Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

Sommario

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

Abstract

Il protocollo qui descritto è un metodo affidabile per raccogliere cheratinociti primari da topi adulti adulti (54 x 2 giorni) producendo circa 30 x 10⁶ cellule vitali per topo. I cheratinociti adulti primari sono raccolti dalla pelle dorsale dei topi femmine. I topi maschi (6 settimane fa) possono essere utilizzati per la raccolta di cheratinociti a seconda dei requisiti dell'esperimento. I topi eutanasia sono rasati e sterilizzati con lavamenti seriali in soluzioni di iodio e nociglia povidone (70% di alcol). Dopo aver disinfettato i topi, la pelle dorsale viene rimossa e il grasso sottocutaneo e il muscolo vengono rimossi con un bisturi e scartati. Le pelli vengono tagliate a pezzetti e trattate con una prova lieve e a bassa temperatura per staccare il derma inferiore dall'epidermide. Le epidermises raschiate vengono mescolate a bassa velocità, filtrate per rimuovere i peli, contate e ri-sospese nel mezzo di coltura. Questo metodo fornisce un'eccellente sospensione a cella singola di celle altamente incicillebili per molte applicazioni a valle.

Introduzione

La pelle di mammalia copre tutto il corpo e serve una moltitudine di funzioni (ad esempio, una barriera fisica primaria, regolazione della temperatura e ritenzione di umidità). Negli ultimi cinque decenni, la ricerca di base sulla pelle di topo ha fornito nuove informazioni sulla struttura e la funzione della pelle. Il modello di pelle di topo ha notevolmente aiutato a comprendere la biologia di base dietro i complessi meccanismi molecolari della carcinogenesi indotta da radiazioni chimiche o ultraviolette. Questi modelli di pelle del topo hanno fornito un contributo significativo alla comprensione delle malattie della pelle umana e della loro mitigazione. Per esplorare un'ulteriore dissezione molecolare dei cheratinociti primari nella biologia dello sviluppo dei follicoli piliferi, nella ricerca sulle cellule staminali, nella carcinogenesi e nell'esplorazione genetica dell'epidermide, è spesso auspicabile isolare e coltivare ispiteliali primari cheratinociti dalla pelle di topi da utilizzare in parallelo con gli esperimenti in vivo. Il fattore motivante nello sviluppo di questo metodo è stata la necessità di un saggio in vitro per le cellule staminali epidermiche clonogeniche e follicle piliferi^1,2. C'era anche un'urgente necessità di sospensioni a cella singola di cellule epidermiche adatte per i saggi clonogenici³, la fluorescenza ha attivato lo smistamento cellulare e la citometria di flusso^3,4. I vantaggi di questo metodo sono un robusto raccolto aumentare un ordine di grandezza rispetto ad altri metodi^5,6, l'inclusione della porzione epiteliale dei follicoli piliferi, e l'alta culturability delle cellule raccolte. Negli anni '80 non esistevano metodi noti in grado di soddisfare tali requisiti. Negli anni successivi, questo metodo è stato perfezionato per aumentare la resa cellulare. La limitazione principale di questo metodo sarebbe il mascheramento di alcuni anticorpi sensibili alla trypsin che comprometterebbero l'immunoreattività⁶.

I topi hanno ricevuto l'allevamento secondo le linee guida Specific Pathogen Free. Sono stati ottenuti da un topo femminile a cinque 54 x 2 giorni di età. Nei topi più anziani, la vitalità dei cheratinociti sarà ridotta a causa della fase anagen (crescita) del ciclo dei capelli. Inoltre, il processo di provapsinizzazione è più difficile rispetto ai giovani topi. La procedura di raccolta è stata ottimizzata con successo per la pelle più sottile di topi femminili rispetto al maschio. I topi maschi non sono generalmente utilizzati per i raccolti di cheratinociti in quanto hanno la tendenza a combattere l'uno con l'altro durante l'alloggiamento e quindi possono lasciare graffi o ferite sulla pelle.

Protocollo

Tutti i protocolli di uso degli animali vertebrati sono stati approvati dall'University of Minnesota Institutional Animal Care and Use Committee in conformità con le linee guida raccomandate NIH e governo.

