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Articolo metodologico

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

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DOI:

10.3791/58704

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7 gennaio 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell, Developmental, & Cancer Biology, Oregon Health and Science University, 2Department of Molecular Microbiology & Immunology, Oregon Health and Science University, 3Department of Dermatology, Oregon Health and Science University, 4Knight Cancer Institute, Oregon Health and Science University

In questo articolo

Sommario

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Abstract

Uscita del leucocita dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti non è solo fondamentale per la sorveglianza immune e l'inizio, ma contribuisce anche alla risoluzione delle risposte dei tessuti periferici. Mentre una varietà di metodi sono usati per quantificare in uscita del leucocita dai tessuti non linfoidi, periferici, i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il contesto-dipendente in uscita rimangono poco compresi. Qui, descriviamo l'uso di fotoconversione in situ per l'analisi quantitativa di uscita del leucocita da murina pelle e tumori. Fotoconversione permette l'etichettatura diretta dei leucociti residente all'interno del tessuto cutaneo. Anche se l'esposizione della pelle a luce ultravioletta induce locale le risposte infiammatorie caratterizzano da infiltrati del leucocita e permeabilità vascolare, in un confronto testa a testa con applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, fotoconversione specificamente con etichetta popolazioni migratori delle cellule dendritiche e contemporaneamente abilitato la quantificazione di uscita mieloide e linfoidi da microambienti cutanei e tumori. I meccanismi d'uscita del leucocita rimangono un componente mancante nella nostra comprensione della complessità del leucocita intratumoral, e così l'applicazione degli strumenti descritti nel presente documento fornirà visione unica le dinamiche del tumore immuni microambienti entrambi a costante dichiari e in risposta alla terapia.

Introduzione

Risposte immunitarie tessuto periferico sono a forma di non solo di reclutamento leucocitario ai siti di infiammazione, ma anche dai meccanismi che regolano la loro successiva conservazione. Così, l'immunità protettiva è dettata dalla cumulativi meccanismi cellulari e molecolari che determinano se un leucocita entra, soggiorni all'interno, o meglio migra dal tessuto periferico tramite vasi linfatici. D'importanza, la propensione per i leucociti uscire del tessuto attraverso i vasi linfatici (definito in uscita) è legata alla loro funzioni specializzate. Le cellule dendritiche (DC) acquisiscono comportamento migratore in risposta a segnali di maturazione che conduce al trasporto dell'antigene e presentazione nello scarico dei linfonodi (dLN), un processo che è necessario per l'immunità adattativa1. Lo scavenging cellule mieloidi, quali macrofagi e neutrofili, servono a rimuovere i detriti apoptotici attraverso fagocitosi. Durante l'infezione batterica, neutrofili uscita del tessuto e, infine, andare incontro ad apoptosi in dLNs2 e in un modello di colite DSS indotta, dati supportano l'ipotesi che l'uscita del macrofago è necessaria per risolvere l'infiammazione locale3. Tuttavia, se conta dei neutrofili e dei macrofagi in uscita si verifica in tutti i contesti infiammatori, è sconosciuto. Prove per l'uscita dei linfociti T da stazionario4,5,6,7, infetti8e infiammata4,9,10, 11,12 tessuti periferici non linfoidi indica che le cellule T ricircolare attivamente, anche se i segnali tissutali che guidano questa uscita rimangono poco compresi. Parecchi studi hanno identificato i segnali necessari per la migrazione direzionale verso lo scarico di capillari linfatici e successivi uscita compreso ligando di chemochina (motivo C-C) 21 (CCL21) e del suo recettore CCR74,11, 13, ligando di chemochina (motivo C-X-C) 12 (CXCL12) e il suo recettore CXCR42,14e sfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Questi meccanismi non sono attivi in tutti i contesti, tuttavia, e se essi determinano in uscita di tutti i tipi di cellule rimane una questione aperta. D'importanza, ulteriore comprensione dei meccanismi che regolano l'uscita e la sua rilevanza funzionale nella malattia richiede metodi quantitativi in vivo di analisi.

