto di 10 cm rivestite con gelatina preparata al punto 2.1.1. Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C, 5% CO₂ incubatrice umidificata coltura del tessuto normale.
      Nota: La densità delle cellule è critica per ottenere alta efficienza riprogramma, come è importante che i fibroblasti sono sani e rapida divisione. Placcatura di 2.5 x 10⁵ cellule produce una confluenza di 40-60% 2 giorni più tardi per la maggior parte dei campioni del fibroblasto. Regolare di conseguenza l'importo per le cellule malate o senescenti raggiungere il desiderato 40-60% confluency 48 ore più tardi.
   7. Sostituire il mezzo con 10 mL di FEM fresco il giorno seguente (giorno -1).
2. Piastra i fibroblasti per avviare riprogrammare (giorno 0).
   1. Verificare che i fibroblasti di essere riprogrammate sono al confluency di 40 – 60% (Figura 2, giorno 0). Se le celle sono sovra - o sotto-confluenti, passaggio i fibroblasti come descritto al punto 2.1 e regolare di conseguenza la densità di placcatura. Cultura per altri 2 giorni.
   2. Trasferire 4 mL di DPBS in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere 100 µ l di ricombinante umano (rh) laminin-521. Pipettare su e giù per mescolare accuratamente.
   3. Aggiungere 1 ml per pozzetto di rhLaminin-521 diluito in 3 pozzetti di una piastra a 6 pozzetti. Incubare la piastra rivestita a 37 ° C per 2 h.
   4. Scaldare 6 mL di FEM e 4 mL di placcatura medio a 37 ° C. Integrare il mezzo di placcatura con bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL.
   5. Aspirare accuratamente il mezzo esaurito da fibroblasti (punto 2.2.1). Lavare le cellule con 5 mL di DPBS e aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA. Scuotere delicatamente la piastra per coprire le cellule con tripsina-EDTA.
   6. Aspirare il liquido in eccesso, lasciando ~ 500 µ l di tripsina, come fatto nel punto 2.1.3. Incubare i fibroblasti con tripsina-EDTA per 3 min a 37 ° C. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e con fermezza, ma delicatamente toccare il lato della piastra per sloggiare le cellule. Controllare le cellule sotto il microscopio. Se le cellule sono staccati e galleggianti, procedere. Se le cellule sono ancora collegate, incubare per altri 3 min.
   7. Risciacquo/raccogliere le cellule indipendenti con 5 mL di soluzione FEM per neutralizzare la tripsina-EDTA. Spostare la sospensione del fibroblasto in una provetta conica da 15 mL. Assicurarsi che le celle sono ben miscelate e contano su un emocitometro. Pipetta 12.000 celle in 4 mL di terreno di placcatura preriscaldata dal punto 2.2.4.
      Nota: Non centrifugare le cellule in qualsiasi punto. Il numero di celle placcate può essere registrato su o giù come richiesto per le linee o veloce-crescita lenta, rispettivamente.
   8. Rimuovere la piastra rivestita dall'incubatrice ed aspirare diluito rhLaminin-521 dai pozzetti rivestiti. Non lasciare la superficie dei pozzetti per asciugare. Risospendere delicatamente le cellule nel mezzo di placcatura. Pipettare 1 mL di sospensione cellulare in ogni rivestito bene (cioè, 3.000 cellule per pozzetto).
   9. Inserire le cellule placcate in un incubatore di coltura tissutale tri-gas con O₂ al 5% (basso-O₂). Una volta impostata la piastra verso il basso, delicatamente ma accuratamente disperdere le cellule dall'alternanza tra un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Ripetere i movimenti 2 volte. Incubare le cellule durante la notte. Non agitare la piastra per mescolare.
   10. Dispensare 4 mL di riprogrammazione medio e una provetta conica da 15 mL e posizionarla nell'incubatrice basso-O₂ con un tappo allentato per equilibrare durante la notte. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente.

3. l'inizio della riprogrammazione (giorno 1)

Nota: Una volta avviata la riprogrammazione, manutenzione giornaliera è necessaria per circa 1 mese. Essere sicuri di pianificare di conseguenza. Tutte le incubazioni successiva delle cellule devono essere eseguite in condizioni di basso-O₂ in 37 ° C, 5% CO₂, incubatore di coltura del tessuto di 5% O₂ umidificata tri-gas.