1. Inizializzazione e subcultura del livello feeder

1. Scongelare una fiala cellulare contenente il topo svizzero congelato 3T3 dal serbatoio di azoto liquido posizionando la fiala in un bagno d'acqua a 37 gradi per 1-2 min. Il numero di celle nella fiala è di circa 1 x 10⁶.
2. Rimuovere la fiala della cella 3T3 quando l'ultima scheggia di ghiaccio si è sciolta. Pulire il tubo con un tampone alcolico del 70%. Quindi, trasferire la fiala in un armadietto di biosicurezza.
3. Trasferire lentamente le cellule in un pallone T-150 e sciacquare la fiala 3T3 con 1 mL di media CGM. Aggiungere lentamente 30 mL di 3T3 Complete Growth Medium (CGM) preriscaldato alle cellule. Affondo delicatamente il pallone per diffondere uniformemente le cellule fibroblaste 3T3. Etichettare il pallone con i dettagli della linea di cella, la data e il numero di passaggio in modo appropriato.
4. Incubare le cellule a 37 gradi centigradi con un'umidità del 5% di CO₂ e 95%.
   NOT: Secondo l'ATCC, il tempo di raddoppio del topo svizzero 3T3 è di 18 ore; quando confluente (contatto inibito), la densità è di circa 40.000 cellule per cm². Usiamo una particolare linea di 3T3 entro 10-15 passaggi dopo l'inizializzazione. Una crescita più rapida o la presenza di cellule a forma di mandrino possono verificarsi a passaggi più alti e di solito è un segno che il 3T3 non funziona così come le cellule di alimentazione per i cheratinociti topo adulti. Se si verifica una rapida crescita, è meglio avviare una nuova linea dalle cellule di passaggio inferiore.
5. Modificare i supporti dopo 24 h per rimuovere le cellule morte e il DMSO rimanente (agente di crioconservazione) e due volte alla settimana. Consentire alle cellule di proliferare intorno all'80% di confluenza e utilizzare flaconi T-150 per l'avvio della coltura. Utilizzare i flaconi T-225 per la cultura secondaria dopo l'inizializzazione.
6. Per sottocolturare 3T3 cellule fibroblaste, rimuovere il pallone dall'incubatrice di coltura cellulare e lavare due volte con PBS sterile freddo (1x) con gentamicina. Tubo 10 mL di soluzione di prova preriscaldato (bagno d'acqua 37 gradi centigradi) (0,25%) in ogni fiaschetta T-225.
   1. Posizionare il pallone su una piastra riscaldante per 3-8 min. Rimuovere il pallone e utilizzare delicatamente i palmi per toccare le pareti del pallone per staccare le cellule e confermare il distacco cellulare al microscopio invertito. Soluzione Trypsin può apparire nuvoloso con celle 3T3 staccate.
7. Convoglia la soluzione trypsin 3–4x per lavare la superficie di crescita cellulare del flacone e trasferire la cella trypsinizzata a 30 mL di CGM in un tubo conico da 50 mL. Rilava il flacone 3-5x con 10 mL della miscela cGM-trypsin-cell del tubo conico da 50 mL.
   NOT: Il contenuto di due contenuti di fiaschetta può essere aggiunto a un tubo da 50 mL; se viene utilizzato un solo pallone, quindi inserire 10 mL di orpsina/cellule in 20 mL di CGM in un tubo da 50 mL.
8. Centrifugare il tubo conico 50 mL a 160 x g per 7 min a 4 gradi centigradi.
9. Ora aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 5 mL di CGM, pipetting delicatamente 10x per interrompere completamente il pellet cellulare. Aggiungere 10 mL di CGM per portare il volume totale del tubo conico da 50 mL a 15 mL.
   1. Mescolare di nuovo 10x e mettere 5 mL della sospensione cellulare in 3 flaconi T-150 separati. Il rapporto sottocultura è 1:3 in flaconi T-225 o 1:4 in flaconi T-150. Aggiungere 30 mL di 3T3 CGM preriscaldato a ciascuno dei flaconi.
10. Etichettare il pallone con il nome della riga della cella, la data di seeding della cella e il numero di passaggio.
11. Per congelare 3T3 cellule dopo la centrifugazione nella fase di subcultura, rimuovere il tubo da 50 mL dalla centrifuga e posizionare su un secchio di ghiaccio. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet cellulare con 1 mL di 5% miscela DMSO-DMEM (vedi Tabella 1) per ogni fiaschetta raccolta.
12. Mettere 1 mL di miscela DMSO-DMEM con sospensione cellulare in ogni crioviale (un crioviale per 3T3 fiaschetta raccolta). Etichettare la fiala con il numero di passaggio, il nome della riga di cella (3T3) e la data in cui le celle sono state congelate.
13. Posizionare queste fiale di cella 3T3 nel barattolo del congelatore di celle (vedi Tabella deimateriali) e trasferirle al congelatore a -70 .C per >5 h. Attenzione rimuovere e trasferire le fiale dal barattolo del congelatore cellulare e metterle in un serbatoio di stoccaggio di azoto liquido per lo stoccaggio a lungo termine fino al prossimo utilizzo . Immettere le informazioni sul nome della linea di celle, l'ubicazione nel serbatoio e la data nel foglio di inventario dell'azoto liquido di laboratorio.

