Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Sommario

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Abstract

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto. Le varie funzioni di queste cellule sono legate alla loro Stati di attivazione, che è anche chiamato polarizzazione. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia del macrofago. È attualmente riconosciuto che un approccio multidimensionale è necessario descrivere come polarizzazione è controllata da segnali ambientali. In questo rapporto, descriviamo un protocollo progettato per ottenere la firma di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Questo protocollo è basato su una quantificazione dell'espressione della proteina del macrofago ottenuto da Lys C/tripsina-digerito lisi cellulare contenuti e frazionati in gel privo di etichetta. Forniamo anche un protocollo basato sulla soluzione in digestione e frazionamento da utilizzare come alternativa di messa a fuoco isoelettrico. Perché la concentrazione di ossigeno è un parametro ambientale rilevante nei tessuti, utilizziamo questo protocollo per esplorare composizione come atmosferica o un ambiente di ossigeno basso colpisce la classificazione di polarizzazione del macrofago.

Introduzione

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto, compresa la rimozione delle cellule apoptotiche e rimodellamento della matrice extracellulare¹. Queste cellule sono caratterizzate da una forte plasticità fenotipica² che si traduce in un molti Stati di attivazione possibili, che sono anche chiamati polarizzazioni. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia di macrofago³. È stato proposto di classificare queste polarizzazioni utilizzando la cosiddetta dicotomia M1/M2, in cui M1 rappresenta pro-infiammatorie e M2 rappresenta i macrofagi infiammatori. Questo modello si adatta bene in varie situazioni patologiche, come le infezioni acute, l'allergia e l'obesità⁴. Tuttavia, in tessuti cronicamente infiammati e cancro, è stato dimostrato che questa classificazione è in grado di cogliere il vasto repertorio fenotipico che i macrofagi presentano in determinati ambienti cellulari^{5,6, 7}. il consenso corrente è che la polarizzazione del macrofago è meglio descritto utilizzando un modello multidimensionale di integrare segnali specifici microambientali⁸. Questa conclusione è stata confermata attraverso l'analisi trascrittomica dei macrofagi umani, mostrando che il modello M1/M2 è inefficiente nel descrivere le polarizzazioni ottenuti⁹.

Lo studio presentato si propone di fornire un protocollo per ottenere le firme di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Descriviamo come differenziare i macrofagi umani negli ambienti dei vari livelli di ossigeno e ottenere peptidi dal macrofago intero proteoma per eseguire una quantificazione privo di etichetta. Questa quantificazione permette il confronto dei livelli di espressione di varie proteine. Come la ricerca sulle cellule staminali ha rivelato l'importanza di ossigeno come un parametro chiave ambientale¹⁰, cerchiamo di capire come questo parametro di tessuto può influenzare la polarizzazione del macrofago in esseri umani. La pressione parziale di ossigeno è stata trovata per gamma da 3 a 20% (del totale pressione atmosferica) nel corpo umano, dove il 20% corrisponde approssimativamente a quello comunemente usato in un'incubatrice di coltura cellulare (il valore esatto è di circa 18,6% durante l'assunzione di presenza di acqua in considerazione).

Il lavoro precedente ha indicato che alveolare differiscono dai macrofagi interstiziali da funzionale e morfologica punto di vista¹¹ e che queste differenze sono probabilmente parzialmente dovuto i livelli di ossigeno differente a cui sono esposte¹². Inoltre, derivate da midollo osseo macrofagi mostrano una maggiore capacità di phagocytize batteri quando esposti ad un ambiente di ossigeno basso¹². L'effetto opposto è stato trovato per macrofagi umani differenziati THP1¹³, ma questi risultati sostengono l'idea che l'ossigeno è un regolatore della biologia del macrofago e che è necessario chiarire questo ruolo a livello molecolare in macrofagi umani. In uno studio precedente, abbiamo applicato un approccio di proteomica per risolvere questi problemi. Misurando i livelli di espressione di migliaia di proteine contemporaneamente, abbiamo messo in evidenza l'impatto di ossigeno sulla polarizzazione e fornito un elenco di nuovi marcatori molecolari. Siamo stati anche in grado di correlare questi risultati per alcune funzioni di macrofagi. In particolare, abbiamo trovato che il tasso di fagocitosi delle cellule apoptotiche aumentava nei macrofagi IL4/IL13-polarizzato, che era legato al upregulation di ALOX15, come rivela l' analisi proteomica¹⁴. Nello studio presente, descriviamo come effettuare tale analisi.