Diversi metodi sono stati usati per quantificare in uscita in più modelli animali in vivo , tra cui diretto incannulazione dei vasi linfatici, trasferimento adottivo di ex vivo etichettato leucociti, applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, iniezione di particelle con etichettate e in vivo fotoconversione17,18. Incannulazione diretta dei vasi linfatici afferenti del mouse è difficile e limitata nei piccoli animali dai volumi di liquido che può essere raccolto. Così, inserimento di una canula in gran parte è stata eseguita in animali di grandi dimensioni (ad es., pecore) dove tali manipolazioni chirurgiche sono pratici. Questi studi forniscono la prova diretta per la presenza di cellule mieloidi e linfoidi in linfa10,19,20. Inoltre, ovine modelli rivelano che l'infiammazione acuta e cronica aumentata presenza dei linfociti nei linfonodi da quasi 100 volte10,21.

Trasferimento adottivo di linfociti con etichettati e geneticamente manipolati soprattutto ha rivelato che CCR7 è necessaria per l'uscita di CD4+ T cellule da acutamente inflamed pelle5,11, mentre il pretrattamento dei linfociti con la piccola molecola agonista del recettore S1P, FTY720, inibisce solo parzialmente la loro uscita10. È interessante notare che, l'uscita dei linfociti trasferiti da pelle cronicamente infiammata è CCR7-indipendente10, ma parzialmente può richiedere CXCR49. Esperimenti di trasferimento adottivo, tuttavia, forniscono numeri non-fisiologica di ex vivo linfociti attivati ed etichettati nel tessuto attraverso l'iniezione, che altera l'ambiente biomeccanica dei tessuti e l'elevata pressione del fluido interstiziale che aprire capillari linfatici iniziali e alterare le loro proprietà di trasporto22. Come un'applicazione alternativa, transdermica di isotiocianato di fluorescina (FITC) in presenza o assenza di sostanze irritanti cutanei (ad es., dibutilftalato, DBP) o infezione23,24 consente per il tracciamento degli cellule fagocitiche che si accumulano tracciante e la migrazione a dLNs. Analogamente, fluorescente identificati tumori forniscono un mezzo per tenere traccia di cellule fagocitiche che hanno inghiottito tumore materiale25. Questi metodi hanno fornito la comprensione importante nei meccanismi che regolano DC uscita13,14,17,26,27 , ma sono in grado di tenere traccia non fagocitica linfociti e, interpretazione può essere complicate da libero drenaggio linfatico di FITC solubile così etichettatura stanziali, LN residente DCs.

In alternativa, la microscopia intravital è un potente strumento che permette per il monitoraggio in vivo di popolazioni leucocitarie fisiologicamente rilevanti in tempo reale28,29. Usato in combinazione con i topi reporter e base di anticorpi in vivo etichettatura immunofluorescente, videomicroscopia microscopia ha rivelato il complesso spaziale e dinamica temporale di immune cellula traffico, tra cui migrazione interstiziale30 , trasmigrazione attraverso l'endotelio linfatico, il passaggio all'interno del lume linfatico e migrazione su LN voce28,31. L'adozione di tecniche di imaging videomicroscopia è limitata dalla spesa, competenze necessarie per la messa a punto e limitata velocità di trasmissione per quantificare più tipi di cellule. Ancora, metodi quantitativi che analizzare le dinamiche di popolazione di accoppiamento tessuti con imaging videomicroscopia fornirà ulteriori e importanti informazioni per quanto riguarda i meccanismi di migrazione verso e all'interno di capillari linfatici e motilità 18 , 31 , 32.

Di conseguenza, in vivo fotoconversione è emerso come un metodo che consente di in situ di etichettatura, indipendente di attività fagocitaria e per la quantificazione di uscita fisiologico del leucocita (quando accoppiato con citometria a flusso) nella assenza o presenza di sfida. Topi di Kaede-Tg esprimono costitutivamente una proteina isolata dal corallo che presenta fluorescenza verde (Kaede verde) fino a quando esposto a luce ultravioletta, dopo di che irreversibilmente converte in fluorescenza rossa (Kaede rosso)33. Photoconverted cellule possono essere monitorate come essi uscire da luoghi periferici del tessuto e si accumulano nel dLNs. Questo e altri simili fotoconvertibile mouse modelli34,35 hanno rivelato biologia importante tra cui uscita costitutiva delle cellule T regolatorie da pelle36, servizi esterni di CXCR4-dipendente delle cellule di B da placche di Peyer37 , mobilizzazione delle cellule di T di memoria residente al momento del peptide ri-sfida38e l'uscita del leucocita ampio da tumore microambienti39. Nel presente documento, eseguiamo un confronto testa a testa di fotoconversione con applicazione transdermica FITC nel contesto di infiammazione cutanea e infezione per consentire un confronto diretto dei dati esistenti con il metodo fotoconvertibile. Inoltre, dimostriamo fotoconversione in tumori impiantati e descrivere l'efficienza di conversione e l'uscita selettiva da microambienti di tumore. Come tale, ci sostengono che ulteriore applicazione di questi metodi è necessario chiarire la biologia critica d'uscita del leucocita dai tumori, che avrà implicazioni significative per l'interpretazione delle complessità di intratumoral del leucocita, immunità anti-tumorale, e risposta alla terapia.

