Articolo metodologico

Alta velocità effettiva In Vitro valutazione della latenza inversione agenti sulla trascrizione di HIV e Splicing

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DOI:

10.3791/58753

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22 gennaio 2019

 , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne

In questo articolo

Sommario

Un protocollo di throughput elevato per la valutazione funzionale di riattivazione efficiente HIV e clearance del provirus latenti è descritto e applicato dalla prova dell'impatto di interventi sulla trascrizione di HIV e di splicing. Risultati rappresentativi dell'effetto di latenza inversione agenti sulla trascrizione LTR-driven e splicing sono forniti.

Abstract

L'HIV rimane incurabile a causa dell'esistenza di un serbatoio di cellule che nutre forma stabile e latente del virus, che rimane invisibile al sistema immunitario e non è mirato dall'attuale terapia antiretrovirale (cART). Trascrizione e splicing sono stati indicati per rafforzare la latenza di HIV-1 nelle cellule T CD4 + di riposo. Inversione di latenza mediante l'uso di agenti di inversione di latenza (LRA) nell'approccio "shock and kill" è stata studiata estesamente nel tentativo di eliminare questo serbatoio ma finora non ha dimostrato alcun successo negli studi clinici a causa della mancanza di sviluppo di piccoli adeguato molecole che possono perturbare in modo efficiente questo serbatoio. Il protocollo qui presentato fornisce un metodo per attendibilmente ed efficientemente valutare gli agenti di inversione di latenza (LRA) sulla trascrizione di HIV e giunzione. Questo approccio si basa sull'uso di un reporter di doppio colore LTR-driven che consente di misurare contemporaneamente l'effetto di un LRA sulla trascrizione e splicing tramite flusso cytometry. Il protocollo descritto qui è adeguato per le celle aderenti, come pure le cellule in sospensione. È utile per il testing di un gran numero di farmaci in un sistema di alta velocità di trasmissione. Il metodo è tecnicamente semplice da implementare ed economicamente vantaggiosa. Inoltre, l'uso di citometria a flusso permette la valutazione di attuabilità delle cellule e così droga tossicità allo stesso tempo.

Introduzione

Nonostante la terapia antiretrovirale a lungo termine efficace HIV persiste in uno stato latente come un provirus integrato in memoria di cellule T CD4 +1. La struttura della cromatina del HIV-1 5' promotore di ripetizione terminale lunga (litro) e modificazioni epigenetiche come metilazione dell'istone e deacetilazione di methyltransferases del DNA (DNMT) e istone deacetilasi (HDAC) sono importanti meccanismi che conducono alla repressione trascrizionale e così post-integrazione latenza2,3. Una grande varietà di agenti inversione di latenza (LRA) è stata studiata per la loro efficacia per indurre la produzione di virus in vitro e in vivo da latente infettati riposo T CD4 + cellule4,5,6,7 ,8. Tra gli enti locali e regionali testato, HDACi (inibitori HDAC) e scommessa bromodomain inibitori (BETis) inducono decondensazione della cromatina e rilascio della trascrizione positivo allungamento fattore b (P-TEFb) rispettivamente, che porta a successive alleviare il trascrizionale repressione a 5' LTR e attivazione di HIV espressione9,10,11,12,13. Tuttavia, la grandezza della riattivazione raggiunta da questi enti era limitata, come è stato osservato solo un modesto aumento associato unspliced HIV mRNA (RNA noi), indicativo della trascrizione virale, ex vivo14,15. D'importanza, questi enti anche non è riuscito a indurre una riduzione della frequenza delle cellule latente infettate.

L'espressione di HIV può essere ulteriormente limitata da splicing inefficiente16 , nonché i difetti in export nucleare di moltiplicare impiombato HIV RNA (RNA MS)17. Così, sono necessari identificazione nuove classi di enti locali e regionali che sono più potenti e possono interessare diversi aspetti di post-integrazione produzione del virus. Inoltre, lo sviluppo di nuovi saggi che aiutano a definire i composti ottimali per invertire in modo efficiente la latenza è richiesto.