Protocollo

Campioni di sangue umano (LRSC) da donatori sani, de-identificati sono stati ottenuti da EFS (servizio nazionale di sangue francese) come parte di un protocollo autorizzato (CODECOH DC-2018 – 3114). I donatori hanno dato il consenso firmato per l'uso di sangue.

1. Media e preparazione di Buffer

1. Preparare il supporto di macrofago [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA)] e riscaldarla a 37 ° C.
2. Preparare il macrofago medium + 10% di siero umano dal plasma AB (SAB), filtrare (filtro di 0,22 µm), poi riscaldarla a 37 ° C (indicato come macrofago medium + 10% SAB in appresso).
3. Preparare il tampone di ordinamento [1 x tamponato fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina di siero bovino (BSA) + acido etilendiamminotetracetico 2mm (EDTA)], filtrare (filtro di 0,22 µm) e mantenerla a 4 ° C.

2. isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) dalla camera di Leukoreduction System (LRSC)

1. Mettere 15 mL di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità (Vedi Tabella materiali) in un mL 50 centrifugazione tubo quindi può scaldare a temperatura ambiente (TA) prima di ricevere il LRSC.
   Nota: Densità dipende dalla temperatura. Come questo prodotto è conservato a 4 ° C, questo passaggio deve essere fatto in anticipo in modo che può equilibrare a RT.
2. Svuotare il LRSC in una provetta di centrifugazione di 50 mL, aggiungere fino a 50 mL di PBS 1X e mescolare. Molto lentamente, aggiungere 25 mL della miscela preparata durante passaggio 2.2 sopra 15 mL di soluzione di gradienti di densità riscaldato durante passaggio 2.1.
   Nota: Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio. Il sangue deve essere aggiunto alla soluzione gradienti di densità senza alcuna dispersione di questa fase.
3. Centrifugare entrambi tubi di centrifugazione per 25 min a 700 x g senza interruzioni.
   Nota: Al termine della centrifugazione in gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono: gli eritrociti e granulociti formando il pellet, fase di soluzione gradienti di densità, strato di PBMCs e nel plasma.
4. Con una pipetta, passare attraverso la fase di plasma senza aspirazione si e raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione di 50 mL. Aggiungere fino a 50 mL di 1X PBS in PBMCs come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
5. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 40 mL di terreno del macrofago.

3. magnetico etichettatura e isolamento di CD14⁺ cellule (monociti)

1. Contare i PBMCs in una camera di Malassez. Prelevare la quantità di PBMCs necessarie per condurre l'esperimento (in genere 100-300 x 10⁶ cellule), inserirli in un tubo di centrifugazione e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.
2. Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 80 µ l di buffer di ordinamento preparato durante il passaggio da 1.3 a 10⁷ PBMCs. aggiungere 20 µ l di microsfere di CD14 ogni 10⁷ PBMCs. Mix ed incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione costante.
3. Aggiungere 1 mL di tampone a 10⁷ PBMCs di ordinamento come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone per 10⁸ PBMCs di ordinamento.
4. Posto una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna sciacquandolo con 3 mL di tampone di ordinamento.
5. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna. La colonna dipende dal numero di cellule per essere isolato (qui, LS colonne per fino a 10⁹ PBMCs vengono utilizzate). Raccogliere il flusso continuo contenenti celle adenoide.
   Nota: A partire da questo passaggio, tutti i tubi (selezioni positivi e negativi) sono conservati per più tardi il controllo delle diverse fasi tramite flusso cytometry.
6. Lavare la colonna con 3 x 3 mL di tampone di ordinamento. Raccogliere le cellule senza etichetta, passando attraverso il tubo stesso dal passaggio 3.12. Eseguire i passaggi di lavaggio dal buffer di ordinamento aggiungendo, essere attenti a non far asciugare la vostra colonna. Posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore.
7. Pipettare 5 mL di tampone di ordinamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Per aumentare la purezza del CD14⁺ cellule, la frazione eluita è arricchita nel corso di una seconda colonna.
8. Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.7 con una nuova colonna.