2. Preparazione di 3T3 Feeder Layer per l'irradiazione a raggi X e la seeding

1. Preparare 3T3 cellule una settimana prima della loro irradiazione e consentire loro di crescere confluenza del 100%. Le celle 3T3 sono in genere all'interno dei passaggi da 120 a 130.
2. Per i saggi clonogenici di successo dei cheratinociti primari, prima di seminare cellule 3T3, superficiale rivestire i piatti Petri 60 mm con un collagene.
   1. Pipet circa 2-3 mL della soluzione di rivestimento del collagene in piatti Petri 60 mm per rivestire la superficie inferiore e rimuovere il liquido di rivestimento del collagene in eccesso (vedere tabella 1). Trasferire i piatti Petri in un'incubatrice di 37 gradi centigradi con 5% di CO₂ per un minimo di 1 h. Non lasciate asciugare i piatti in incubatrice.
3. Passaggio di irradiazione a raggi X: seguire i passaggi da 1,4 a 1,6. Utilizzare 50 mL di CGM fresco per sospendere nuovamente il pellet cellulare, chiudere il tubo conico e sigillare con pellicola di guarnizione di paraffina. Per evitare qualsiasi contaminazione, utilizzare sacchetti di plastica per raddoppiare la cella sigillata con paraffina contenente il tubo e posizionare sul ghiaccio. Un strato di alimentazione alternativo a base di mitomicina può essere utilizzato per la coltura cheratinocito⁷.
4. Fibroblasto irradiante 3T3 cellule nel tubo conico 50 mL con una dose di 5.000 rads (50 Cgy) con una macchina a raggi X biologici. Irradiate queste cellule insieme ai media CGM.
   1. Dopo l'irradiazione a i raggi X, centrifugare le cellule a 160 x g per 7 min a 4 gradi centigradi. Aspirare i supporti supernatali e resospensione delicatamente pellet cellulare con 5 mL di CGM che tritura delicatamente 10x. Ora portare il volume finale a 30 mL con ulteriori 25 mL di media e triturato 10x. Questi passaggi trituranti sono cruciali per uno strato fibroblasto 3T3 uniforme per l'esempio di clonogenicità.
5. Conteggio delle cellule vitali: conta i cheratinociti usando un normale emocitometro di vetro. Prendere circa 0,5 mL delle cellule e metterle in un tubo da 1,5 mL. Rimuovete 200 l di miscela cellulare e aggiungete un volume uguale dello 0,4% della soluzione blu di Trypan e della miscela 3–4x. Trasferire celle con un emocitometro e contare tutte le celle nucleate (piccole cellule oro e rosa) come cellule vitali. Calcolare la concentrazione finale di cellule d'oro vitali.
6. Pipetta 1 x 10^{6 celle} 3T3 (un minimo di 7 x 10⁵) celle possono essere utilizzate) in 60 mm di dolcino rivestito piatti Petri (passaggio 2.2) e aggiungere delicatamente 4 mL di supporti Williams E ad alto calcio modificati (cfr. tabella 1). Lasciare che le cellule 3T3 appena semiate si attacchino per 24 h. Il giorno successivo, raccogliere il cheratinocito primario fresco e seme sulla parte superiore dello strato fibroblasto 3T3 attaccato per il saggio clonogenico come indicato di seguito.