1. Sostituire il mezzo di placcatura almeno 1 h prima del transfezione.
   1. Rimuovere il mezzo di riprogrammazione equilibrato dall'incubatrice basso-O₂ . Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL. Mescolare bene.
   2. Procedendo con 1 bene in un momento, utilizzare una pipetta da 1 mL per rimuovere il mezzo esaurito e sostituirlo con 1 mL di riprogrammazione supplementato con bFGF e B18R. Ripetere questa operazione per ciascun pozzetto. Non utilizzare aspirazione a vuoto, che asciuga le cellule eccessivamente, è causa di stress e riduce l'efficienza di riprogrammazione. Riportare la piastra con le cellule nella incubatrice basso-O₂ .
2. Transfect fibroblasti con 5 µ l di reagente di transfezione di RNAiMax a 1 µ g di mRNA modificate, e 1 µ l di reagente di transfezione per 6 pmoli di miRNA imita per trasfezione.
   Nota: Risultati ottimali si ottengono quando transfezioni procedere per h 16 – 20. Il reagente di transfezione è diluito 10 x; 100 ng / µ l mRNA modificate cocktail è diluito 5 volte; e i 5 Mimic di miRNA pmol / µ l mix è diluito 8,33 x con il buffer di transfezione prima di complessazione. Vedere la tabella 1 per un riepilogo dell'installazione transfezione.
   1. Mentre prepara la transfezione mescola, minimizzare l'esposizione potenziale dei reagenti di RNAsi seguendo la pratica di laboratorio standard.
   2. Equilibrare una parte aliquota del buffer transfezione (punto 1.3) per circa 1 h a TA. Non utilizzare un bagno di acqua di 37 ° C o in un incubatore per scaldare il buffer di transfezione.
   3. Rimuovere una singola aliquota dei mRNAs modificate (33 µ l) e miRNA imita (14 µ l) da-80 ° C e caldo a RT per circa 3-5 min, fino a che sciolto. Non scongelare le aliquote a 37 ° C. Spin loro giù brevemente in un microfuge.
   4. Riscaldare il reagente di transfezione di RT per circa 3-5 min. Non utilizzare un bagno di acqua di 37 ° C o in un incubatore. Capovolgere il tubo chiuso 2 – 3 volte per mescolare il reagente. Rallentare brevemente in un microfuge.
   5. Trasferire 279 µ l di buffer di transfezione di RT in un tubo del microcentrifuge RNAsi-libera. 31 µ l di reagente di transfezione per ottenere un volume finale di 310 µ l. Mix accuratamente pipettando. Non centrifugare. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 1 min.
      Nota: Questo volume del reagente di transfezione diluito è sufficiente al complesso sia il mRNA e miRNA modificati imita aliquote dal punto 3.2.3.
   6. Aggiungere 132 µ l di buffer di transfezione di RT ad l'aliquota 33 µ l di mRNA modificate. Pipettare delicatamente per mescolare: volume finale è 165 µ l.
   7. Aggiungere 102,6 µ l di buffer di transfezione di RT per l'aliquota di 14 µ l di miRNA mimici. Pipettare delicatamente per mescolare: volume finale è 116,6 µ l.
   8. Aggiungere 165 µ l del reagente di transfezione diluito dal punto 3.2.5 per il diluito per volta mRNA dal punto 3.2.6. Pipetta per mescolare: volume finale è di 330 µ l.
   9. Aggiungere 116,6 µ l del reagente di transfezione diluito dal punto 3.2.5 per il mix di imita miRNA diluito dal punto 3.2.7. Mescolare bene (volume finale è di 233,2 µ l). Incubare per 15 min a RT per permettere al tampone di transfezione di complessi con i mRNAs modificati e miRNA imita.
   10. Rimuovere la piastra con le cellule dall'incubatrice basso-O₂ . Aggiungere 100 µ l (1 µ g) del complessato per volta mix di transfezione di mRNA in ciascun pozzetto, goccia a goccia attraverso il pozzo. Disperdere i complessi di transfezione di delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Non agitare la piastra per mescolare.
   11. Aggiungere 66,7 µ l (20 pmol) del miRNA complessato imita transfezione mix in ciascun pozzetto, goccia a goccia attraverso il pozzo. Disperdere complessi di transfezione di delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra. Non agitare la piastra per mescolare.
   12. Inserire l'incubatrice di tri-gas cellule transfected con O₂ al 5% (basso-O₂). Una volta impostata la piastra verso il basso, disperdere i complessi di transfezione nuovamente delicatamente ma accuratamente agitando la piastra con un movimento su/giù poi a sinistra/destra.
   13. Dispensare 4 mL di riprogrammazione medio in una provetta conica da 15 mL e posizionarla nell'incubatrice basso-O₂ con tappo allentato per equilibrare durante la notte. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente.

Tubo 1 - RNAiMax diluizione (1 ° mix)
Reagente	Concentrazione	Volume
Buffer di transfezione		Μ L 279
RNAiMax (aggiungere 2 °)	10 x	Μ L 31
		Totale: 310 µ l
		(Incubare 1 min a temperatura ambiente)
Tubo 2 - mRNA modificate mescolare (2 ° mix)
Reagente	Concentrazione	Volume
modificate mRNA mix	100 ng / µ l (5x)	Μ L 33
Buffer di transfezione		Μ L 132
		Totale: 165 µ l
		(aggiungere volume uguale di RNAiMax diluito da 1 tubo)
Tubo 3 - miRNA imita mescolare (3 ° mix)
Reagente	Concentrazione	Volume
miRNA imita mix	5 pmol / µ l (8,33 x)	14 Μ l
Buffer di transfezione		102,6 Μ l
		Totale: 116,6 µ l
		(aggiungere volume uguale di RNAiMax diluito da 1 tubo)

Tabella 1: Preparazione della miscela di transfezione.

4. sostituzione di riprogrammazione di mezzo tra transfezioni (giorni 2, 4, 6, 8, 10 e 12)

1. Sostituire la post-transfezione media 16 – 20 h come descritto in 3.1.1–3.1.2. Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL e B18R a una concentrazione finale di 200 ng/mL in riprogrammazione aliquote medie.
2. Monitorare mWasabi espressione ogni giorno per confermare la qualità di transfezione usando un microscopio configurato per visualizzare EGFP.
   Nota: mWasabi espressione dovrebbe essere minimamente apparente il giorno 2 e aumentare in luminosità con ogni ulteriore transfezione.