4. placcatura dei monociti

1. Contare i monociti in una camera di Malassez. Verificare la purezza del CD14⁺ cellule tramite flusso cytometry. Prelevare la quantità di monociti necessari per l'esperimento e metterli in un tubo di centrifugazione.
2. Centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet di monociti nel mezzo del macrofago. Le cellule del piatto e lasciarli accontentarsi di 50 min a 1 h. aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di macrofago + 10% SAB + 25 ng/mL del macrofago stimolante le colonie di fattore (M-CSF) per indurre la differenziazione.

5. polarizzazione dei macrofagi al giorno 6

1. Aspirare il mezzo. Sostituirlo con del macrofago medium + 10% SAB con vari stimoli. Ad esempio, aggiungere 10 ng/mL interferone gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per ottenere la polarizzazione M1, o 20 ng/mL interleuchina 4 (IL4) + 20 ng/mL interleuchina 13 (IL13) per polarizzazione M2.
   Nota: La stimolazione può essere eseguita tra 24 e 48 h prima di procedere ad altri test.
2. Raccogliere le cellule utilizzando una soluzione distaccante o un raschietto di cella.

6. cella cultura in condizioni di ossigeno basso

1. A partire dal passaggio 4, mantenere i monociti e quindi macrofagi in un ambiente di ossigeno controllato per eseguire l'analisi in condizioni di ipossia. Utilizzare una stazione di lavoro di ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento.
   Nota: Quando si lavora sotto pressione bassa dell'ossigeno, è importante preparare tutti i supporti e buffer di lavaggio sotto la stazione ed attendere sufficientemente per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Ad esempio, 10 mL di PBS in un 60mm di Petri richiede circa 2 ore per raggiungere 25 mmHg per la pressione parziale di O₂ a partire da pressioni atmosferiche (come abbiamo misurato utilizzando un sensore a fibra ottica). In molte stazioni ipossiche o incubatori, la pressione dell'ossigeno è impostata come una percentuale della pressione atmosferica. Se le misure precise sono necessari, è preferibile utilizzare una stazione che autorizza per impostare direttamente la pressione dell'ossigeno in mmHg.

7. Lisi e digestione In-Gel (protocollo 1)

Nota: In questa e nelle sezioni seguenti, sono descritti due protocolli utilizzati per ottenere peptidi ed eseguire analisi LC-MS/MS. Protocollo n. 1 vengono descritti lisi cellulare e frazionamento in gel e digestione e protocollo 2 lisi delle cellule in soluzione, seguita da digestione in soluzione e frazionamento utilizzando un metodo di messa a fuoco isoelettrico.

1. Eseguire lisi cellulare nel Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glicerolo, 33,3% (v/v) β-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0,2% p/v]. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide bis-Tris di 4-12%.
2. Controllare la durata della migrazione elettroforetica per consentire ogni campione della proteina sia suddiviso in 6 gel bande come esemplificato nella Figura 3.
3. Fissare il gel con una soluzione di fissaggio (30% etanolo + acido acetico 7.5% per 20 min), quindi aggiungere la soluzione colorante (R-250 Coomassie blu per 45 min). Aggiungere la soluzione decolorante (30% etanolo + 7,5% acetico finché non vengono visualizzate bande) prima di asportare le bande proteiche con un bisturi pulito.
4. Tagliare a dadini ogni banda asportato prima introduzione in tubi di 500 µ l. Una superficie di vetro pulita è autorizzata per evitare la contaminazione con le cheratine (soluzione SDS al 5% in acqua deionizzata può essere utilizzato per pulire le superfici).
5. Lavare le fette del gel 3 volte in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM per 20 min a 37 ° C, seguita da un lavaggio in bicarbonato di ammonio di 25 mM e acetonitrile (50% v/v). Disidratare i pezzi di gel con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.
6. Incubare ogni pezzo di gel con 10 mM DTT (dithiothreitol) in bicarbonato di ammonio di 25mm per 45 min a 56 ° C (200 µ l), seguita da iodoacetamide 55 mM a 25 mM di bicarbonato di ammonio (200 µ l) per 35 min al buio a TA.
7. Per interrompere alchilazione, Incubare ogni pezzo di gel con 200 µ l di 10 mM DTT in bicarbonato di ammonio di 25 mM per 10 min a RT. Wash i pezzi di gel in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM, quindi disidratare con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.
8. Digerire le proteine durante la notte a 37 ° C con tripsina/Lys-C mix secondo le istruzioni del produttore.
9. Estrarre i peptidi risultanti da pezzi gel aggiungendo 50 μL di 50% acetonitrile per 15 minuti, poi 50 μL di acido formico al 5% per 15 min e infine, 50 μL di 100% acetonitrile per 15 min. piscina e asciugare ogni frazione in tubi di basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e perdita del campione. Conservare i campioni a-80 ° C fino a ulteriori analisi.