3. Raccolta e seeding keratinociti primari

1. Eutanasia da quattro a cinque topi adulti fino all'inalazione di CO₂ secondo gli standard di proprietà animale/IACUC approvati. Tuttavia, questo protocollo può essere utilizzato anche per topi singoli femminili/maschili.
   1. Agganciare circa 9 cm² della pelliccia dorsale con un tagliacapelli elettrico e posizionare tutti i topi tagliati in un barattolo da 500 mL con abbastanza soluzione antisettica di iodio povidone (non scrub) per coprirli per 1-2 min. Agitare bene il barattolo per rivestire uniformemente l'antisettico soluzione sopra i topi.
   2. Versare la soluzione e risciacquare con acqua pulita fino a quando il liquido non viene pulito. Ripetere lo stesso lavaggio antisettico seguito da un risciacquo d'acqua. Dopo il lavaggio antisettico con soluzione di iodio, immergere tutti i topi nel 70% di etanolo per 5-10 min.
      NOT: I topi con pelliccia chiara (ad esempio, BALB/c) manterranno un leggero colore giallastro dai fusti di iodio antisettico, mentre i topi più scuri (ad esempio, C57BL/6) non lo faranno. In particolare, la vitalità delle cellule o la crescita delle colture non sono influenzate dal colore giallo.
2. Rimuovere con attenzione la pelle dorsale tagliata con pinze e forbici del pollice in un cappuccio a flusso laminare. Posizionare la pelle dorsale eccitata in tubo conico riempito con PBS/2x gentamicina. Evitare l'uso di pelle laterale ventrale per prevenire la contaminazione delle cellule mammarie nella coltura.
3. Utilizzando pinze autoclaved e un bisturi, posizionare una pelle dorsale alla volta lato peloso verso il basso su un piatto Petri sottile. Iniziare a raschiare tutti i tessuti sottocutanei compreso il grasso dal lato ventrale del tessuto cutaneo fino a quando non è semi-traslucido. Cerca di rimuovere le tracce massime di tessuto sottocutaneo senza strappare la pelle (parte follicolo pilifero). Inoltre, non raschiare a lungo ed evitare l'essiccazione della pelle.
   1. Mantenere la pelle raschiata nella soluzione PBS fino a quando non vengono elaborate tutte le altre pelli rimanenti. Utilizzando un bisturi, affettare le pelli in strisce da 0,5 cm x 1–1,5 cm e posizionare il lato peloso su un piatto Petri sterile.
4. Pipetta con attenzione 20 mL di soluzione PBS/2x Gentamicin mescolata con trypsin (0,25%) in un piatto Petri di plastica da 100 mm x 20 mm. Utilizzando pinze sterili, trasferire le pelli e farle galleggiare lato peloso sulla superficie della soluzione di trypsin per 2 h in un'incubatrice a 32 gradi centigradi.
   NOTA: il tempo e la temperatura di trippsinizzazione sono cruciali per una buona resa di cheratinociti primari altamente culturabili. Anche se altri metodi possono fornire buone rese di cellule vitali, la culturabilità dei cheratinociti è stata meno soddisfacente.
   1. Durante questo tempo di incubazione di 2 h, ricoprite i piatti con rivestimento di collagene e metteteli a 37 gradi centigradi per 1 h (vedi passo 3.1.2). Per i saggi clonogenici, i piatti Petri da 60 mm sono già stati rivestiti 24 h prima della raccolta di cheratinociti per consentire allo strato di alimentazione 3T3 irradiato di attaccarsi al basso e diffondersi uniformemente.
      NOT: Il rivestimento dei piatti di coltura per la cultura clonogenica è molto importante per un corretto attaccamento, la formazione delle conotee e la crescita/proliferazione finale dei cheratinociti epidermici.
5. Fase di raschiatura epidermica: disporre un piatto Petri quadrato di plastica sterile e creare una superficie a una pendenza di 30 gradi per una corretta raschiatura epidermica con 15 mL di mezzo di raccolta (vedi tabella 1). Rimuovere con attenzione una striscia di pelle galleggiante dalla soluzione di prova con pinze curve. Con una nuova lama del bisturi, raschiare l'epidermide e peli nel mezzo.
   1. Non usare una forza eccessiva, ma usare una forza sufficiente per raschiare l'epidermide, o influenzerà la vitalità cellulare.
   2. Durante la raschiatura dell'epidermide, mantenere la lama perpendicolare al pezzo della pelle. Se la lama è inclinata verso il movimento della lama, ci sono più possibilità di strappo della pelle. Se la lama è inclinata lontano dal movimento della lama, ci sono più possibilità di rimozione dell'epidermide insufficiente.
6. Versare con attenzione il mezzo di raccolta contenente le cellule epidermiche raschiate in un barattolo sterile da 60 mL (autoclavable e riutilizzabile) con una barra di stiramento magnetico di 1,5 pollici. Sciacquare il piatto Petri con ulteriore mezzo di raccolta per raccogliere le cellule epidermiche rimanenti e portare il volume finale a 30 mL. Utilizzare un mescolatore magnetico e mescolare a 100 giri/mm per 20 min a temperatura ambiente. Questo processo rimuoverà le cellule epidermiche intrappolate dai peli.
