Articolo metodologico
In precedenza abbiamo usato un ibrido del peptide di nanoparticelle d'oro per consegnare per via endovenosa un peptide sintetico, inibitore della protein chinasi C-delta, che ha ridotto la lesione di polmone acuta indotta da ischemia-riperfusione. Qui vi mostriamo il protocollo dettagliato della formulazione di droga. Altri peptidi intracellulare possono essere formulate allo stesso modo.
Inibitore della protein chinasi C-delta (PKCδi) è un farmaco promettente per evitare ferita indotta da ischemia-riperfusione dell'organo. Esso è solitamente coniugato ad un peptide cellula-penetrante, TAT, per consegna intracellulare. Tuttavia, TAT ha dimostrato attività biologiche non specifici. Nanoparticelle di oro (PNL) possono essere utilizzate come trasportatori di farmaci consegna senza tossicità riconosciuta. Di conseguenza, abbiamo usato un ibrido GNP/peptide per fornire PKCδi. Due brevi peptidi (P2: CAAAAE e P4: CAAAAW), con un rapporto di 95: 5, sono stati utilizzati per modificare le proprietà di superficie del PNL. PNL coniugato con PKCδi (GNP/PKCi) sono stabili in acqua distillata, 0,9% NaCl e tampone fosfato salino (PBS) contenente albumina di siero bovino o siero bovino fetale. L'iniezione endovenosa di GNP-PKCi precedentemente è stato indicato per impedire l'ischemia-riperfusione del polmone. Questo articolo descrive un protocollo per formulare GNP/PKCi e valutare le proprietà chimico-fisico di GNP/PKCi. Abbiamo usato metodi simili per formulare altri farmaci peptidici con PNL. In questo articolo si spera attirerà più attenzione a questa tecnologia di consegna di droga novella intracellulare e sue applicazioni in vivo.
Trapianto del polmone Salva i pazienti con stadio finale del polmone malattia1. Tuttavia, le complicazioni serie dopo trapianto del polmone rimangono un ostacolo. Nelle prime fasi dopo il trapianto del polmone, disfunzione dell'innesto primario è il più nocivo di complicazione1, e la sua causa primaria è l'ischemia-riperfusione (IR)-indotta di lesione polmonare acuta2.
Sotto conservazione freddo, metabolismo in un polmone di donatore è limitato ad un livello molto basso. Tuttavia, specie reattive dell'ossigeno e sintesi di ossido nitrico sono attivati a causa la cessazi....
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1. preparazione delle soluzioni di Peptide
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Cura dovrebbe essere presa per valutare le proprietà biofisiche del GNP/PKCi ibrido, come GNP tende ad aggregare in solvente. Quando GNP è aggregato, il colore della soluzione cambia dal rosa al viola (Figura 1a). Spettrofotometro UV-Vis è in grado di rilevare i cambiamenti più sensibile. Se non è aggregato il GNP/PKCi il picco di assorbimento dovrebbe essere a 525 nm (Figura 1b). Se il PNL è aggregato, il picco di assorbimento s.......
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Per garantire la corretta formulazione, è fondamentale che la soluzione di δPKCi subisce il passo di sonicazione delineato in 1.6. Sequenza del peptide δPKCi contiene molecole idrofobiche, quindi un sonicatore assiste nello sciogliere PKCi nella soluzione 50% acetonitrile. Inoltre, è molto importante mescolare il solvente meticolosamente, come indicato al punto 2.7. L'ibrido di GNP/PKCi non sarà formulato anche se questi passaggi non vengono eseguiti correttamente, a causa l'aggregazione del peptide δPKCi
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Gli autori non hanno nulla di divulgare su questo progetto.
Questo lavoro è sostenuto da sovvenzioni di ricerca da istituti canadesi di ricerca sanitaria (PJT-148847), Ministero della ricerca e dell'innovazione dell'Ontario (RE-08-029) e Canada prima di eccellenza programma di ricerca, medicina di Design all'Università di Toronto. Dr. Mingyao Liu è James e Mary Davie sedia in Lung Injury, riparazione e rigenerazione.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| peptide dell'acido glutammico caricato negativamente (P2) | CanPeptide | Sequenza: CAAAAE-NH2 Lunghezza: 6aa Modifica: C-terminale amidation Quantità: 50mg Purezza: >95% | |
| peptide triptofano idrofobico (P4) | CanPeptide | Sequenza: CAAAAW-NH2 Lunghezza: 6aa Modifica: C-terminale amidation Quantità: 50mg Purezza: >95% | |
| δ Peptide PKCi | CanPeptide | Sequenza: CSFNSYELGSL-NH2 Lunghezza: 11aa Modifica: C-terminale amidation Quantità: 50mg Purezza: >95% | |
| Tubo conico (50ml) | Corning Life Sciences | 3582070 | |
| Tubo conico (15ml) | Corning Life Sciences | 3582096 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 271004-100ML | |
| Sonicatore | Branson Ultrasonics Corp. | Branson 2510MTH | |
| Microtube | Diamed.ca | AD 150-N | |
| Soluzione di nanoparticelle d'oro | Ted Pella | 15705-5 | Una dimensione delle particelle è 20nm |
| Agitatore a piattaforma oscillante | VWR internazionale | 40000-304 | |
| Microcentrifuga | Eppendorf | 5417R | |
| Cuvetta in acrilico | SARSREDT | 67.758 | |
| Spettrofotometro UV-Vis | Agilent | Caty 60 UV-Vis |
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