8. proteine estrazione e digestione In soluzione (protocollo n. 2)

1. Eseguire la lisi cellulare (2 x 10⁶ cellule) con 150 µ l di buffer di lisi seguenti:
   1. 7m urea, 2m tiourea, 40 mM Tris e 4% CHAPS, completati con inibitori della proteasi (mini completa, inibitore della proteasi EDTA-free cocktail).
2. Omogeneizzare le soluzioni per 30 min a RT con un agitatore. Centrifugare a 13.800 x g per 20 min RT e mantenere il supernatante.
3. Rimuovere i contaminanti con un kit di pulizia 2D:
   1. Il kit contiene soluzione precipitante, soluzione co-precipitante, tampone di lavaggio e lavaggio additivo.
   2. Aggiungere 300 µ l di soluzione precipitante e mescolare bene. Incubare in ghiaccio per 15 min. aggiungere 300 µ l di soluzione di co-precipitante. Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 x g per 5 min. Una piccola pallina dovrebbe essere visibile. Procedere rapidamente alla fase successiva per evitare risospensione o dispersione del pellet. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet.
   3. Centrifugare le provette nuovamente con il tappo-cerniera e pellet rivolta verso l'esterno per portare il liquido rimanente alla parte inferiore del tubo. Un breve impulso è sufficiente. Non ci dovrebbe essere nessun liquido rimanente visibile nei tubi.
   4. Senza disturbare il pellet, aggiungere 40 µ l di soluzione di co-precipitante. Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare per 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il lavaggio. Aggiungere 25 µ l di acqua deionizzata. Vortexare ciascuna provetta per 5-10 s. Il pellet dovrebbe disperdersi ma non si dissolve in acqua.
   5. Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (pre-raffreddato per almeno 1 h a-20 ° C) e 5 µ l di additivo di lavaggio. Vortice fino a quando la pallina è completamente dispersa. Incubare le provette a-20 ° C per almeno 30 min. Vortex per 20-30 secondi ogni 10 min
      Nota: I tubi sono memorizzabili a-20 ° C fino a 1 settimana con degradazione minima della proteina o la modifica.
   6. Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 × g per 5 min. con attenzione rimuovere e scartare il surnatante. Una pallina bianca dovrebbe essere visibile. Lasciar il pellet airdry per non più di 5 min (se troppo asciutto, che sarà difficile risospendere il pellet).
4. Risospendere il pellet di proteina in 300 µ l di bicarbonato di ammonio di urea e 0,1 M 8 M. Vortice fortemente per 1 min. determinare la concentrazione di proteine utilizzando un saggio colorimetrico.