7. Posizionare uno sterile colino a 70 m sulla parte superiore di un tubo conico da 50 ml. Il colino cellulare si inserisce su un tubo conico da 50 mL.
   1. Prendere il barattolo all'interno di un cappuccio di biosicurezza. Rimuovere la barra di agitazione e versare il contenuto nel filtro del colino attaccato a un tubo conico da 50 mL. Filtrare i capelli indesiderati e le lenzuola di stum corneo.
   2. Premere i peli insieme a materiali di stum corneo all'interno del colino e manipolarli per rilasciare le cellule ciliate intrappolate. Utilizzare 5 mL di mezzo di raccolta per consentire alle cellule intrappolate rimanenti di rilasciare e fluire nel tubo. Portare il volume totale fino a 50 mL nel tubo conico.
8. Capovolgere il tubo conico da 50 mL con la filtratura cellulare e centrifugare a 160 x g per 7 min a 4 gradi centigradi. Successivamente aspirare il supernatante e aggiungere 5 mL di mezzo di raccolta. Risospendere il pellet cellulare triturando delicatamente 20x con un pipet da 5 mL.
   1. In questo passaggio, mantenere le celle in una scatola di ghiaccio per evitare qualsiasi aggregazione. Aggiungere di nuovo 25 mL di mezzo di raccolta e triturare (20-25x).
   2. Per garantire un conteggio correttore accurato in questo passaggio, prendere 1 mL di sospensione cellulare e aggiungere 19 mL di mezzo di raccolta. Ora la diluizione cellulare è 1:20 in 50 mL tubo conico. Se i cheratinociti vengono raccolti da un singolo topo, regolare il volume della sospensione cellulare. Invece di 30 mL, utilizzare 15 mL e fare una diluizione 1:10 per il conteggio delle celle.
9. Pipet 0,5 mL di cellule diluite dal tubo conico da 50 mL (diluizione 1:20) e trasferimento in un tubo di microcentrifuga autoclaved da 1,5 mL. Rimuovere 0,2 mL di miscela cellulare in un altro tubo di microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungere un volume uguale (200 ) di 0,4% soluzione blu Trypan. Mescolare delicatamente questa soluzione 3x e trasferire le cellule in un emocitometro per il conteggio dei cheratinociti nucleati.
   1. Segna tutte le celle blu scuro positive per Trypan blu come cellule morte non vitali e segna piccole cellule d'oro e rosato come cellule vitali. La resa finale del cheratinocito per topo dovrebbe essere di circa 30 milioni di cellule vitali.
10. Centrifugare il tubo conico originale da 50 mL (dal punto 3.8) per 7 min a 160 x g a 4 gradi centigradi. In questa fase, risospendere le cellule nel mezzo desiderato e rendere la diluizione necessaria per la semina delle cellule.
    1. Per la coltura di massa, seme da 2 a 4 milioni di cellule d'oro vitali in ogni piatto Petri da 35 mm nel mezzo di coltura cellulare (mezzo di tipo KGM - integratori per le colture monostrato) (vedere la tabella 1). Per un assaggio clonogenico (formazione della colonia), semi 1.000 cellule per 60 mm piatto Petri su strati di alimentazione 3T3 di topi svizzeri irradiati a raggi X con rivestimento di collagene e modificato mezzo E di William con integratori e siero.
    2. Utilizzare un mezzo totale da 2 a 4 mL rispettivamente per piatti Petri da 35 mm e 60 mm. Inoltre, formulare DMEM e Williams E medio procurato da ATCC con livelli ridotti di bicarbonato di sodio per l'uso al 5% CO₂.
11. Coltivare le cellule di coltura (massa o clonogenica) a 32 gradi centigradi, 95% umidità con 5% DI CO₂. Cambiare i media un giorno dopo il seeding iniziale per la cultura di massa, e poi 3 volte settimanalmente dopo. Tuttavia, per i saggi clonali, il primo cambiamento medio è 2 giorni dopo la semina cellulare e 3 volte settimanalmente in seguito.
12. Per la coltura clonale, coltivare le cellule a intervalli di due e quattro settimane. Dopo il completamento delle colture clonali (2 o 4 settimane), aspirare il mezzo. Fissare le colonie in formalina tamponata al 10% durante la notte a temperatura ambiente e macchia con 0.5% di rodamina B in acqua autoclave per 1 h. Quindi, rimuovere la colorazione B della rhodamina B con una pipetta dal bordo dei piatti.
    1. Sciacquare i piatti in acqua fredda autoclaved fino a quando i piatti corrono limpidi. Mettere i piatti inclinati sul coperchio dei piatti e lasciarli asciugare per il conteggio finale colonia. In particolare, quando si esegue l'esecuzione di un saggio di coltura clonogenica, non viene mai pipet <1 mL di cellule. Se le cellule sono concentrate, diluire serialmente la concentrazione cellulare.