Qui, un protocollo è presentato, che utilizza un approccio ad alta produttività per la valutazione funzionale dell'impatto degli interventi su trascrizionale LTR di HIV e splicing. In breve, un nuovo dual LTR-driven colore reporter sistema pLTR.gp140/EGFP. RevΔ38/DsRed (Figura 1) viene utilizzato per valutare la riattivazione di HIV tramite flusso cytometry. In questo reporter fluorescente, l'espressione del mRNA di unspliced HIV (4 kb) conduce all'espressione migliorata della proteina fluorescente verde (EGFP), mentre l'espressione di mRNA splicing (2Kb) porterebbe all'espressione della proteina fluorescente di Discosoma sp. rosso (DsRed). In breve, abbiamo usato una proteina di fusione di Env-EGFP fluorescente, gp140unc. EGFP, dove la sequenza codificante di EGFP è stata posizionata nel telaio con una forma non-spaccata e troncata della busta (Env). Le modifiche sono state introdotte per l'ablazione del sito di clivaggio impedendo la dissociazione di Env in gp120 e gp41-EGFP e troncare la proteina gp160 prima il dominio transmembrana creando un analogo solubile di Env, che facilita la piegatura corretta e espressione di EGFP. Al momento l'espressione all'interno di una cella, Rev si localizza nel nucleo dove media l'esportazione nucleare-citoplasmico di 4KB env mRNA tramite l'interazione con l'elemento sensibile rev (RRE). Il troncamento di Env non compromette la RRE, che si trova tra gp120, gp41 e A7 3' luogo della giuntura. In questo sistema, splicing a HIV-1 splice donatore 4 (SD4) e della giuntura acceptor 7 (SA7) risultati nella produzione di un 2 kb mRNA che codifica per una proteina non funzionale di Rev troncata all'amminoacido 38 fusa alla proteina fluorescente di DsRed, RevΔ38-DsRed. Brevemente, DsRed è stato inserito in essone 2nd di Rev all'amminoacido 38 da sovrapposizione estensione18. Per facilitare l'esportazione nucleare di unspliced mRNA, un vettore di espressione mammifera codifica Rev (pCMV-RevNL4.3) è stato co-trasfettato con la costruzione del reporter fluorescenti (Figura 2). Questo costrutto unico reporter qui descritto è utile nella valutazione di alto-rendimento di trascrizione di HIV e intestature, senza la necessità di utilizzare vettori virali.

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Protocollo

Nota: Procedure per la clonazione, trasformazione e sequenziamento sono discussi altrove18,19. I protocolli qui iniziano dalla trasfezione di vettori di espressione mammifera (Figura 3).

1. transfezione delle cellule HEK293T con doppio colore Reporter costruire

  1. Coltivare le cellule HEK293T nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) completati con 10% (v/v) siero bovino fetale (FBS), penicillina (100 U/mL) e streptomicina (100 µ g/mL) in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C. Dopo lo scongelamento, gli esperimenti di cellule HEK293T passaggio 2 - 3 volte prima di utilizzarli nella transfezione. Questo darebbe il tempo di cellule per recuperare dalla procedura di scongelamento.
    Attenzione: Contaminazione del micoplasma di colture cellulari rimane un problema serio. Buona pratica di laboratorio e test di routine di colture cellulari sono essenziali per ridurre il rischio di contaminazione del micoplasma ed evitare diffusione20.
  2. Dividere le celle 1:2 un giorno prima della semina e trasferirli nel terreno DMEM fresco. Coltivare le cellule per 24 h in un 5% CO2 incubatore a 37 ° C.
  3. Il giorno prima di transfezione, rimuovere il supporto dal pallone dall'aspirazione e lavare le cellule con tamponato fosfato salino (DPBS) soluzione di Dulbecco priva di calcio (Ca2 +) e magnesio (Mg2 +) per rimuovere tracce di siero.
  4. Pipettare 5 mL della soluzione di tripsina-EDTA (0.05% - 10 mM in PBS) nel recipiente di cultura e posizionarlo a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 2-5 min.
  5. Quando le cellule sono disconnessi, aggiungere 5 mL di DMEM supplementato con 10% (v/v) FBS ulteriormente inibire l'attività della tripsina che può danneggiare le cellule.
  6. Risospendere delicatamente pipettando la sospensione cellulare su e giù per rompere i grumi.
  7. Diluire le celle 01:10 in trypan blu macchia (0,4%).
  8. Contare le cellule vive che non occupano trypan blue utilizzando un microscopio (obiettivo 10x) e un emocitometro.
  9. Calcolare il numero di cellule vitali per millilitro prendendo la media del conteggio delle cellule e moltiplicandolo per 10.000 e per il fattore di diluizione (01:10) dal trypan blu macchia.
  10. Piastra 2 x 104 cellule in 100 μL di medium DMEM supplementato con 10% FBS senza antibiotici in una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto per 24 h.
  11. Per tutti i pozzetti, diluire 400 ng di pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRed, 20 ng di pCMV-RevNL4.3 e 100 ng di pCMV-Tat101AD8-bandiera DNA in 50 μL di mezzo libero del siero. Mescolare delicatamente. Per gli esperimenti senza Tat, utilizzare un vuoto abbinati Tat vettore pcDNA3.1 (-).
    Nota: Si consiglia vivamente l'uso di DNA privo di endotossina. Per questo, preparare il DNA privo di endotossina utilizzando un kit di purificazione dell'acido nucleico midi o maxiprep. Determinare la purezza di DNA misurando il rapporto di 260/280 OD, che dovrebbe essere compreso tra 1,7 e 1,9.
  12. Mix il reagente del lipido delicatamente prima dell'uso, diluire 0.65 μL in 50 μL di mezzo libero del siero. Mescolare delicatamente e incubare per 5 min a temperatura ambiente.
  13. Combinare il DNA diluito con il reagente del lipido diluito.
  14. Mescolare delicatamente e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. La soluzione potrebbe apparire nuvolosa.
    Nota: Passare al punto 1.15. entro 30 min.
  15. Pipettare 100 μL per pozzetto dei complessi lipidici reagente-DNA drop-wise in cima le cellule.
  16. Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra.
  17. Incubare la piastra per 5 h in una 5% CO2 incubatrice umidificata a 37 ° C.
    1. Ogni miscela di reazione è sufficiente per la transfezione un singolo pozzo (96-well). Regolare la quantità e volume dei componenti secondo il numero di droga e combinazione che sarebbe stato testato e conti per pipettaggio variazioni. Tutte le condizioni sono solitamente testate in triplici copie.
    2. Transfect ulteriori pozzi con 100 ng di CMV-driven EGFP e DsRed-Express DNA plasmidico fini di compensazione.