9. in-soluzione digestione (protocollo n. 2)

1. Ridurre i ponti disolfuro aggiungendo 5,1 µ l di una soluzione acquosa di 700 mM DTT (concentrazione finale 12,5 mM) per le proteine sedimento da passaggio di 8,4 e incubare a 37 ° C per 30 min con un agitatore. Alchilata residui di cisteina aggiungendo 20,3 µ l di una soluzione acquosa di iodoacetamide 700mm (concentrazione finale 40 mM) e incubando a 25° C per 30 min al buio con un agitatore.
2. Aggiungere 990 µ l di bicarbonato di ammonio 0,1 M al campione. Aggiungere un volume corrispondente di tripsina/Lys-C mix (substrato enzimatico: rapporto 1: 100 w/w). Incubare a 37° C durante la notte con un agitatore.

10. pulizia cartuccia (protocollo n. 2)

1. Bagnare una cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di metanolo. Pulire la cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di acqua di 80% acetonitrile/HPLC-grado e scartare il flusso continuo. Equilibrare la cartuccia con 4 colonna-volumi (4 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0,1% e scartare il flusso continuo.
2. Acidificare campioni con 90 µ l di acqua a pH 2-3 (controllare il pH con un indicatore di pH) o 10% acido formico. Caricare i campioni acidificati e raccogliere il flusso continuo. Ricaricare il flusso continuo (contenente i peptidi non-mantenuta). Lavare la cartuccia con colonna-volume 6 (6 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0.1%.
3. Eluire peptidi dalla cartuccia con 1 colonna-volumi (1 mL) di acqua di acetonitrile/HPLC-grado acid/50% formico 0.1%. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Concentrare il campione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto a 160 mBar).

11. frazionamento mediante focalizzazione isoelettrica (protocollo n. 2)

Nota: I peptidi sono separati secondo loro punti isoelettrici utilizzando un frazionatore di gel off su una striscia di 13 cm che copre un range di pH da 3 a 10. Abbiamo usato il seguente protocollo fornito dal fornitore (riassunto di seguito):

1. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione (600 µ l di soluzione di glicerolo, 60 µ l di tampone OFFGEL, 4,34 mL di acqua ultrapura) e soluzione B (1,776 mL di soluzione A) e 444 µ l di acqua ultrapura.
2. Assemblare le strisce IPG, cornici ed elettrodi secondo le istruzioni del produttore.
3. Risospendere il campione con 1,8 mL di soluzione B. aggiungere 40 µ l di soluzione B in ciascun pozzetto. Caricare 150 µ l di campione in ciascun pozzetto.
4. Selezionare il metodo di default per i peptidi: OG12PE00 (metodo di default OFFGEL per peptidi per l'utilizzo con un 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-pozzetti fotogrammi. Attendere che questo metodo è stato completato (~ 20 h). Raccogliere le frazioni in tubi correttamente etichettati.

12. pulizia Harvard Apparatus colonna inversa C18 Post-IEF (protocollo n. 2)

1. Aggiungere progressivamente μL pochi alla volta dell'1% TFA in acqua deionizzata per ogni frazione di acidificare il campione. Verifica tramite carta di pH il pH è circa 3 o inferiore.
2. Preparare le seguenti soluzioni: soluzione 1 (5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 4,99 mL di acqua ultrapura) e soluzione 2 (0,5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 9,49 mL di acqua ultrapura).
3. Pre-bagnato la colonna di spin con 150 µ l di soluzione 1. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare la colonna di spin con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.
4. Passare la frazione attraverso la colonna. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.
5. Eluire la frazione con 50 μL di soluzione 1. Centrifuga per 90 s a 750 x g. Ripetere la procedura una volta di più.
6. A secco-frazione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto 160 mBar) e conservare a-80 ° C

13. analisi dei dati di proteomica e bioinformatica¹⁸

1. Analizzare i dati ottenuti da un nano-LC-MS/MS utilizzando il motore di ricerca di Andromeda e quantificazione software come MaxQuant (versione 1.5.2.8) di spettrometro di massa.
2. Impostare tasso di falsi scoperta (FDR) all'1% per una lunghezza minima di 7 aminoacidi e proteine e peptidi. Impostare la specificità degli enzimi come C-terminale di Arg e Lys. Consentire 2 fenditure perse alle obbligazioni di prolina. Selezionare carbamidomethylation di cisteina come una variante fissa e ossidazione N-terminale della proteina acetilazione e metionina come variabile modifiche.
3. Analizzare ulteriormente i dati con software di analisi statistica. Eseguire un'analisi di arricchimento funzionale utilizzando il software FunRich (www.funrich.org/). Eseguire un'analisi di arricchimento di ontology del gene utilizzando software di DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).