Risultati

Tipicamente, le rese di cheratinociti epidermici per mouse che vanno da 20 x 10⁶ a 30 x 10⁶ Celle blu Trypan si ottengono^8,9. La redditività varia dall'80%-90%. L'efficienza di semina tipica è di circa il 30% di attaccamento a 24 h. La formazione di colonie su strati di alimentazione 3T3 irradiati è di circa 60 colonie per 1.000 cellule vitali per topi C57BL/6 e circa 30 colonie per 1.000 cellule per topi di tipo svizzero^{10 ,11}. I risultati tipici dei saggi di formazione delle sommi sono illustrati nella Figura 1. Il numero di cellule staminali del follicolo pilifero è di circa il 9% CD34^-/CD49f^- cellule staminali per C57BL/6 topi¹². I risultati tipici della citometria di flusso sono riportati nella Figura 2.

Le caratteristiche di crescita di quattro supporti diversi sono illustrate nella Figura 3. I media testati includono KGM-gold, SFM, William's E medium, e Morris-2 (un mezzo di calcio ridotto sviluppato nel laboratorio Morris basato su Williams E).

Figura 1: Esempi rappresentativi di un saggio per i cheratinociti clonogenici di topi adulti. Questa fotografia dimostra la formazione di colonia di cheratinociti da topi femminili CD-1 54 giorni di età trattati topicamente con 1) nessun trattamento, 2) acetone seguito una settimana dopo da acetone due volte alla settimana per due settimane, 3) DMBA seguito una settimana dopo da acetone due volte alla settimana per due settimane, 4) acetone seguito una settimana dopo dal TPA due volte alla settimana per due settimane, e 5) DMBA seguito una settimana più tardi dal TPA due volte alla settimana per due settimane. Dopo i loro trattamenti in vivo, i cheratinociti sono stati raccolti e seminati a 1.000 cellule per piatto su strati di alimentatore irradiati 3T3, e coltivati per due settimane, dopo di che i piatti sono stati fissati con formalina tamponata e macchiati con rhodamina B. I piatti in ogni colonna sono replicati da ogni gruppo di trattamento del mouse. Si noti che il numero di colonie più grandi è aumentato dopo il trattamento con DMBA, e il numero totale di colonie ha aumentato il trattamento TPA dei topi prima del raccolto di cheratinociti. Abbreviazioni: DMBA: 7,12-dimetilbenz[a]anthracene; TPA: 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Esempio rappresentativo di citometria di flusso delle cellule staminali del follicolo pilifero da topi adulti. In breve, i cheratinociti primari isolati sono stati isolati dalla pelle dei topi dorsali e filtrati per i detriti cellulari utilizzando il filtro cellulare. La sospensione isolata del cheratinocito è stata etichettata con anticorpi CD49f o c-integrin (PE) e CD34 (FITC) insieme a colorante morto vivo e altri controlli. Gli anticorpi di controllo dell'isotipo FITC e PE (Rat IgG2akappa) sono stati utilizzati a scopo compensativo (cfr. Tabella dei materiali). Le cellule staminali sono state selezionate tramite CD49f (canale PE), che ha riconosciuto la componente esterna degli emi-desmosomi trovati su cellule epidermiche e folliccolati piliferi basali, e CD34 (canale FITC), che ha riconosciuto le cellule staminali del follicolo pilifero (cioè CD34-FITC (colonna in alto^a destra, totale 5%)). La colonna laterale destra mostra le diverse popolazioni di cheratinociti, vale a dire solo le cellule CD34-FITC, CD34-FITC e a6-PE (popolazione di cellule staminali a doppio positivo), solo a6-PE e cellule non macchiate. Si noti che ci sono due popolazioni di cellule staminali CD34, come sono state segnalate^6,14. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Confronto di quattro diversi media sulle colture primarie di cellule epidermiche da topi adulti. I cheratinociti primari erano isolati dalla pelle dei topi dorsali e contati per la seminazione utilizzando quattro diversi supporti (KGM, SFM, Willem's-E e Morris-2). Pari numero di cheratinociti sono stati semi nati e seguiti per la loro morfologia generale e modello di crescita. Si noti che i cheratinociti che proliferano hanno morfologie leggermente diverse. KGM, SFM e Morris-2 sono tutti supporti di calcio ridotti hanno la crescita più robusta dopo quattordici giorni. Al contrario, le cellule non persistono quando coltivate in Williams E medio che ha 1,4 m di calcio e un alto rapporto di potassio al sodio. Sorprendentemente, Williams E medio con integratori e venti per cento siero bovino fetale supporta cheratinociti colture clonali molto meglio di qualsiasi altro mezzo testato, probabilmente perché il mezzo arricchito Williams E aiuta le cellule di alimentazione 3T3 a "nutrire" meglio. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Soluzioni e media	Commenti
Soluzioni di raccolta
2,5% trypsin (5 mL)
PBS di Dulbecco (500 mL)
Gentamycina (2 mL)
PBS con 2x gentamicina (45 mL)
Salina con buffer fosfato (PBS) con 2x gentamicina
Soluzione Trypsin
Soluzioni per la coltura cellulare
Soluzione di rivestimento piatto puracol-fibronectina:
1 M HEPES (1 mL)
116 mM CaCl2 (1 mL)
Bovine serum albumin 1.0 mg/mL (10 mL)
Mezzo di coltura cellulare (100 mL)
Fibronectina (1 mg)
Collagene Purecol (1 mL)
Soluzione di congelamento delle cellule
DMSO (2 mL)
DMEM con BCS e pen-strep 10%
Media di raccolta	Ha bisogno di essere senza calcio
2x gentamycina (1 mL)
FBS (50 mL)
SMEM (500 mL)
High-Calcium Williams' E Media con:
EGF (5 g/mL) 1 mL
Glutamina 14,5 mL
Idrocortisone (1 mg/mL) 0,5 mL
Insulina 1 mL
LinoAcid-BSA (0,1 mg/mL) 0,5 mL
MEM Ess Aminoacidos 4 mL
MEM Vitamine 5 mL
Penicillina-Streptomycin 5 mL
Transferrin (5mg/mL) 1 mL
Vit A (1 mg/1.000 l) 57,5 l
Vit E 1 mg/mL (4oC) 3,5 - L
Vit D2 (10 mg/mL) 50 lL
3T3 fibroblasto mezzo di crescita completa (CGM)
BCS (100 mL)
DMEM (900 mL)
Penicillina-streptomycin (10 mL)
Kgm	Il medio utilizzato per la coltura di massa è un mezzo di calcio ridotto
Morris 2 media con gli stessi supplementi come Williams' E	Una variante a calcio ridotto di Williams E con integratori

