Listeria monocytogenes Infezione del cervello

Summary

Durante l'infezione, la Listeria monocytogenes è in grado di attraversare la barriera ematomeningea per colonizzare il cervello. In questo protocollo, dimostriamo come valutare la colonizzazione batterica degli organi a seguito di infezione dei topi. È disponibile una procedura per eseguire perfusione d'organo intero per determinazione specifica di numeri batterici nel parenchima del cervello.

Abstract

Listeria monocytogenes è un agente patogeno batterico intracellulare che è frequentemente associato con l'infezione di origine alimentare. La capacità di L. monocytogenes di attraversare la barriera sangue - encefalica (BBB) è relativa come può portare a pericolose meningite ed encefalite. Il BBB protegge il microambiente di cervello da vari metaboliti tossici e agenti patogeni microbici trovati nel sangue dopo l'infezione e pertanto supporta l'omeostasi del cervello. I meccanismi da cui L. monocytogenes presente nel sangue attraversare la BBB per causare cervello infezioni completamente non sono capite e c'è anche una mancanza di un sistema robusto modello per studiare le infezioni del cervello da L. monocytogenes. Qui, presentiamo un modello di infezione mouse semplice per determinare se i batteri hanno attraversato la barriera emato-encefalica e per quantificare l'onere di batteri che hanno colonizzato il cervello in vivo. In questo metodo, gli animali sono stati infettati per via endovenosa con L. monocytogenes e umanamente sono stati eutanasizzati tramite l'esposizione al CO₂ seguita da dislocazione cervicale. Aspersione cardiaca degli animali è stato effettuato prima della raccolta di organi infetti. Il sangue è stato raccolto prima di aspersione e il numero di batteri per organo o mL di sangue è stata determinata mediante diluizioni degli omogeneati su piastre di agar sangue e di organi di placcatura e contando il numero di colonie formate. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le interazioni recettore-ligando romanzo che migliorano l'infezione del cervello da L. monocytogenes e possono essere facilmente adattato per lo studio di più agenti patogeni batterici.

Introduction

Il batterio gram-positivo Listeria monocytogenes è un agente patogeno intracellulare facoltativo e uno del maggior parte dei patogeni di origine alimentare mortale in tutto il mondo. Ingestione di cibo di L. monocytogenes contaminato può condurre alla listeriosi nell'uomo, una grave malattia invasiva mira principalmente gestanti, neonati, anziani che immunocompromised individui¹. L. monocytogenes è tra le principali cause di morte da un agente patogeno alimentare negli Stati Uniti e case fatalità tariffe da listeriosi sono alte come 20 – 30%, il più alto per tutti i patogeni di origine alimentare². Nessun vaccino attualmente esiste per L. monocytogenes e la capacità dei batteri di diffondere efficacemente a organi distali e il cervello attraversando l'emato - encefalica (BBB) può portare a pericolose meningite e colonizzazione del cervello^{3 , 4 , 5 , 6}. la meningite batterica è in genere grave; mentre la maggior parte delle persone che ricevono il trattamento recuperano, infezioni possono causare gravi complicazioni, ad esempio, danni cerebrali, perdita dell'udito o difficoltà di apprendimento nei bambini. L. monocytogenes è preveduta per tenere conto di almeno il 10% di tutte le comunità acquisita meningite in US⁷.

Un itinerario importante per diffusione batterica al cervello e meningi è attraverso il flusso sanguigno. I batteri che circolano nei vasi sanguigni nel cervello sono in grado di attraversare la BBB per causare infezione del cervello. La BBB è un sistema altamente vascularized barriera che protegge il cervello da particelle estranee circolanti nel sangue. Cellule endoteliali costituiscono uno strato che riveste la superficie interna dei vasi sanguigni^8,9. Oltre a L. monocytogenes, più batteri patogeni quali Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumoniae, Escherichia colie Haemophilus influenzae di tipo b (Hib) sono in grado di colonizzare il cervello di attraversare la BBB^3,4,5,6. Tuttavia, quando si esaminano gli oneri batterici nel cervello dei topi infettati, è importante determinare che se i batteri hanno attraversato la BBB, altrimenti la carica batterica nel cervello può rappresentare i batteri che sono ancora nei vasi sanguigni del cervello. Pertanto, è necessario di irrorare i topi di tutto il sangue prima di determinare le unità formanti colonie (CFU) degli omogeneati del cervello.