2. trattamento di HEK293T Transfected le cellule con latenza agenti di retromarcia

Nota: Prima di ogni analisi, è possibile determinare lo stato fisiologico di ogni LRA misurando la vitalità delle cellule dopo l'esposizione ad alta e bassa della dose della droga con analisi delle cellule di proliferazione.

  1. Diluire ciascuna LRA alla concentrazione di lavoro appropriato con il mezzo di crescita (ad esempio, 1 μM per JQ1(+)).
    Attenzione: Ricostituire i farmaci liofilizzati con il solvente appropriato a una concentrazione di 10 mM. Conservare Stock in tutti gli enti locali e regionali a-80 ° C in un'uso singola aliquota (5 µ l) per evitare ripetuti cicli di congelamento-scongelamento.
  2. Attentamente aspirare mezzo di transfezione con un multicanale e sostituire con 100 μL contenente appropriato LRA (tabella 1). Aggiungere il terreno molto delicatamente lungo la parete del pozzo per evitare di staccare le cellule transfected HEK293T, che sono conosciute per staccare facilmente dalla superficie della placca di cultura.
  3. Incubare la piastra per 48 h in una 5% CO2 incubatrice umidificata a 37 ° C.

3. colorazione delle cellule transfettate con tintura di attuabilità risolvibile per analisi di citometria a flusso

Attenzione: Rimozione detriti e cellule morte è indispensabile per eliminare i falsi positivi e di ottenere risultati di altissima qualità.