Tabella 1: Ricette di soluzioni e media.

Discussione

Il metodo di raccolta dei cheratinociti descritto qui è stato sviluppato per produrre alte rese di cheratinociti epidermici primari altamente culturabili dalla parte posteriore di topi femmine adulti. Questi cheratinociti sono adatti per la citometria di flusso, l'applicazione della biologia molecolare e la coltura cellulare primaria, compreso il saggio clonogenico riportato qui. Questo metodo di raccolta cheratinocito è stato utile anche per studiare altri aspetti a valle della carcinogenesi chimica cutanea e promozione del tumore^1,13.

Il protocollo prevede diversi passaggi critici. In primo luogo, per il rigore e la riproducibilità, sono stati utilizzati topi di sesso femminile di età 54 e 2 giorni. Questo ci ha permesso di eseguire analisi sensibili e quantitative della colonia da più ceppi di topi e di utilizzarli come fenotipo nell'analisi dei collegamenti portando all'identificazione di almeno un nuovo gene regolatore delle cellule staminali^10,11. In secondo luogo, è utile tagliare le pelli in pezzi più piccoli, poiché la prova è più efficace che cercare di mantenere la pelle intera. In terzo luogo, il tempo e la temperatura della flotazione trypsin è molto importante per la successiva culturabilità. Inoltre, è necessario "colpire notevolmente" i peli rimanenti sul filtro per spostare le cellule attaccate. Questo passaggio è importante per ottenere alti rendimenti di cellule. Inoltre, la temperatura di 32 gradi centigradi dell'incubatrice è importante per la coltivazione a lungo termine di cheratinociti da topi adulti. Infine, in questo protocollo, le letture parallele di esperimenti in vitro e in vivo¹ si basano su colture primarie piuttosto che su sottoculture o linee cellulari. In particolare, se la raccolta di cheratinociti primari per la prima volta utilizzando questo protocollo, mantenere il residuo derma dopo raschiatura per confermare la rimozione completa dei follicoli piliferi insieme con epidermide dall'osservazione istopatologica.