In questo studio, descriviamo i metodi in vivo per esaminare L. monocytogenes infezione del cervello. Per i metodi descritti qui, abbiamo utilizzato il ceppo di L. monocytogenes 10403S. L. monocytogenes 10403S è uno dei ceppi di laboratorio più ampiamente usati per studiare la listeriosi sistemica nel modello murino di infezione¹⁰. Questo protocollo è basato su standard iniezione endovenosa di L. monocytogenes seguita da aspersione dei topi. Una struttura schematica del protocollo infezione nei topi è illustrata nella Figura 1. L. monocytogenes-infetti cervello e altri organi da topi non perfusi o perfusi sono stati raccolti e l'onere di organo batterica determinato. Questi metodi sono utili per determinare non solo la totale colonizzazione batterica del cervello in animali infettati, ma sono anche utili per determinare se i batteri hanno penetrato il BBB in vivo per mediare l'invasione del cervello. È importante sottolineare che questo protocollo di laboratorio dovrebbe essere condotta a seguito della consultazione con rilevanti biosicurezza istituzionali Comitato e animal facility management.

Protocol

Tutti gli animali sono essere mantenute e gestite con la massima cura per minimizzare il disagio nel corso della procedura. La procedura deve essere effettuata in conformità con la cura degli animali istituzionale, uso europeo e tutte le leggi federali, statali e locali. Si noti inoltre che gli esperimenti di laboratorio devono essere condotte conformemente agli orientamenti di livello 2 di biosicurezza.

1. crescita di L. monocytogenes per gli studi di infezione di Mouse

1. Autoclave 500 mL di terreno agar infuso cuore cervello (BHI) in un matraccio di Erlenmeyer 1L per preparare piatti terreni solidi. Lasciare che i supporti raffreddare in un bagno di acqua di 56 ° C e quindi aggiungere streptomicina ad una concentrazione finale di 100 µ g/mL.
   1. Versare 25 mL di media/capsula di Petri in piastre di Petri. Lasciate asciugare a temperatura ambiente (22 ^oC-25 ° C) le piastre. Se necessario, le piastre possono essere essiccate a 37 ° C fino a completa asciugatura.
2. Utilizzando un'ansa da inoculo sterile e tecnica asettica, ottenere un ciclo completo di congelato L. monocytogenes ceppo 10403S^11,12 da una cultura stock congelata in glicerolo di media più il 30% BHI e mantenere in un congelatore a-80 ° C.
   1. Striatura di L. monocytogenes su una BHI agar/streptomicina piastra tale che singole colonie batteriche possono essere isolate. Posizionare le piastre in un incubatore a 37 ° C durante la notte (18 h a 24 h) per far crescere le colonie di L. monocytogenes .
   2. Con un'ansa sterile da inoculo, scegliere una singola colonia di L. monocytogenes da agar BHI piastra e inoculare la Colonia in una provetta sterile contenente 5 mL di brodo BHI contenente 100 µ g/mL di streptomicina.
3. Incubare la provetta di cultura di L. monocytogenes leggermente inclinata a 30 ° durante la notte in un incubatore statico.
   1. Il giorno seguente, ispezionare visivamente la cultura di L. monocytogenes per crescita (media BHI sarà torbidi) e vortex brevemente per garantire una sospensione uniforme della cultura.
   2. Asetticamente rimuovere un'aliquota di 1 mL di coltura batterica e misurare la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) usando uno spettrofotometro.
      Nota: Brodo BHI Sterile viene utilizzato come il vuoto dello spettrofotometro lettura prima di misurare la densità ottica della cultura L. monocytogenes . La cultura di L. monocytogenes può anche essere diluita (due a cinque volte) in BHI prima di leggere la densità ottica.
   3. Determinare il numero di L. monocytogenes unità formanti colonie (CFU) per mL di coltura BHI di placcatura 10 volte diluizioni seriali della cultura. Questo è utile per stabilire una relazione tra la densità ottica della cultura L. monocytogenes e il numero di batteri per mL di cultura. In generale, un OD₆₀₀ di 1.0 per una cultura di L. monocytogenes è uguale a circa 1 x 10⁹ CFU di batteri per mL.