  1. Staccare le cellule nei mezzi usando 100 μL di tampone fosfato salino (PBS) per pozzetto e pipettando delicatamente alti e Bassi (~ 5 volte) con un multicanale, evitando la bava dei media. Se necessario, staccare le cellule dalla piastra utilizzando 35 µ l per pozzetto di soluzione di tripsina-EDTA (0.05% - 10 mM in PBS) e incubare 5 min a 37 ° C, prima neutralizzazione con mezzo contenente siero.
  2. Trasferire le cellule a una piastra a 96 pozzetti fondo V.
  3. Girare le cellule per 5 min a 500 x g a 4 ° C, quindi aspirare accuratamente il medio/PBS senza toccare le cellule.
  4. Lavare le cellule almeno 1 volta con 200 µ l di PBS gratis proteina/del siero.
  5. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C, quindi eliminare il supernatante inclinando la piastra e rimuovere il tampone di lavaggio senza toccare le cellule.
  6. Preparare una soluzione di lavoro di attuabilità risolvibile colorante diluendo l'attuabilità tintura 1: 1000 in proteina/siero libero PBS. Preparare 50 µ l della macchia diluita per pozzetto.
    Nota: Attuabilità coloranti sono disponibili in una gamma di colori adatti per l'utilizzo con laser blu, rossi e violetto. Preparare una soluzione stock di attuabilità risolvibile tintura di risospensione un flaconcino di liofilizzato tintura (componente A) con 50 μL di DMSO anidro (componente B). Conservare a-20 ° C in un uso singola aliquota (1 μL), al riparo dalla luce.
  7. Aggiungere 50 μL di colorante diluito vitalità ad ogni pozzetto e mescolare le cellule pipettando su e giù con un multicanale.
  8. Macchia per 10-15 min a 4 ° C, al riparo dalla luce.
  9. Lavare 1 - 2 volte con 150 µ l di tampone di lavaggio (PBS con 1% bovino dell'albumina di siero e 2 mM EDTA).
  10. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  11. Fissare le cellule con 100 μL di preparati 1% formaldeide nel tampone di lavaggio per 10-15 min a 4 ° C al buio.
    Attenzione: La formaldeide è molto tossica. Preparare la soluzione di 1% di formaldeide in una cappa per evitare l'inalazione indossando guanti e occhiali di sicurezza per la protezione.
  12. Lavare le cellule 1 - 2 volte con 100 μL di tampone di lavaggio.
  13. Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.
  14. Risospendere il pellet cellulare in 70 μL di tampone di lavaggio.
    Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Fissa le cellule potrebbero essere conservate a 4 ° C al buio per l'analisi il giorno successivo il citofluorimetro.

4. EGFP e DsRed misure di citometria a flusso e analisi dei dati

Nota: Analizzare la trascrizione di HIV (% EGFP) e splicing (% DsRed) su un citometro a flusso. Filtrare il campione prima della corsa con un cellulare-setaccio di 70 μm o maglia di nylon 100 μm per evitare di intasare l'ugello.

  1. Avviare il citometro e il computer almeno 10 minuti prima dell'uso per garantire laser scaldare.
  2. Prima di eseguire i campioni e iniziare l'acquisizione dei dati, è necessario riempire il serbatoio di guaina con soluzione fisiologica 0,9% e assicurarsi che il serbatoio di scarico viene aggiunta una tavoletta di ipoclorito di sodio.
  3. Controllare la cella di flusso per le bolle d'aria.
  4. Verificare che i filtri e i rivelatori siano appropriati per l'esperimento.
    Nota: Per EGFP, l'utilizzo del laser blu (488 nm) e 530/30 passa-banda, mentre DsRed Express viene rilevato in modo ottimale utilizzando il laser giallo (561 nm) e 610/20 passa-banda. Un laser blu (488 nm) e passa-banda 610/20 può essere utilizzato anche per rilevare DsRed espressione.
  5. Controllare il citometro prestazioni e sensibilità attraverso rivelatori eseguendo perle di calibrazione.
  6. Regolare il forward (FSC-A) e tensioni (SSC-A) dispersione laterale con senza macchia campione affinché la popolazione principale è sullo schermo e chiaramente percepibile.
    Nota: FSC (luce diffusa diretta) è una misura della luce diffrazione in un angolo piatto, che dipende dal volume della cella (cella superficie o dimensione), mentre SSC (lato-sparsi luce) è una misura di diffrazione della luce in un angolo retto, che è proporzionale alla granularità cellulare e complessità interna.
  7. Eseguire la compensazione manuale o automatica utilizzando i campioni di singolo-macchiato garantendo minimo spillover di EGFP + popolazione nella DsRed rivelatore e viceversa.
    Attenzione: Ai fini della compensazione, è necessario utilizzare un campione di cellule che esprimono ciascuno della proteina fluorescente colore singolo così come le cellule singolarmente colorate con il colorante di attuabilità risolvibile. Non utilizzare perline di compensazione FITC e PE per compensazioni di proteine fluorescenti EGFP e DsRed a causa di differenti caratteristiche spettrali. Controlli di compensazione dovrebbero essere abbastanza brillanti da risolvere popolazione positiva e negativa.
  8. Creare trame e impostare le porte usando la fluorescenza meno uno (FMO) controlli.
  9. Acquisire e registrare un minimo di 10.000 eventi di cellule vitali per campione. Eseguire gli esempi a media o bassa velocità per evitare doppietti passando per l'intercetta di laser. Utilizzare impulsi geometria gating come SSC-A contro SSC-H per eliminare doppietti. Verificare la stabilità della corsa tracciando tempo contro SSC-A per vedere come anche il flusso è durante l'esecuzione.
  10. Alla fine della corsa, pulire la fluidica di citometria a flusso con detergenti concentrati poi acqua per 5 minuti ciascuno.
  11. Arresto del sistema, eliminare i rifiuti e ri-riempire il serbatoio di guaina dopo l'acquisizione.
  12. Analizzare i dati utilizzando un software di analisi dati di citometria a flusso. Escludere i detriti cellulari e ciuffo (doppiette) basato su dispersione avanti e laterali, quindi eliminare le cellule morte usando la macchia di tintura di redditività (negativo della popolazione = cellule vive). Identificare le cellule che esprimono EGFP e DsRed (Figura 4), così come la percentuale di prodotto impiombato DsRed /(DsRed + EGFP) (Figura 5).
  13. Determinare l'effetto del LRA sulla trascrizione di HIV e splicing confrontando le cellule non trattate e le cellule esposte a individuo o una combinazione di enti locali e regionali (Figura 5).