5. ogni-altro-giorno transfezioni (giorni 3, 5, 7, 9, 11 e 13)

1. Eseguire la transfezione come descritto al punto 3.2. Non cambiare il mezzo giorni di transfezione.
2. Preparare un'aliquota di 4 mL di riprogrammazione medio e posizionarla nell'incubatrice basso-O₂ per equilibrare per il cambiamento medio il giorno seguente. Non aggiungere bFGF e B18R fino al giorno seguente.

6. le procedure da eseguire dopo la trasfezione finale

1. Eseguire variazioni medie giornaliere dal giorno 14 attraverso circa giorno 17. Caldo 7 mL di riprogrammazione medio a 37 ° C. Aggiungere bFGF ad una concentrazione finale di 100 ng/mL.
   Nota: B18R non è più necessaria dopo la trasfezione finale. Di là di giorno 14, non è più necessario per equilibrare il mezzo durante la notte nell'incubatrice basso-O₂ .
2. Rimuovere il mezzo da tutti i pozzetti usando una pipetta sierologica. Continuare a evitare l'uso di aspirazione. Aggiungere 2 mL di riprogrammazione supplementato con bFGF per pozzetto.
3. Nei giorni 17 e 18, analizzare i pozzetti riprogrammati sotto un microscopio invertito o dissezione. Se colonie si formano nella prossimità vicina a vicenda a causa di alta efficienza di riprogrammazione e non possono essere isolati manualmente, è possibile separare le colonie eseguendo un passaggio facoltativo riprogrammate pozzi descritto nel passaggio 7 qui sotto. Se le colonie sono radi e ben separati, selezionare manualmente i cloni direttamente dalla riprogrammate bene come descritto nel passaggio 8 e sottocultura iPSCs secondo protocolli standard.

7. procedura opzionale: Cellule di passaggio da pozzi riprogrammato con EDTA

1. Preparare 0,5 mM EDTA in DPBS (EDTA) diluendo la soluzione di riserva di EDTA 0.5 M. Filtro sterilizzare EDTA utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto da 0,22 µm.
2. Preparare privo di alimentatore pluripotenti staminali (PSC) supporto (ad esempio, mTeSR1) secondo le istruzioni del produttore. Pre-riscaldare 32 mL di terreno PSC a 37 ° C.
3. Ricoprire tutti i pozzetti di due piastre di formato 6-pozzetti con hESC-qualificati di matrice extracellulare (ECM) seguendo le istruzioni del produttore. Piastre con film di paraffina ed li Incubare per 1 h a TA.
4. Aspirare la soluzione di ECM dalle piastre pre-riscaldate e sostituirlo con 2 mL di terreno PSC per pozzetto. Non lasciare la superficie dei pozzetti per asciugare. Metterle da parte.
5. Aspirare la riprogrammazione medio da 2 pozzi riprogrammate in un giorno quando le colonie sono grandi e ben formate (solitamente giorno 18). Sciacquare una volta con 1 mL di EDTA e aspirato.
6. Aggiungere 1 mL di EDTA per pozzetto. Incubare per 4 min a 37 ° C.
7. Delicatamente rimuovere la piastra dall'incubatrice e inserirlo nella biosicurezza armadietto.
   Nota: A questo punto, le cellule possono essere molto liberamente aderito e si spostano facilmente.
8. Aspirare accuratamente EDTA da entrambi i pozzetti. Aggiungere 3 mL di terreno PSC pre-riscaldato a ogni ben curati con EDTA. Utilizzare un cellulare-raschietto per delicatamente ma accuratamente sloggiare le cellule da entrambi i pozzetti.
9. Utilizzare una pipetta sierologica dispensare la sospensione cellulare e spezzare grandi ciuffi delicatamente. Non pipettare fino a quando tutti i grumi di cellule sono andati. Preservare i cluster iPSC.
   Nota: Grandi ciuffi di placcatura non influenzerà la conseguenza Colonia iPSC. Se ci sono grumi eccessivamente grande cellula, semplicemente evitare di trasferirli nel piatto successivo.
10. Utilizzando una pipetta sierologica, distribuire uniformemente le celle da ogni pozzetto EDTA-trattati di pipettaggio 0,5 mL in ciascun pozzetto della piastra 6 pozzetti rivestite con ECM.
    Nota: Non si combinano le cellule dai pozzetti riprogrammate (cioè, riprogrammato ben 1 deve essere uniformemente distribuita nella prima piastra 6 pozzetti e riprogrammate bene 2 dovrebbe essere uniformemente distribuite nella seconda piastra 6 pozzetti).
11. Riportare le cellule placcate in incubatrice basso-O₂ . Per distribuire uniformemente le cellule, agitare ogni piastra avanti e indietro e di lato a lato. Non agitare. Sostituire il mezzo PSC al giorno.