2. preparazione di L. monocytogenes infezione dei topi

1. Diciotto ai ventiquattro ore prima dell'infezione animale, crescere culture di L. monocytogenes in brodo BHI contenente 100 µ g/mL di streptomicina e determinare il OD₆₀₀/ ~ CFU / mL come indicato nel passaggio 1.
   Nota: Topi sono generalmente ordinati una settimana in anticipo di infezione e sono acclimatati all'alloggio degli animali prima dell'infezione vengono eseguiti studi. In questo studio, 6 – 8 settimane vecchi topi BALB/c femminili (5 topi per ogni gruppo) sono stati alloggiati in un ambiente di barriera all'interno della struttura di contenimento animale BSL2 Harvard Medical School-livello e fornito cibo e acqua ad libitum.
2. Determinare la quantità di L. monocytogenes cultura necessaria per infettare ogni mouse basato sul ~ CFU / mL di coltura batterica. Preparare una diluizione della cultura L. monocytogenes in sterile tampone fosfato salino pH 7.2 (PBS) alla concentrazione appropriata di batteri. In genere i topi sono infettati per via endovenosa con 200 µ l di PBS contenente l'1 – 2 × 10⁴ CFU di batteri/animale.
3. Verificare il numero di L. monocytogenes nell'inoculo di placcatura 10 volte diluizioni seriali su piastre di agar BHI contenente 100 µ g/mL di streptomicina. Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C durante la notte per determinare il numero di L. monocytogenes inoculati per topo come segue:
   Inoculo (CFU) = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL placcato x volume (mL) iniettato

3. infezione dei topi con iniezione di L. monocytogenes via endovenosa coda vena

1. Rimuovere i coperchio e cibo bidoni dalla gabbia contenente i topi e posizionare la gabbia sotto una lampada di calore infrarossa 250 W per 5 min.
   Nota: Questo metodo permette le vene di coda dilatare, assicurando che le iniezioni sono più facili da eseguire.
   1. Posizionare con attenzione l'animale in un mouse di dimensione appropriate trattenente dispositivo per trattenere in modo sicuro l'animale durante le iniezioni della vena della coda.
2. Mescolare l'inoculo di L. monocytogenes (punto 2.2) e caricare l'inoculo in una siringa da 1 mL con ago 26 G.
3. Individuare una vena caudale laterale del mouse e pulire il sito di iniezione con un tampone di alcool o uno spray di etanolo di 75%.
4. Iniettare delicatamente il mouse con 200 µ l della sospensione di L. monocytogenes in vena della coda laterale usando la siringa con l'ago 26 G.
   1. Utilizzare garza di cotone per applicare brevemente pressione sul sito di iniezione per bloccare qualsiasi emorragia e metti l'animale in una nuova gabbia.
      Nota: Eseguire questo processo per tutti i mouse per essere iniettato e contrassegnare la gabbia con etichette appropriate. Per determinare la concentrazione di post-iniezione dell'inoculo da L. monocytogenes , ripetere il passaggio 2.3 utilizzando la restante quantità di inoculo. La somministrazione endovenosa dell'inoculo di L. monocytogenes infezione per topo è segnalato come il CFU medio misurato dai campioni di inoculo pre- e post-iniezione.
5. Monitorare quotidianamente gli animali infetti e notare eventuali segni evidenti di malattia (ad es., arruffato pelliccia, postura ricurva, lento movimento, perdita di peso). Rimuovere gli animali che sembrano essere significativamente moribonda prima post-dell'infezione 72h (ad es., 24, 48 ore post-infezione) dallo studio e umanamente sacrificare. Continuare il monitoraggio quotidiano fino a quando tutti i restanti animali sono sacrificati a post-infezione 72 h.
   Nota: La dose letale 50% (LD₅₀) per il ceppo di L. monocytogenes 10403S nei topi BALB/c è ~ 1 – 2 x 10⁴ CFU/animale. Topi infettati con LD₅₀ dosi di L. monocytogenes usando questo protocollo possono presentare segni di malattia, come sopra indicato, e gli investigatori potevano aspettarsi i topi per avviare soccombere all'infezione dopo 72 h post-infezione.