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Protocollo

Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la Oregon Health & Science University e istituzionali Animal Care.

1. induzione di infiammazione e pittura di FITC di Mouse Pinna

  1. In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse C57Bl/6 utilizzando vaporizzata isofluorano (indurre a 3-5% isofluorano e mantenere a 1-3% isofluorano; portata di ossigeno a 0,5-1,0 L/min). Garantire adeguata amputate monitorando la perdita del riflesso pedale, movimenti involontari e ridotta frequenza respiratoria.
  2. Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di soluzione FITC 5% sciolto in 1:1 acetone: dibutilftalato (DBP) al lato ventrale di pinna di orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
  3. 24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi tramite l'esposizione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere i padiglioni auricolari in PBS separando le orecchie dalla testa con le forbici. Raccogliere la cervicale dLNs e inguinale non drenante LNs in PBS utilizzando una pinzetta per separare la LNs dai tessuti circostanti. Inguinale non drenante LNs servirà come controlli negativi per la presenza di leucociti /Kaede rosso+ +FITC. Smaltire le carcasse al protocollo ospedaliero.
    Nota: Il tempo ottimale post fotoconversione per analisi dipenderà il tipo di cella e noti comportamenti migratori. Cellule dendritiche, ad esempio, possono essere rilevate in dLNs come presto come 6h post DBP applicazione.

2. induzione di infiammazione e di fotoconversione di Mouse Pinna

  1. In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg (sfondo C57Bl/6) tramite l'iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina sciolto in soluzione salina. Garantire la corretta amputate come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di un 1:1 di acetone: DBP al lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
  3. Dopo l'applicazione di DBP, tagliare una fessura in un pezzo di carta stagnola e tirare l'orecchio attraverso la fessura per esporre l'orecchio alla sorgente di luce viola. Porre l'orecchio piatto con il lato dorsale rivolto verso l'alto utilizzando nastro biadesivo per fissare l'orecchio all'estruso.
  4. Posizionare l'orecchio direttamente sotto la fonte di luce e fotoconvertita per 3 minuti utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 100 mW di potenza.
  5. 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi di Kaede-Tg e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
    Nota: Oltre a considerazioni citate al passaggio 1.3, i tassi di proliferazione saranno determinare i tempi di analisi come si verifica la perdita di Kaede rosso in cellule in rapida divisione.

3. vaccinia infezione del Mouse Pinna e applicazione di FITC

  1. Anestetizzare un mouse C57Bl/6 con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Appoggiare il lato ventrale dell'orecchio piatto. Pipettare 5 x 106 unità formanti placca (PFU) del virus vaccinico (VacV) diluito in 10 µ l di PBS sul padiglione auricolare dell'orecchio. Utilizzando un ago 29, poke pinna 25 volte40.
  3. post-infezione 24h, anestetizzare topi VacV-infettati con isofluorano come descritto nel passaggio 1.1 e dispensare 20 µ l 5% FITC disciolto in acetone sul lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.
  4. 24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni dell'orecchio, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
    Nota: FITC può essere applicato a qualsiasi infezione post punto di tempo per determinare DC traffico a vari intervalli di 24 h. Precedentemente abbiamo segnalato che la migrazione DC a dLNs è mantenuta a livelli simili da giorno 1 a 3 post infezione41.

4. vaccinia infezione del Mouse Pinna e fotoconversione.

  1. Anestetizzare un mouse di Kaede-Tg con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.
  2. Infettare il pinna orecchio con VacV come descritto al punto 3.2.
  3. 24h post-infezione, anestetizzare topi infettati VacV Kaede come descritto nel punto 2.1 ed eseguire fotoconversione come descritto ai punti 2.3-2.4.
  4. 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3.
    Nota: Come indicato al punto 3.4, fotoconversione può essere somministrato a qualsiasi infezione di post punto di tempo.