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Risultati

Risultati rappresentativi sono illustrati nella Figura 5 per l'espressione di HIV-1 unspliced (EGFP) e impiombato (DsRed) prodotti dopo il trattamento con l'inibitore bromodomain JQ1. Sia JQ1(+) e Tat ha aumentato significativamente la percentuale di cellule che esprimono EGFP (2.18 e 4.13 FC sopra DMSO rispettivamente; n = 3) indicativo di unspliced trascrizioni. Inoltre, JQ1(+) aumentato significativamente la percentuale di cellule esprimenti DsRed (46,6 FC...

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Discussione

Data la difficoltà nel misurare la riattivazione del virus ex vivo, una vasta gamma di in vitro sono stati sviluppati modelli nel tempo al fine di studiare la latenza di HIV tra cui latente infettato linee a cellula T (J-Lats, ACH2, U1), modelli primari dell'infezione latente di riposo ( Modelli o ' Doherty, Lewin, Greene e Spina) o pre-attivato le cellule T CD4 + (Serafini, Marini, Planelles, Siliciano, modelli di Karn) con singolo turno o replica competente reporter virus22. Per modellare le con...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato dal progetto grant APP1129320 e programma grant APP1052979 da NHMRC dell'Australia. Ringraziamo Dr. Adam Wheatley, Dr. Marina Alexander, Dr. Jenny L. Anderson e Michelle Y. Lee per la fornitura di costrutti essenziali e consigli per il corretto completamento di questo lavoro. Ringraziamo anche il personale della struttura di flusso di DMI per i loro consigli e la generosa assistenza nel mantenere il citometro a flusso utilizzato in questo studio.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cell culture
HEK293T (cellule renali embrionali umane)ATCCCRL-3216Replica i vettori che trasportano la regione di replicazione SV40.
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM 1x + GlutaMAX-I)Gibco10569-010+ 4,5 g/L D-glucosio + 110 mg/L Piruvato di sodio
Fetale Siero bovinoGibco10099-141Origine Australia
Penicillina-StreptomicinaSigmaP4458
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), senza calcio, senza magnesioGibco14190-136
Trypan blue Stain, 0,4%Gibco15250
Tripsina-EDTA (0,05%), rosso fenoloGibco25300054
Lipofectamine 2000Invitrogen11668-019Reagente di trasfezione lipidica
Opti-MEM I (1x) terreno sierico ridottoGibco31985-070Terreno privo di siero
NucleoBond Xtra MaxiMarcherey-Nagel740414.50
Clontech(TaKaRa)6085-1Espressione di EGFP in cellule di mammifero, promotore CMVIE.
pDsRed-Express-N1Clontech (TaKaRa)632429Espressione di DsRed-Express in cellule di mammifero, promotore CMVIE.
pLTR.gp140/EGFP. RevD38/DsRedAddgene115775
pCMV-RevNL4.3Addgene115776
pCMV-Tat101AD8-FlagAddgene115777
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Millipore67-68-5
JQ1(+)Cayman Chemical11187Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 1 μ M
JQ1(-)Cayman Chemical11232Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 1 μ
M Phorbol Myristate Acetato (PMA)Sigma-Aldrich16561-29-8Stock a 100 μ g/mL in DMSO; concentrazione di lavoro 10 nM
Fitoemoagglutinina (PHA)RemelHA15/R30852701Stock a 1 μ g/μ L in PBS; concentrazione di lavoro 10 μ g/mL
Vorinostat (VOR)Cayman Chemical10009929Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 0,5 μ M
Panobinostat (PAN)TRCP180500Stock a 10 mM in DMSO; concentrazione di lavoro 30 nM
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation AssayPromega63581