4. dissezione e cardiaco aspersione di topi infettati con L. monocytogenes

1. Presso post-l'infezione 72h (o un punto di anticipo rispetto all'orario desiderato), eutanasia i topi infetti utilizzando un protocollo approvato dal comitato di etica animale istituzionali, come la CO₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale.
   Nota: Se la raccolta del sangue deve essere eseguito, minimizzare la frammentazione dei vasi sanguigni durante l'esecuzione di dislocazione cervicale.
   1. Confermare topi sono stata eutanasia dall'assenza di una risposta di zampa-strappo.
      Nota: Se perfusione cardiaca deve essere eseguito, impostare un sistema automatizzato di pompa/aspersione ad un flusso di volume 4 mL/min.
2. Metti l'animale sul dorso in una padella di dissezione e applicare il 75% di etanolo sulla superficie della pelliccia/pelle addominale.
3. Utilizzando le forbici, fare un'incisione nella parete addominale ed espandere l'incisione per appena sotto la gabbia toracica.
4. Esporre il diaframma e gli organi viscerali.
   Nota: Fare attenzione a non lacerare qualsiasi organi viscerali.
5. Aprire la cavità toracica tagliando il diaframma e tagliare la gabbia toracica bilateralmente per esporre il ventricolo sinistro del cuore.
6. Usando forcipe smussato, afferrare delicatamente il cuore ed inserire un ago a farfalla 21 G collegato ad un sistema di perfusione ventricolo sinistro e poi accuratamente tagliato l'atrio di destra per raccogliere il sangue (~0.2 mL) in una provetta da 2 mL contenente acido etilendiamminotetraacetico 10mm acido (EDTA) per impedire la coagulazione. Un diagramma schematico della perfusione cardiaca nel topo è illustrato nella Figura 2.
   Nota: Se l'aspersione non dev'essere eseguito, sangue può essere raccolto dalla puntura cardiaca utilizzando una siringa da 1 mL e rapidamente trasferito in una provetta da 2 mL, contenenti 10 mM EDTA per prevenire la coagulazione. L. monocytogenes -infettati organi sono poi raccolti come descritto (punto 5.1).
7. Iniziare l'aspersione e irrorare l'animale per 4 min con 15 – 20 mL di PBS contenente 10 mM EDTA.
   Nota: Valutare perfusione osservando il sangue e la soluzione di PBS-EDTA che scorre attraverso l'atrio di destra e nella padella la dissezione. Il cervello ed il fegato apparirà sbollentate dopo perfusione completo garantendo che i batteri rimanenti sono da organi raccolti e non il sangue circolante.