5. orecchio e linfonodo elaborazione per citometria a flusso

  1. Creare sospensioni singola cella dei padiglioni auricolari ear: sbucciate a pezzi i lati ventrali e dorsali del pinna orecchio utilizzando due coppie di pinzette e posto all'interno dell'orecchio rivolto verso il basso nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL DNasi, diluito in Buffered Saline soluzione (HBSS di Hank) (contenente Ca2 + e Mg2 +). Incubare a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.
  2. Creare sospensioni singola cella da LNs: posto LNs nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Aprire civettuole linfonodo usando due aghi di 29-calibro della capsula e poi incubare i linfonodi a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.

6. intradermica Melanoma impianto del tumore e fotoconversione.

  1. Radere il pelo dal centro della parte posteriore di un mouse di Kaede-Tg utilizza un rasoio elettrico.
  2. Posizionare un ago 29 al centro della schiena tra le scapole superiore di destra e sinistra e iniettare per via intradermica 5x105 cellule del tumore (diluite in 50 µ l di soluzione fisiologica) nella pelle dei topi di Kaede-Tg. I tumori devono essere posizionati accuratamente per assicurare il drenaggio linfatico ai linfonodi specificati (cioè, sinistra e destra brachiale LNs per tumori collocato al centro della parte superiore della schiena). Evitare di collocare il tumore sopra dLN poiché ciò può comportare fotoconversione diretto di LNs attraverso il tumore di pelle.
  3. Consentire i tumori crescere di dimensione desiderata (100-650 mm3).
  4. Un giorno prima della raccolta del tessuto, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg come descritto al punto 2.1 e radere i peli appena ricresciuto intorno al tumore.
  5. Tagliare un foro circolare nella carta stagnola e tirare il tumore attraverso per esporre il tumore alla sorgente luminosa. Tagliare il foro leggermente più piccolo del tumore per impedire la caduta indietro attraverso il foro di tumore e ridurre al minimo la conversione della pelle adiacente, non tumorali.
  6. Posizionare il tumore direttamente sotto la sorgente luminosa e fotoconvertita per 5 min utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 200 mW di potenza.
  7. 24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi come descritto al passaggio 1.3. Raccogliere i tumori, brachiale dLNs e inguinale LNs non-drenante in PBS. Tagliare i tumori dalla pelle circostante utilizzando le forbici e rimuovere LNs descritte al punto 1.3.

7. tumore e linfonodo elaborazione per citometria a flusso

  1. Creare sospensioni singola cella dai tumori: tritare i tumori con le forbici in pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Incubare a 37 ° C per 1 h. Press il tessuto digerito attraverso un filtro di nylon 70 µm.
  2. Creare sospensione unicellulare dei linfonodi come descritto al punto 5.2.

8. anticorpo che macchia per citometria a flusso

  1. Dopo digerire i tessuti nelle sospensioni singola cella, eseguire tecniche di colorazione citometria a flusso standard per etichettare le cellule con gli indicatori di interesse. Brevemente, dispensare 2 x 106 le cellule in una piastra a 96 pozzetti. Incubare i campioni con blocco Fc (1 µ g/mL) per 20 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs (albumina di siero bovino 1% in PBS). Aggiungere live/dead macchia (diluito in PBS) ai campioni ed incubare per 15 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs. Incubare con gli anticorpi primari (Tabella materiali) diluiti in un tampone di FACs per 30 min in ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs.
    Nota: Kaede verde e Kaede fluorescenza rossa si sovrappone con fluorofori FITC e PE; così, FITC e anticorpi coniugati PE non possono essere utilizzati in combinazione con proteine di Kaede.
  2. Dopo la colorazione, è necessario eseguire gli esempi su un citometro a flusso. In alternativa, fissare le cellule con 2% PFA.