8. prelievo iPSC colonie

1. Pre-riscaldare 15 mL di terreno PSC a 37 ° C. Cappotto tutti i pozzetti di una piastra singola di 6 pozzetti con ECM hESC-qualificato seguendo le istruzioni del produttore. Sigillare le piastre con la pellicola di paraffina e li Incubare per 1 h a TA.
2. Aspirare il terreno di coltura da pozzi utilizzati per raccogliere iPSCs. Sciacquare una volta con 1 mL di EDTA e aspirato. Aggiungere 1 mL di EDTA per pozzetto. Incubare per 4 min a 37° C. Mentre sono incubando le cellule, aspirare la soluzione di ECM dalle piastre pre-riscaldate e sostituire con 2 mL di terreno PSC per pozzetto. Mettere da parte le piastre.
3. Rimuovere delicatamente la piastra con iPSCs per essere raccolti dall'incubatrice e posizionarlo nella biosicurezza armadietto.
   Nota: A questo punto, le cellule possono essere molto liberamente aderito e si spostano facilmente.
4. Aspirare accuratamente EDTA. Molto delicatamente aggiungere 3 mL di terreno PSC pre-riscaldato, facendo attenzione a non per staccare iPSC colonie.
5. Spostare la piastra di un ambito di dissezione o invertito per meglio visualizzare colonie. Preparare una pipetta da 1 mL con punta sterile. Premere lo stantuffo completamente, quindi utilizzare la punta della pipetta per raschiare delicatamente una colonia mentre si disegna lentamente il liquido nella punta a raccogliere la Colonia. Disegnare come mezzo piccolo come possibile mentre raccogliendo la colonia di iPSC.
6. Per trasferire la Colonia, pipettare su e giù 3 – 4 volte in un singolo pozzo della piastra rivestita con ECM dal punto 8.2. Ripetere fino a 6 colonie sono stati raccolti e trasferiti nei singoli pozzetti. Scegliere non più di 2 colonie ogni singolo pozzo se un passaggio opzionale descritto nel passaggio 7 è stata eseguita.
7. Utilizzare un protocollo standard sulle cellule staminali umane per congelare giù tutti i restanti pozzetti. Scongelare e ri-piastra gli stock congelati se altre colonie devono essere raccolte più tardi.

9. caratterizzazione delle iPSCs

1. Eseguire TRA-1-60 di colorazione per l'analisi della riprogrammazione efficienza (giorno 18).
   Nota: 2 su 3 riprogrammato pozzi sono attraversate per picking futura colonia. Bene il rimanente può essere utilizzato per la colorazione del TRA-1-60. Questa procedura può essere eseguita sulla parte superiore del banco di laboratorio.
   1. Lavare il riprogrammate bene con 1 mL di PBS. Fissare le cellule con metanolo ghiacciato a-20 ° C per 5 min.
   2. Aspirare il metanolo. Secco il pozzo per circa 2 min. fare attenzione a non asciugare troppo. Le cellule sono asciugati abbastanza quando diventano un colore traslucido/opaco.
   3. Lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata. Durante i lavaggi, preparare 3 mL di perossido di idrogeno 3% in PBS.
   4. Aspirare il PBS. Aggiungere 2 mL di soluzione diluita di perossido. Incubare per 15 min a RT con agitazione delicata. Preparare 4 mL di soluzione bloccante: 10% albumina di siero bovino (BSA) in PBS.
   5. Aspirare la soluzione di perossido. Lavare le ben 2 volte con 1 mL di PBS per 5 min.
   6. Aspirare la PBS e aggiungere 2 mL di soluzione di blocco nel pozzo. Incubare per 1 h a RT.
   7. Lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata.
   8. Diluire l'anticorpo primario anti-TRA-1-60 a 1: 100 in soluzione bloccante completata con sodio azide 0.05%. Preparare 1 mL della diluizione di anticorpo per 1 bene di un piatto formato da 6 pozzetti. Aggiungere la diluizione dell'anticorpo e avvolgere la piastra con parafilm per evitare l'evaporazione. Incubare per una notte a 4 ° C con agitazione delicata.
      Nota: Se necessario, l'incubazione con anticorpo primario può essere fatto per 1h a RT con agitazione delicata. La diluizione di anticorpo primario può essere riutilizzata fino a 5 volte.
   9. Dopo incubazione con anticorpo primario, lavare il ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata.
   10. Diluire l'anticorpo secondario di HRP-coniugato anti-topo a 1: 200 in soluzione bloccante. Incubare il pozzo con la diluizione di anticorpo secondario per 2 h a temperatura ambiente con agitazione delicata.
   11. La diluizione di anticorpo secondario di aspirare e lavare i ben 3 volte con 1 mL di PBS per 5 minuti con agitazione delicata.
   12. Durante il terzo lavaggio, preparare la soluzione di substrato seguendo le istruzioni del fabbricante. Dopo il lavaggio finale, aspirare PBS. Aggiungere 1 mL di soluzione substrato e incubare fino a quando il colore desiderato si sviluppa (circa 10 min).
   13. Aspirare la soluzione di substrato. Sciacquare bene con acqua per 5 minuti agitando delicatamente.
   14. Contare le colonie, se lo si desidera. Riprogrammazione di efficienza = (numero di colonie) / (numero dei fibroblasti placcati) x 100%.
   15. Per l'archiviazione a lungo termine, aspirare acqua dalla piastra macchiata e asciugare durante la notte sulla RT. tenuta la piastra secca con parafilm e conservare a 4 ° C fino a 2 anni valutare l'efficienza riprogramma più tardi.

Risultati

In genere ci vogliono circa 5-6 settimane dalla data di inizio del fibroblasto riprogrammazione al congelamento delle fiale prime di iPSCs (Figura 1). Il protocollo di riprogrammazione possa essere classificato generalmente in due fasi. Fase 1 comprende la coltura del fibroblasto e sette transfezioni, con il RNA riprogrammazione cocktail eseguite ogni 48 h. Phase 2 include isolamento, espansione e caratterizzazione delle colonie iPSC.