Venor GeM ClassicMinerva Biolabs11-1100Mycoplasma Detection Kit, basato su
PCRNameCompanyNumero catalogoComments
Reagenti per citometria a flusso
LSR FortessaBD BiosciencesCitometro a flusso (4 laser: blu, rosso, viola e giallo)
LSR II BdBiosciences Citometroflusso (3 laser: blu, rosso e viola)
LIVE/DEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain KitLife TechnologiesL34976Colorante di vitalità: per eccitazione a 633 o 635 nm, 400 saggi. I componenti A e B sono entrambi forniti nel kit.
Albumina sierica bovinaSigmaA2153
EDTA 0.5M pH8Gibco15575-038
Soluzione di formaldeide 37/10 (37%)Chem-SupplyFA010
BD FACS Diva CS& T Research BeadsBD Biosciences655050Perline di calibrazione
Sphero Rainbow Particelle di calibrazione (8 picchi)BD Biosciences5591233,0 - 3,4 mm
Soluzione di guainaChem-SupplySA04690 g NaCl in 10 L di acqua
HAZ-TabsGuest MedicalH8801Compresse per rilascio di cloro per la disinfezione
Decon 90Decon Laboratories LimitedN/ADetergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro Decon 90 5%.
Ipoclorito di sodio (soluzione al 12-13%)LabcoSODHYPO-5LDetergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro candeggina 1%.
7xMPBioIM76670Detergenti concentrati del citometro a flusso. Soluzione di lavoro 7x 1%.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Materials
Flaconi per coltura tissutale (75 cm2, collo inclinato, tappo ventilato)Corning430641U
Piastre per coltura tissutale (fondo piatto da 96 pozzetti con coperchio)Costar3599
Piastre per coltura tissutale (96 pozzetti V-bottom senza coperchio)Costar3896
Provette da centrifuga (10 mL)SARSTEDT62.9924.284100x16 mm
Provette da centrifuga (50 mL)CellStar22726130x115 mm
Provette per microcentrifuga (1,5 mL)Corning AxygenMCT-150-C
Sierologico Pipetta (25 mL), pipetta sierologica sterileCorningCLS4489-200EA
(10 mL), pipetta sierologica sterileCorningCLS4488-200EA
(5 mL), serbatoi diCorningCLS4487-200EA
(50 mL),CorningCLS4470-200EA
in polistirene a fondo tondo da 5 mL, con tappo per filtrocellulare Corning35223512 x 75 mm, rete di nylon da 70 mm
SEFAR03-100/32100 mm
Micro provette,BIO-RAD2239391provette microfacs sfuse Provette
5 mL in polistirene a fondo tondo, senza tappoCorning35200812x75 mm
Tappi a scatto per provette da 12x75 mmCorning352032
Camera di conteggio, Neubauer improved double net ruling, linea chiara (Emocitometro, LO-Laboroptik)ProSciTechSVZ4NIOU3x3 quadrati grandi da 1 mm2; Profondità 0,100 mm; volume 0,1 mL; area minima 0,0025 mm2
Vetrini coprioggetti (Menzel-Glä MicroscopioGrale ScientificHCS202620 x 26 mm
Nikon TMS310528
Centrifuga 5810R refrigeratoEppendorf5811000487con rotore A-4-81 inclusi adattatori per provette coniche da 15/50 mL
Lettore di micropiastre FLUOstar OmegaBMG LabtechN/ALettore di piastre per saggi di proliferazione cellulare. Filtro 490 nm.
NameAziendaNumero di catalogoComments
Softwares
FACS DivaBD BiosciencesProgramma di acquisizione e analisi dei dati del citometro a flusso, versione 8.0.1
FlowJoFlowJoFlowJo 10.4.2Programma di analisi dei dati del citometro a flusso, FlowJo Engine v3.05481
OmegaBMG LabtechFLUOstar controllo lettore multiutente, versione 5.11
Omega - Analisi dei datiBMG LabtechMARSAnalisi dei dati FLUOstar, versione 3.20R2
Microsoft ExcelMicrosoftExcel:mac 2011versione 14.0.0
PrismGraphPadPrism 7versione 7.0c
a reagenti sterili provetta sterile Titertube da

Riferimenti

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