Qui, presentiamo un metodo per la distribuzione di vettori di espressione virale nel cervello utilizzando seta fibroin film. Questo metodo consente la somministrazione mirata di vettori di espressione utilizzando fibre ottiche rivestite di seta/AAV, fibre ottiche coniche e windows cranica.
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Articolo metodologico
In Vivo Mirati espressione delle proteine di optogenetica utilizzando seta/AAV film
In questo articolo
Sommario
Abstract
La ricerca per comprendere i circuiti neurali come informazioni di processo in ordine per pilotare l'uscita comportamentale sono stata notevolmente facilitate da recentemente sviluppato metodi ottici per manipolare e monitoraggio dell'attività dei neuroni in vivo. Questi tipi di esperimenti si basano su due componenti principali: 1) impiantabili che forniscono accesso ottico al cervello e proteine 2) sensibili alla luce che cambiare l'eccitabilità neuronale o forniscono una lettura dell'attività neuronale. Ci sono un certo numero di modi per esprimere proteine sensibili alla luce, ma iniezione stereotassica di vettori virali attualmente è l'approccio più flessibile perché espressione può essere controllato con precisione genetica, anatomica e temporale. Nonostante la grande utilità di vettori virali, consegnando il virus al sito di ottica impianti pone numerose sfide. Iniezioni di virus stereotassiche chiedono interventi che aumentano il tempo chirurgico, aumentano il costo degli studi e costituiscono un rischio per la salute dell'animale. Il tessuto circostante può essere fisicamente danneggiato dalla siringa di iniezione e da immunogeno infiammazione causata dalla brusca somministrare un bolo di alto-titolo virus. Allineando le iniezioni con gli impianti ottici è particolarmente difficile quando la destinazione è piccole regioni profondità nel cervello. Per superare queste sfide, descriviamo un metodo per il rivestimento di più tipi di protesi ottiche con film composto di seta fibroin e Adeno-associato di vettori virali (AAV). Fibroina, un polimero derivato dal bozzolo del Bombyx mori, possibile incapsulare e proteggere biomolecole e possono essere trasformati in forme che vanno dalle pellicole solubile alla ceramica. Quando sono impiantati nel cervello, seta/AAV rivestimenti rilasciare virus all'interfaccia tra elementi ottici e cervello circostante, guida espressione proprio dove serve. Questo metodo viene implementato facilmente e promette di facilitare notevolmente gli studi in vivo della funzione del circuito neurale.
Introduzione
Nell'ultimo decennio ha prodotto un'esplosione di proteine ingegnerizzate sensibili alla luce per il monitoraggio e manipolare l'attività neurale1. Virus offrono una flessibilità senza paragoni per esprimere questi strumenti optogenetica nel cervello. Confrontato agli animali transgenici, virus sono molto più facili da produrre, trasportare e conservare, garantendo una rapida implementazione dei più recenti strumenti optogenetica. Espressione può essere mirata geneticamente distinte popolazioni neuronali, e virus progettato per il trasporto retrogrado può essere utilizzato anche per espressione basata su connettività neuronale....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che coinvolgono gli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato permanente di Harvard su Animal Care seguenti linee guida descritte nella NIH ci Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio. Per tutti gli esperimenti sono stati utilizzati topi C57BL/6 adulti di entrambi i sessi (6-15 settimane di età).
1. ottenere acquosa seta Fibroin
- Preparare o acquistare acquosa seta fibroin (5-7,5% w/v).
2. Mix seta acquosa con vettori di espressione di AAV
- Scegliere un vettore di espressione di AAV per guidare la proteina optogenetica o....
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Risultati
Per valutare il successo delle pellicole di seta/AAV in espressione di guida, abbiamo irrorato animali 2-3 settimane dopo l'impianto e preparato fette del cervello dalla regione di interesse. Immagini di fluorescenza del fluoroforo-etichetta optogenetica proteine (ChR2-YFP) fornirono una misura del grado di espressione (Figura 1). Fibre ottiche tipiche (230 µm di diametro) può facilmente ospitare 200 nL di seta/AAV. Con la pratica, gli sperimentatori possono .......