Prima di avviare il protocollo, è indispensabile accertarsi che i fibroblasti di essere riprogrammate sono di buona qualità. Fibroblasti sani dovrebbero apparire fusiformi, bipolare e refractile con un tempo di raddoppiamento di circa 24 h. Di giorno 0, 250.000 cellule piastrate in un piatto di 10 cm su giorno -2 dovrebbero crescere al confluency di 40 – 60% (Figura 1, giorno 0) e resa circa 6 – 10 x 10⁵ celle. Le cellule proliferano a un tasso più lento possono essere compensate dalla placcatura a una maggiore densità di giorno -2 e il giorno 0 per la riprogrammazione.

Fibroblasti dovrebbero apparire molto sparsa placcatura seguente in un pozzo di un piatto formato da 6 pozzetti per la riprogrammazione (Figura 2, giorno 1). Ventiquattro ore dopo la trasfezione prima, fibroblasti si perdono la loro forma di mandrino e adottare una morfologia più arrotondata (Figura 2, giorno 2), che è mantenuta attraverso il resto della riprogrammazione. Fluorescenza verde da mWasabi mRNA dovrebbe essere minimamente osservabile il giorno 2 e aumentare costantemente in luminosità sia chiaramente visibile di giorno 4. La capacità di rilevare la fluorescenza mWasabi può dipendere da installazione e sensibilità di ambito. Densità delle cellule gradualmente e costantemente aumenterà durante i primi tre transfezioni (giorni 1-6), con un apparente scoppio nella proliferazione che si verificano tra i giorni 7 e 8. Le cellule dovrebbero apparire in gran parte confluenti di giorno 10 (Figura 2, giorno 10). Le prime colonie di iPSC possono apparire più presto il giorno 11 (Figura 2, giorno 11); Tuttavia, colonie possono non essere osservabile fino al giorno 18. In genere, di giorni 15 – 18, ci sarà grande ed evidente iPSC colonie che sono chiaramente distinti dai circostanti, in modo incompleto riprogrammate fibroblasti (Figura 2, giorno 15 e nella figura 3, giorno 17). Immunostaining per il marcatore pluripotenza TRA-1-60 può essere eseguita per valutare l'efficienza riprogramma (Figura 3, giorno 17, TRA-1-60). Nella nostra esperienza, la maggior parte delle linee del fibroblasto resa centinaia di colonie per riprogrammato bene (Figura 3, inserto B).

Densità di placcatura non ottimale è il motivo più comune per la ridotta efficienza della riprogrammazione nel nostro protocollo ed è associata frequentemente con i fibroblasti che sono malate, senescenti, e/o alta-passaggio. Se la densità di placcatura è troppo basso, ci saranno grandi macchie acellulare sterile all'estremità della riprogrammazione (Figura 4) e iPSC colonie non possono formare (Figura 4). Cellule riprogrammate dovrebbero essere molto confluenti entro il giorno 14 (confronta Figura 4A e 4B a Figura 2, giorno 14). Allo stesso modo, se le celle sono troppo densamente placcate o proliferano troppo rapidamente, riprogrammazione efficienza è drasticamente ridotto.

Per mantenere l'omogeneità delle iPSCs derivate dal paziente, è importante espandere linee cellulari da una singola Colonia. Poiché riprogrammazione efficienza è molto alta nel nostro protocollo, vicini iPSC colonie possono formare in prossimità e crescere in ogni un altro (Figura 3, giorni 15 – 17). Questo rende a volte difficile da separare meccanicamente una singola Colonia per espansione clonale. Abbiamo trovato che è utile al primo passaggio un riprogrammate bene e diluirlo attraverso una più grande zona di coltura. Un rapporto di buon passaggio costituito uniformemente dividere un piatto 6-ben-formato riprogrammato bene attraverso un'intera piastra di 6 pozzetti.

A seguito del passaggio di diluizione, iPSCs crescono come colonie e sono facilmente distinguibili dai fibroblasti (Figura 5, giorno 18). Inizialmente, iPSC colonie possono essere imballate senza stringere, e le singole celle hanno una zona citoplasmatica relativamente grande. Nel corso di 4 – 7 giorni, il iPSCs proliferare e formare una colonia di fitto caratteristica con bordi definiti. Singole celle all'interno della Colonia hanno una grande frazione nucleare con nucleoli prominenti (Figura 5, giorno 22). Ci dovrebbero essere molte colonie che formano in ciascun pozzetto, e solo quelli con morfologia iPSC classico dovrebbe essere scelto per espansione.