9. analisi di citometria a flusso di

  1. Impostare il FITC (Kaede verde) e il canale di PE (Kaede rosso) tensioni PMT al 70-80% dell'intervallo totale (centro della popolazione di circa 104) utilizzando ex vivo Kaede verde o gli splenocytes Kaede rosso colore singolo o sangue.
    Nota: Non compensano per il verde di Kaede (FITC) e canali di Kaede rosso (PE) come questo si tradurrà in una maggiore segnale diffuso.
    1. Per creare controlli di singolo-colore Kaede, raccogliere una milza o sangue da un mouse di Kaede-Tg. Lisare cellule rosse del sangue con buffer di ACK, poi dividere le celle in due gruppi: non convertiti Kaede verde e convertito Kaede rosso.
    2. Per singolo colore Kaede rossi controlli, sospendere le cellule in 1 mL di PBS e fotoconvertita in una piastra a 24 pozzetti per 5 min utilizzando un sorgenti luminose di 405 nm con una potenza di 100 mW. Utilizzare queste cellule per impostare il Kaede verde (FITC) e Kaede rosse tensioni PMT sul citofluorimetro (punto 9.1).
  2. Dopo aver impostato le tensioni per le proteine di Kaede, compensare tutte le altre macchie di anticorpo primario utilizzando single-fluoroforo etichettato perline di compensazione per le istruzioni del produttore.
  3. Eseguire gli esempi su un citometro a flusso per raccogliere dati.
    Nota: La proteina di Kaede è continuamente essere prodotta dalle cellule. Questo significa che 24 h dopo fotoconversione, cellule convertite sarà doppio positivo per Kaede verde e Kaede rosso come recentemente sintetizzato Kaede (verde) della proteina ha accumulato nella cella.
  4. Analizzare i dati utilizzando il software FlowJo o un software simile.

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Risultati

In primo luogo abbiamo cercato di replicare fotoconversione risultati pubblicati nella letteratura per valutare l'efficienza e determinare l'infiammazione associata nella pelle del mouse. Padiglione auricolare dell'orecchio è stato esposto a 100 mW viola luce (405 nm) per 3 min come precedentemente descritto33. Singola di sospensioni cellulari generate dalla pelle dell'orecchio, o cervicale dLNs immediatamente dopo l'esposizione ha rivelato un'efficienza di convers...

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Discussione

Anche se l'uscita del leucocita dai tessuti periferici, non linfoidi è critico per l'avvio e la risoluzione della risposta immunitaria, i meccanismi molecolari che regolano i servizi esterni sono capiti male. Questa lacuna nella conoscenza è in gran parte a causa della pronta disponibilità di strumenti per la quantificazione in vivo. Qui, descriviamo l'uso di topi fotoconvertibile (Kaede-Tg) a quantificare egress endogeno del leucocita dalla pelle e tumori e fornire un diretto confronto testa a testa con vernice...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.

Ringraziamenti

Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Marcus Bosenberg per la fornitura di YUMM 1.1 e linee di melanoma murino YUMM 1.7 e Dr. Deborah J. Fowell per la fornitura di B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr topi in accordo con RIKEN BRC attraverso la Bio-risorsa nazionale di MEXT, Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi DRoche11088866001
DNaseRoche4536282001
Silver-LED-405B sorgente luminosa con fibra ottica e collimetroPrizmatix LtdV8144
Isotiocianato di fluoresceina isotiocianato ISigma-AldrichF4274
dibutilftalatoSigma-Aldrich524980
acetoneMacron Fine Chemicals2440-02
siringhe calibro 29Exel International26029
Evans BlueSigma-AldrichE2129
filtri cellulari da 70 umVWR732-2758
paraformaldeideSigma-AldrichP6148
HBSSCassoneHBL06
Kit per la colorazione delle cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEADInvitrogenL34966
Purificato Anti-topo CD16/CD32Tonbo Biosciences70-0161-M001
BV605 CD11c (clone N418)Biolegend117334
PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)BD Pharmingen562363
BV421 CD3e (clone 145-2C11)Biolegend100341
APC CD8a (clone 53-6.7)TonBo Biosciences20-0081-u100
APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103116
BV650 CD19 (clone 6D5)Biolegend115541
PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)Biolegend128011
Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)Biolegend123121
APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)Biolegend127623
BV711 CD11b (clone M1/70)Biolegend101241
BV605 CD45 (clone 30-F11)Biolegend103155
BV711 CD4 (clone RM4-5)BD Biosciences563726
Albumina sierica bovina (Frazione V)Fisher ScientificBP1600-100
Set di particelle anti-ratto e anti-criceto Igk / Compensazione del controllo negativoBD Biosciences552845
Citometro a flusso FortessaBD Biosciences
FlowJo v10 SoftwareFlowJo

Riferimenti

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