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Discussione
L'uso di seta/AAV per indirizzare l'espressione delle proteine optogentic supera i limiti degli approcci che sono attualmente in uso. Anche se molti studi correttamente utilizzano iniezioni di AAV per esprimere proteine optogenetica, è difficile da allineare espressione fino alla punta delle fibre ottiche, alle regioni intorno alla lunghezza delle fibre conici e nella regione di visualizzazione di una lente GRIN. A causa di disallineamento tra componenti ottici ed espressione optogenetica, iniezioni stereotassiche posson.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desiderano ringraziare J. Vazquez per illustrazioni, d. Kaplan e C. Preda per reagenti e indicazioni utili e i laboratori del B. Sabatini e C. Harvey per l'imaging in vivo . La microscopia è stato reso possibile da M. Ocana e il centro di formazione immagine di neurobiologia, sostenuta in parte dal centro di Imaging neurale come parte di un Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS) P30 Core Center concedere (NS072030). Questo lavoro è stato sostenuto il GVR Khodadad Family Foundation, la Fondazione di Nancy Lurie Marks e dalle sovvenzioni NIH, NINDS R21NS093498, U01NS108177 e R35NS097284 di NINDS a W.G.R e da un postdoctoral fell....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fibroina acquosa di seta | Sigma | 5154-20ML | Fibroina acquosa di seta (5% p/v) per la produzione di film |
| Microiniettore per depositare seta/AAV | Drummond | 3-000-207 | Iniettore di nanolitri Nanoject III |
| Manipolatore per trattenere gli impianti | Narashige | MM-33 | Micromanipolatore |
| Stereoscopio per visualizzare i depositi di seta | AmScope | SM-6TX-FRL | Microscopio zoom articolare trinoculare 3,5X-45X con luce anulare |
| Camera a vuoto per conservare gli impianti | Ablaze | N/A | Camera di degasaggio sottovuoto da 3,5 quarti |
| Porta impianto opzionale per la conservazione | N/A | N/A | Per conservare le fibre ottiche prefabbricate, praticare una griglia di fori profondi ~4 mm con un diametro appena più grande del diametro della ghiera in un blocco di plastica. |
| Fibra ottica | Thorlabs | FT200EMT | Ø 200 µ m Core Fibra ottica multimodale per impianti in fibra |
| Ghiere | Kientec | FZI-LC-230 | LC Ghiera in zirconia per impianti in fibra |
| Vari materiali per la produzione di impianti in fibra cronica | Vari | N/A | Per la procedura dettagliata, vedere Ung K, Arenkiel BR. Impianto in fibra ottica per la stimolazione optogenetica cronica del tessuto cerebrale. Giornale di esperimenti visualizzati: JoVE. 2012(68). |
| Impianti in fibra affusolata | Optogenix | Lambda-B | Impianti in fibra conica Lenti |
| GRIN | GoFoton | CLH-100-WD002-002-SSI-GF3 | Lenti GRIN |
| Piccole finestre craniche in vetro | Warner | 64-0726 (CS-3R-0)Piccolo | vetro rotondo di copertura, spessore #0 |
| Grandi finestre craniche in vetro | Warner | 64-0731 (CS-5R-0) | Piccolo vetro di copertura rotondo, spessore |
| #0Vari materiali per la produzione di finestre craniche | Vari | N/A | Per la procedura dettagliata, vedere Goldey GJ et al. Finestre craniche rimovibili per l'imaging a lungo termine in topi svegli. Protocolli della natura. novembre 2014; 9(11):2515. |
Riferimenti
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).
- Tervo, D. G., et al. A Designer AAV Variant Permits Efficient Retrograde Access to Projection Neurons. Neuron. 92....
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Ristampe e permessi