Figura 1 : Riprogrammazione dei fibroblasti umani in indotta da cellule staminali pluripotenti (iPSCs). È presentato un protocollo schematico per la riprogrammazione dei fibroblasti umani. Fibroblasti sono attraversate prima a una bassa densità in un pozzo di un piatto formato da 6 pozzetti, seguito da sette transfezioni eseguite a intervalli di 48 h. Mezzo è sostituito 16 – 20 h dopo ogni trasfezione. IPSCs riprogrammate sono attraversate prima alle colonie circa giorno 18 e clonali sono scelti da giorno 26. In genere, derivato del fibroblasto iPSC linee possono essere congelati per immagazzinaggio a lungo termine di giorno 38. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2 : Immagini rappresentative giornaliere durante ogni giorno della riprogrammazione. Fibroblasti dovrebbero essere circa 40 – 60% confluenti al momento del passaggio di avviare riprogrammazione (giorno 0, le cellule sono placcate in un piatto di 10 cm). La transfezione prima (T1) si verifica il giorno 1, e le cellule dovrebbero apparire a questo punto molto scarse. Il giorno seguente (giorno 2), una morfologia più arrotondata dovrebbe diventare apparente. Le cellule continueranno a aumento della densità in tutto il protocollo con i cluster di iPSC cominciano a comparire fin dal giorno 11 (cerchiato in rosso). Dal giorno 15, iPSC colonie sarà grande con confini discreti. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3 : Formazione della Colonia seguendo transfezioni con riprogrammazione per volta mRNA e miRNA imita. Basso ingrandimento immagini sono state scattate da un rappresentante di riprogrammazione nei giorni 15 – 17. Dopo la transfezione finale, riprogrammati iPSCs formeranno colonie chiari con confini definiti che si espandono in dimensione e condensano per diventare chiaramente distinti dai fibroblasti circostanti in modo incompleto riprogrammate. Immunostaining per il marcatore pluripotenza TRA-1-60 indica la presenza di iPSCs (inserto A) e può essere utilizzato per il calcolo della riprogrammazione efficienza contando tutte le colonie all'interno di un singolo pozzo (inserto B, esempi delle colonie numerabili cerchiato in verde). Barra della scala = 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4 : Immagini rappresentative di densità di placcatura sub-ottimale per la riprogrammazione. (A, B) Esempi dei fibroblasti che sono troppo radi di giorno 14 di riprogrammazione (confronta con Figura 2, giorno 14). Immagine di ingrandimento basso (C) il giorno 17 di riprogrammazione con un grande, sterile patch cerchiato in rosso. (D) il bene stesso è stato risolto e macchiato per TRA-1-60 di confermare complessivi poveri riprogrammazione efficienza a causa di densità bassa delle cellule. Scala bar = 200 µm (A, B) e 1 mm (C, D). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5 : Immagini rappresentative di iPSCs dopo passaggio iniziale. Dopo aver completato le transfezioni con riprogrammazione modificate mRNA e miRNA imita, cellule riprogrammate sono attraversate da giorni 17 – 20. iPSCs presentano un vantaggio di crescita nel mezzo di PSC e rapidamente sorpassare qualsiasi fibroblasti che in modo incompleto sono stati riprogrammati. Inizialmente, iPSCs formeranno colonie che possono apparire sciolti con i bordi mal definiti. Entro alcuni giorni, le cellule rapidamente proliferano e assumono la morfologia caratteristica delle cellule strettamente imballate con un elevato rapporto nucleo al citoplasma, strettamente clustering in colonie con bordi distinti. Barra della scala = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Questo protocollo descrive un metodo clinicamente rilevante, non-integrazione, RNA-based che consente per la riprogrammazione delle linee di fibroblasti umani normali e malattia-collegati in iPSCs ad un'altissima efficienza. Ad oggi, ogni linea di fibroblasti umani che abbiamo tentato di riprogrammare con il protocollo descritto ha fruttato un numero soddisfacente di iPSCs di alta qualità per applicazioni a valle. IPSCs risultante può essere immediatamente trasferiti e ampliato in condizioni di coltura privo di alimentatore.

Qualità dei fibroblasti per la riprogrammazione:

Riprogrammazione di successo è fortemente dipendente dalla qualità a partire di fibroblasti. Idealmente, la riprogrammazione deve essere iniziato con i fibroblasti di passaggio più bassi disponibili per raggiungere la massima efficienza. Riprogrammazione di efficienza è migliore con i fibroblasti del passaggio 2 – 4. Riprogrammazione può ancora lavorare con alta-passaggio (passaggio 5 – 8), fibroblasti senescenti anche, seppur con una ridotta efficienza. A volte bassa-passaggio fibroblasti non sono disponibili o campioni di pazienti hanno una mutazione genetica che impedisce una crescita sana. In questo caso, ottimizzazione della densità di placcatura iniziale può essere richiesto. La riprogrammazione delle linee del fibroblasto compromessa è solitamente associata con la morte aumentata delle cellule durante transfezioni RNA. Di conseguenza, le cellule nella riprogrammazione bene sembrano essere sparsa da giorni 10 – 14 di riprogrammazione. Grandi aree acellulare saranno visibili anche nel pozzo. Se questo è il caso, il protocollo di riprogrammazione sarà necessario essere ri-iniziato con un numero superiore di partenza iniziale dei fibroblasti. Placcatura 3.000 celle di input per pozzetto di un piatto formato da 6 pozzetti funziona in modo coerente per linee del fibroblasto più adulti. Tuttavia, aumentando il numero di placcatura a 5.000 – 10.000 (50.000 per linee senescenti) può contribuire a migliorare la riprogrammazione dei campioni di malattia-collegati, come è stato segnalato nella nostra precedente pubblicazione⁸. Al contrario, le cellule raggiungendo confluency troppo presto possono anche essere resistente alla riprogrammazione. Se le cellule che subiscono transfezioni con riprogrammazione RNAs proliferano troppo rapidamente (come a volte è il caso con i fibroblasti neonatale primarie), avviare riprogrammazione con 500 fibroblasti per pozzetto di un formato da 6 pozzetti piatto⁸.