5. traffico di organi e la determinazione degli oneri batterici

1. Aspersione seguente, organi di raccolta (ad es., fegato, milza) rimuovendo con attenzione qualsiasi sistema vascolare e legamenti associati e posto gli organi separatamente in una provetta conica sterile 15 mL contenente 5 mL di sterile freddo (4 ° C) PBS. Conservare i campioni su ghiaccio fino a ulteriore elaborazione si verifica.
2. Per raccogliere il cervello, decapitare la testa dietro le orecchie con le forbici e tagliare la pelle del cuoio capelluto-tra gli occhi dell'animale verso il basso la linea mediana. Se necessario, tagliare il tessuto in eccesso, mantenendo le forbici premute contro il cranio.
   1. Delicatamente, inserire una punta delle forbici il magnum di orifizio (il foro nella base del cranio attraverso il quale passa il midollo spinale) e tagliare lateralmente nel cranio su entrambi i lati.
   2. Delicatamente tagliare il cranio-tra gli occhi il roditore giù la linea mediana, assicurandosi di applicare pressione laterale. Evitare la perturbazione del cervello e mantenere il minimo contatto tra il tessuto cerebrale e le forbici.
   3. Utilizzando pinze a punta fine, aprire il cranio per esporre il cervello e posizionare una spatola tra la parte inferiore del cervello e della base del cranio per rimuovere il cervello.
      Nota: Ciò provoca lacerazione delle fibre nervose del cervello.
   4. Trasferire con cautela il cervello di una provetta conica da 15 mL contenente 5 mL di PBS freddo sterile.
   5. Scartare la carcassa del mouse e ripetere questi passaggi per gli animali restanti.
      Nota: Una volta che tutti gli organi sono state raccolte, pulire la zona di procedura e preparare per l'omogeneizzazione di organo determinare gli oneri batterici.
3. Pulire e sterilizzare la punta di un omogeneizzatore del tessuto nel pensile una biosicurezza inserimento della punta ed eseguendo l'omogeneizzatore per 10 s in sequenza in 5% candeggina, acqua sterile, etanolo di 75%, acqua sterile ogni contenuta in un tubo conico separata da 15 mL.
4. Omogeneizzare il cervello infetto (~ 20 s impostazione 6, massimo rpm) nel tubo conico da 15 mL fino a quando non rimangono frammenti di tessuto visibile.
   1. Pulire l'omogeneizzatore come descritto al punto 5.3 per prevenire batterica riporto contaminazione per il prossimo campione di organo.
   2. Eseguire il processo di omogeneizzazione per tutti gli altri organi (ad es., fegato, milza).
   3. Una volta completato il processo di omogeneizzazione, pulire l'omogeneizzatore come descritto al punto 5.3 e negozio fino al successivo utilizzo.
5. Preparare diluizioni seriali x10 degli omogeneati dell'organo in PBS sterile e piastra le diluizioni su piastre di agar/streptomicina BHI per determinare il CFU per organo.
   Nota: Un metodo simile viene eseguito per determinare il CFU / mL di sangue.
   1. Dopo tutte le diluizioni sono placcate, trasferire le piastre di un incubatore a 37 ° C durante la notte.
   2. Il giorno seguente, contare il numero di colonie su ogni piatto per determinare il numero totale di batteri per organo o mL di sangue come segue:
      Organo/CFU = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL di omogenato placcato x 5
      CFU/mL di sangue = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL di sangue placcato

Results

Il cervello è altamente vascolarizzato e L. monocytogenes è conosciuto per infettare i tipi di cellule presenti nel sangue^3,13. Il protocollo descritto viene utilizzato per dimostrare la capacità di L. monocytogenes di attraversare l'emato - encefalica (BBB) che conduce all'infezione del cervello nei topi. Per determinare se i batteri hanno attraversato il BBB in vivo, l'aspersione del sangue nel topo vi...

Discussion

L. monocytogenes è in grado di causare meningoencefalite pericolosa in esseri umani. Studi precedenti hanno dimostrato la capacità dei batteri di attraversare la barriera emato-encefalica (BBB) e di colonizzare il cervello. Tre percorsi dell'invasione del cervello sono stati proposti durante l'infezione: diretta penetrazione della BBB da batteri, trasporto stealth da batteri contenuti all'interno di cellule mononucleari³e migrazione assonale da ceppi di L. monocytogenes che causa...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mezzo per infusione di cuore cerebrale	Becton Dickinson	237200
Streptomicina solfato	Amresco	0382-50G
Piastre di Petri	VWR	25384-342
Glicerolo	VWR	97062-832
IKA T18 ULTRA-TURRAX Omogeneizzatore di base	IKA	3352109	Modello: Spettrofotometro T18BS1
	Beckman Coulter	DU serie 800
BALB/c Topi	Jackson Laboratory	Modello #000651
Siringhe da 1 ml Becton	Dickinson	309659
aghi da 26 G Becton	Dickinson	305115
aghi a farfalla da 21 g	Becton Dickinson	367281
acido etilendiamminotetraacetico...	Sigma-Aldrich	60004
Provette coniche da 15 mL	VWR	21008-918
Provette a fondo tondo	VWR	60819-546
Soluzione salina tamponata con fosfato	Corning	46-013-CM
Spatola in acciaio inossidabile	VWR	82027-520
Forbici in acciaio inossidabile (6,5 pollici)	VWR	82027-592
Forbici in acciaio inossidabile (4,5 pollici)	VWR	82027-578
Pinza smussata in acciaio inossidabile  (4,5 pollici)	VWR	82027-440
Pinza a punta fine in acciaio inossidabile  (6 pollici)	VWR	82027-406