Risultati

A partire da cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs) ottenute per centrifugazione differenziale, il protocollo consente l'ottenimento di una popolazione di CD14⁺ monociti con un valutati purezza superiore al 98% da citometria a flusso (Figura 1). Questi monociti sono secondariamente differenziati verso varie polarizzazioni (Figura 2). Quando viene scelto un frazionamento su gel, la migrazione su gel di SDS-pa...

Discussione

Perché la proteomica è un potente strumento per studiare l'espressione di proteine differenti da una cellula intera o compartimenti subcellulari, ottimizzazione del protocollo lisi cellulare e digestione delle proteine è stati affrontati da una serie di studi. Ci sono tre classi principali di metodi, che includono la digestione in-gel (digestione delle proteine nella matrice del gel di poliacrilammide)¹⁷, digestione in soluzione¹⁸ e filtro-aided campione preparazione

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Stazione di lavoro per ipossia	Oxford Optronix	Hypoxylab
C6 Citometro a flusso	BD	Accuri C6
Urea	Agilent Technologies	5188-6435
Acido formico (FA)	ARISTAR	450122M
R-250 Coomassie blue	Biorad	1.610.436
Lipopolisaccaride, E.Coli (LPS)	Kit di pulizia 2D Calbiochem	437627
	GE Healthcare	80-6484-51
RPMI 1640 medium, integratore di glutamax	Gibco	61870044
HEPES 1 M	Gibco	15630-080
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA) 100X	Gibco	11140-035
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X	Gibco	14190-094
Colonna per apparecchi Harvard Colonna per micro spin C18 inversa	Apparecchio Harvard	74-4601
EDTA 0,5 M, pH 8,0	Invitrogen	AM9260G
NuPAGE Bis-Tris 4-12%	Life Technologies SAS	NP0321 BOX
CD14 Microsfere	Miltenyi umano Biotec	130-050-201
Colonna di separazione MACS LS	Miltenyi Biotec	130-042-401
Fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF)	Miltenyi Biotec	130-096-485
Interleuchina 4 (IL4)	Miltenyi Biotec	130-093-917
Interleuchina 13 (IL13)	Miltenyi Biotec	130-112-410
Interferone gamma (INFγ)	Miltenyi Biotec	130-096-482
CD14-FITC (clone TÜ K4)	Miltenyi Biotec	130-080-701
MACSmix Rotatore di provette	Miltenyi Biotec	130-090-753
Acido trifluoroacetico (TFA)	Pierce	28904
Trypsin/Lys-C Mix	PROMEGA	V5073
Mini completo cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA	Roche	11836170001
Soluzione a gradiente di densità ( Histopaque 1077)	Sigma Aldrich	10771-100ML
Accumax	Sigma Aldrich	A7089-100ML
Siero umano da plasma AB maschile umano (SAB)	Sigma Aldrich	H4522-100ML
Siero bovino Albumina (BSA) soluzione 30%	Sigma Aldrich	A9576-50ML
Trisma-base	Sigma Aldrich	T1503
Glicerolo	Sigma Aldrich	49767
β-Mercaptoetanolo	Sigma Aldrich	M3148
Blu di bromofenolo	Sigma Aldrich	114405
Sodio Dodecil Solfato (SDS) 20%	Sigma Aldrich	5030
Bicarbonato di ammonio	Sigma Aldrich	9830
Acetonitrile	Sigma Aldrich	34888
Ditiotreitolo	Sigma Aldrich	43819
Iodoacetammide	Sigma Aldrich	57670
Tiourea	Sigma Aldrich	T8656
CHAPS	Sigma Aldrich	C9426
Kit di dosaggio Micro BCA	ThermoFisher	23235
Pipetta sterile in plastica da 5 ml	VWR	612-1685
Thermomixer C Eppendorf	VWR	460-0223
Sep-Pak tC18 cartucce di fase inversa, 100 mg	Waters	WAT036820