Gestione del buffer di transfezione:

Il pH del tampone transfezione (ridotto-siero medio regolata a pH 8,2) è fondamentale per conseguire l'efficienza di trasfezione ottimale necessaria per questo protocollo di riprogrammazione. Per questo motivo, alcune precauzioni per quanto riguarda la gestione del buffer transfezione sono raccomandati. Abbiamo trovato che anche breve esposizione del buffer transfezione di aria atmosferica influenza il pH del tampone. Di conseguenza, il buffer di transfezione deve essere titolato in un contenitore di tappo a vite con uno spazio minimo di aria (usiamo 5 o 15 provette coniche da mL tappo a vite). Per ridurre ulteriormente l'esposizione all'aria, è necessario utilizzare ogni buffer di transfezione aliquota per un massimo di due transfezioni. Infine, dal pH di impatti di temperatura, è fondamentale che il buffer di transfezione è equilibrato al RT per assemblaggio dei complessi transfezione. Si consiglia di non riscaldare il buffer di transfezione a 37 ° C.

Passaggio di iPSCs:

Mentre molti precedentemente pubblicati protocolli raccomandati picking iPSC singole colonie alla fine della riprogrammazione, questo può essere difficile da realizzare quando l'efficienza della riprogrammazione è molto alta o se le colonie cluster insieme, come è spesso il caso nel nostro protocollo. Pertanto, se iPSC colonie sono nella prossimità vicina a vicenda, si consiglia di primo passaggio le cellule per stendere riprogrammate iPSCs prima di scegliere manualmente colonie. Ci sono diversi vantaggi per eseguire questo passaggio passaggio precoce. Spanditura le colonie dà loro più spazio per crescere, producendo colonie molto più grande per il raccolto quello che altrimenti potrebbe essere raggiunto nel pozzo originale. Questo migliora notevolmente il tasso di successo nella creazione di una linea di iPSC da un clone selezionato. Troviamo anche che il tempo di impostazioni cultura aggiuntive con i fibroblasti, seppur con un rapporto diluito, sembra migliorare la qualità media delle colonie raccolte iPSC. I fibroblasti non completamente riprogrammati possono fornire supporto fattori paracrini, che continuano a contribuire a stabilire le iPSCs e facilitare la transizione diretta in condizioni di coltura cellulare privo di alimentatore. Fibroblasti fortuitamente hanno uno svantaggio selettivo di crescita rispetto al iPSCs quando coltivate in mTeSR1. Pertanto, la popolazione di cellule del fibroblasto contaminanti rapidamente viene diluita a quantità trascurabili all'interno di 3 – 4 passaggi.

Inibitori di roccia come Y-27632 vengono spesso utilizzati per la coltura sistematica di iPSCs umane. Abbiamo trovato che frequente e/o estesa cultura di alcune linee di iPSC con Y-27632 possono avere effetti deleteri sulla qualità complessiva. Quando si utilizza un ciuffo metodo di passaggio, come ad esempio con EDTA, Y-27632 non è necessario mantenere iPSC redditività dopo la divisione. Abbiamo completamente eliminato multimediale che integra con Y-27632 per tutte le iPSC isolamento, espansione o coltura sistematica.

Limitazioni di protocollo:

Una limitazione per l'approccio descritto di riprogrammazione RNA-ha basato è il costo iniziale e la complessità associati con la preparazione dei reagenti riprogrammazione. Anche se le procedure preparatorie per generare mRNA reagenti sono tutte le routine e precedentemente sono stati descritti (PCR, trascrizione in vitro , trattamento della dnasi, tappatura, defosforilazione, purificazione), cumulativamente la produzione di reagenti di mRNA è un processo relativamente lungo e non banale. L'altra grande sfida di questo protocollo è la necessità di transfect cellule ogni 48 h, aumentando l'intensità di lavoro del protocollo riprogrammazione. Queste considerazioni possono essere proibitive se riprogrammazione di solo pochi campioni di pazienti è desiderato. Tuttavia, se la considerazione principale è la generazione di iPSCs clinicamente rilevanti o conseguire efficienza riprogramma molto elevata, l'approccio descritto di riprogrammazione RNA-ha basato è ideale.