Il principale punto di forza di questo protocollo per la raccolta di cheratinociti di topo adulti è che produce alte rese di cellule culturabili che sono adatte per molte applicazioni a valle. La limitazione principale è che alcuni epitopi della superficie cellulare possono essere sensibili alla provazione in modo tale che l'immunostaining può essere compromessa. Pertanto, quando si testa un nuovo anticorpo di superficie cellulare, può essere prudente utilizzare un metodo a base dispase⁶ o termolisina⁵ per la raccolta per il confronto. L'importanza di questo protocollo è che è stato rigorosamente testato, quantificato e applicato ad applicazioni così diverse come saggi per le cellule staminali clonogeniche^1,9,10,11, per le colture di massa in biochimica⁸, per lo smistamento FACS nell'analisi delle cellule staminali^3,4, per la biologia molecolare^3,12, e per il sequenziamento continuo di RNA e DNA.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,4% di blu di tripano 1x in soluzione salina allo 0,9%	Life Technologies Gibco	15250-061
1 M HEPES Buffer	Sigma	H0887
Agitatore magnetico sterile da 1,5 pollici con anello girevole	Bel-Art, Wayne	371101128	in barattolo Nalgene da 2 once
Pipette monouso da 10 mL	BD Falcon	357551
provetta conica sterile da 15 mL	BD Falcon
150 cm2 (T-150) pallone	da coltura Corning	430825
2 mL tappo a vite Micro provetta conica	Sarstedt	72.608
2 oz Barattolo Nalgene	Thermo Fisher Scientific	2118-0002	60 mL
2,5% soluzione di tripsina 10x	Life Technologies Gibco	15090-046
225 cm2 (T-225) pallone di coltura	Corning	431082
32 oz Nalgene Square Flaconi di conservazione: PETG	Thermo Fisher Scientific	2019-1000	1000 mL
35 mm piatto di coltura sterile	Corning	430165
5 ml pipette monouso	BD Falcon	357543
50 mL provetta conicolare sterile	BD Falcon	352098
60 mm piatto	Corning	430166
70% etanolo
90 mm diametro filtro Spectra Mesh, 74 & micro; m dimensione dei pori	Spectrum Laboratories	145956
Antibiotici (penicillina-streptomicina)	Life Technologies Gibco	15140-122
Siero di vitello bovino (BCS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH30073.03
Albumina sierica bovina	BD Biosciences	354331
CD34 Ram34 FITC anticorpo coniugato	BD Pharmingen	553733
CD49f (alfa6-integrina, GOH3) PE anticorpo coniugato	BD Pharmingen	555736
Cell Strainer, 70 &; micro; m sterile	BD Discovery Labware	352350
Collagene, Bovino, Tipo I, 30 mg	BD Biosciences	354231
CoolCell Contenitore economico per crioviali da 1 o 2 mL	Biocison	BCS-136PK
Corning 2 mL Fiala criogenica in polipropilene, autoportante con fondo rotondo	Corning	430659
Dimetil solfossido (DMSO)	Sigma	D2650
		distillata Milli-Q	resa fresca; acqua ad osmosi inversa distillata due volte
Dulbecco' s soluzione salina tamponata con fosfato 1x, Ca2+ e Mg2+ senza	Life Technologies Gibco	14190-144	Sterile
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)	ATCC	30-2002
Siero fetale bovino (FBS)	Thermo Fisher Scientific Hyclone	SH 300070.03
Fibronectina	Sigma	F1141-5MG
Fisherbrand Contenitore per campioni sterile da 4 once	Fisher Scientific	16-320-730
Gentamicina 50 mg/mL 10	Life Technologies Gibco	15750-060
KGM	Lonza	CC-3103
Nalgene "Mr. Frosty" congelatore per celle	Thermo Fisher Scientific	5100-0001
Nalgene PC Barattoli a bocca larga a lato dritto, 16 once	Thermo Fisher Scientifico	2116-0500
N. 22 lame sterili in acciaio inox	BD Bard-Parker	371222
N. 4 manici per bisturi	Strumenti di ricerca biomedica	26-1200	In una tazza con il 70% di etanolo
paio di pinze per medicazione oculare a curva intera	Militex	18-784	In una tazza con il 70% di etanolo
Un paio di forbici	Strumenti	per la ricerca biomedica25-1050	In una tazza con il 70% di etanolo
Un paio di pinze per la medicazione del pollice	Militex	6-4	In una tazza con il 70% di etanolo
Oster Pro-Cord/Cordless Trimmer n.40 lama	Jarden Consumer Solutions/Oster	78997-010
Piastra Petri in plastica 100 mm x 20 mm sterile	Corning	430167
Pyrex Brand Plain Stemless Glass Funnel	Corning	6240-75
controllo dell'isotipo FITC di ratto	BD Pharmingen	553929
IgG2akappa di ratto Anticorpo di controllo dell'isotipo PE	BD Pharmingen	555844
SFM	Life Technologies Gibco	10725-018
SMEM	Life Technologies Gibco	11380-037
SMEM: Terreno essenziale minimo privo di Ca2+ e Mg2+ per la coltura in sospensione	Life Technologies Gibco	11380-037
Piastre di Petri sterili quadrate in plastica BD	Falcon	351112
topo svizzero Fibroblasti 3T3	ATCC	CCL-92	utilizzato entro 10 passaggi
Triadina; 10% soluzione topica per la preparazione di iodio povidone, 16 once	Gruppo triade	10-8216
VWR Piastre di Petri in plastica, salvaspazio sterili 100 x 10	VWR	25384-324
Williams E Medium	Life Technologies Gibco	12551-032
			con chiusura lampo