In sintesi, il descritto ad alta efficienza basati su RNA riprogrammazione metodo cerniere sull'efficienza di trasfezione ottimizzata del tipo di cellule somatiche per essere riprogrammato come descritto nella nostra precedente pubblicazione⁸. Il protocollo di transfezione di RNA ha presentato in questo studio è altamente ottimizzato per i fibroblasti primari umani ma potenzialmente può essere adattato ad altri tipi di cella per migliorare l'efficienza di riprogrammazione delle varie cellule somatiche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Modelli di plasmidi per PCR
pcDNA3.3_KLF4	Addgene	26815
pcDNA3.3_SOX2	Addgene	26817
pcDNA3.3_c-MYC	Addgene	26818
pcDNA3.3_LIN28A	Addgene	26819
pCR-Blunt_hM3O	Addgene	112638
pCR-Blunt_hNANOG	Addgene	112639
pCR-Blunt_mWasabi	Addgene	112640
Modified mRNA in vitro trascrizione e miRNA mimics
Forward Primer	Integrated DNA Technologies	TTGGACCCTCGTACAGAAGC TAATACG
Reverse Primer (Ordinato come ultramero, scala 4nmol)	Integrated DNA Technologies	> TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT><><><>
	New England Biolabs	S1411S
Pfu Ultra II Hotstart 2x Master Mix	Agilent	600850-51
5-metilcitidina-5'-trifosfato	Trilink Biotecnologie	N-1014
Fosfatasi antartica	New England Biolabs	M0289L
DNase I	NEB	M0303S
Kit di trascrizione	MEGAscript T7ThermoFisher Scientific	AM1334
Pseudouridina-5'-Trifosfato	Trilink Biotechnologies	N-1019
Inibitore della RNasi Riboguard	Lucigen	RG90910K
RNA Clean & Concentratore	ZymoResearch	R1019
Syn-has-miR-302a-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000684
Syn-has-miR-302b-3p miScript miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000715
Syn-has-miR-302c-3p miScript miRNA MiMik	Qiagen	MSY0000717
Syn-has-miR-302d-3p miScript miRNA MiMik	Qiagen	MSY0000718
Syn-has-miR-367-3p miRNA miRNA Mimic	Qiagen	MSY0000719
Water (privo di nucleasi, non trattato con DEPC)	Fisher	AM9937	Utilizzare per diluire mRNA modificati e miRNA miMiks
Fibroblast culture e riprogrammazione
0,1% Gelatina in H2O	Tecnologie delle cellule staminali	#07903
Sistema di filtrazione sottovuoto sterile Stericup-GV	EMD Millipore	SCGVU05RE	Da utilizzare per sterilizzare il tampone di trasfezione e 0,5 mM di EDTA in DPBS
2-Mercaptoetanolo	ThermoFisher Scientific	21985023
piastre a 6 pozzetti (trattate con coltura tissutale)	Corning	3516
DMEM/F12	ThermoFisher Scientific	11320033
Fetale Bovino Siero	Fisher	26-140-079
FGF Basic	ThermoFisher Scientific	phg0263
Integratore GlutaMax	ThermoFisher Scientific	35050061	Integratore di glutammina utilizzato per la preparazione dei terreni
FBS inattivato a caldo	Gibco Technologies	10438026
Siero sostitutivo KnockOut	ThermoFisher Scientific	10828010
Reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMAX	ThermoFisher Scientific	13778500	Il protocollo è ottimizzato per il reagente di trasfezione Lipofectamine RNAiMax
MEM	ThermoFisher Scientific	11095080
MEM Aminoacidi non essenziali	ThermoFisher Scientific	11140050
Opti-MEM I Medium a siero ridotto	ThermoFisher Scientific	31985070	Terreno a siero ridotto, utilizzare per preparare il tampone di trasfezione regolando il pH a 8,2, 500 mL
Opti-MEM I Terreno a siero ridotto	ThermoFisher Scientific	31985062	Terreno a siero ridotto, utilizzare per preparare il tampone di trasfezione regolando il pH a 8,2, 100 mL
10 M NaOH	Sigma-Aldrich	72068	Preparare una soluzione 1 M diluendo in acqua priva di nucleasi e utilizzare per la regolazione
del pHAcqua (senza nucleasi, non trattata con DEPC)	Fisher	AM9932	Utilizzare per diluire il NaOH e lavare un pHmetro
Pen/Strep/Fungizone	GE Healthcare	SV30079.01
rhLaminin-521	ThermoFisher Scientific	A29248	Fornito ad una concentrazione di 100 &; micro; g/mL, utilizzare come matrice per la procedura di riprogrammazione
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS)	Life Technologies	14190144
Tripsina-EDTA 0,25% Rosso fenolo	Life Technologies	2520056
Virus vaccinico B18R (CF)	ThermoFisher Scientific	34-8185-86
iPSC
Matrice qualificata Corning Matrigel hESC	Corning	354277	Matrice extracellulare (ECM) per la coltura di iPSC
EDTA, soluzione madre 0,5 M	K& D Medico	RGF-3130	Diluire a 0,5 mM in DPBS, sterilizzare con filtro e utilizzare per il passaggio di iPSC
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	Terreno per cellule staminali pluripotenti (PSC), fornisce un vantaggio di crescita alle iPSC rispetto ai fibroblasti
Anticorpi e Rilevamento
Coniglio anti Topo (HRP coniugato)	Abcam	ab97046
Tra-1-60 (anti topo umano)	Stemgent	09-0010
Perossido di idrogeno (30%)	LabChem	LC154301	Diluire al 3% con PBS
Albumina sierica bovina (BSA)	Fisher	BP9703100
Salina tamponata con fosfato (PBS)	Hyclone	SH30258.02	Fornito come 10x, diluito in 1x
VECTOR NovaRED Perossidasi Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4800
Attrezzature speciali
Description			Note
Armadio
		per colture tissutale umidificato regolare	Calibrare CO2 utilizzando un misuratore digitale, fyrite o equivalente. Equilibrare l'incubatore al 5% di CO2, 37 °C.
		colture tissutali umidificate tri-gas	Calibrare CO2 utilizzando un misuratore digitale, fyrite o equivalente. Equilibrare l'incubatore al 5% di CO2, 5% O2, 37 °C. Utilizzare per la procedura di riprogrammazione.
Il misuratore			deve avere una risoluzione di due cifre decimali. Designare per il lavoro sull'RNA, se possibile.
Microscopio			Microscopio configurato per visualizzare l'EGFP per il monitoraggio dell'efficienza della trasfezione.