Imaging di entrambi, l'isolato della membrana plasmatica e il volume intracellulare circostante, sarà presentato un microscopio avanzato che consentono veloce e ad alta risoluzione. L'integrazione di filatura disco e totale microscopia di fluorescenza di riflessione interna in un'unica configurazione permette esperimenti dal vivo imaging al prezzo di acquisizione alta fino a 3,5 s per serie di immagini.
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Articolo metodologico
Visualizzazione di formazione di aderenze in cellule per mezzo di avanzati filatura microscopia di fluorescenza di riflessione interna totale disco
In questo articolo
Sommario
Abstract
In cellule viventi, processi quali la formazione di aderenze coinvolgono vasti cambiamenti strutturali nella membrana plasmatica e l'interno delle cellule. Per visualizzare questi eventi altamente dinamici, sono stati combinati due tecniche di microscopia chiara complementari che permettono la formazione immagine veloce dei campioni dal vivo: filatura microscopia disco (SD) per la registrazione veloce e ad alta risoluzione volume e riflessione interna totale microscopia a fluorescenza (TIRF) per localizzazione precisa e la visualizzazione della membrana plasmatica. Verrà mostrato un protocollo di formazione immagine ampio e completo per guidare attraverso la preparazione del campione, taratura del microscopio, formazione dell'immagine e acquisizione, con conseguente serie di formazione immagine multicolore SD-TIRF dal vivo ad alta risoluzione spazio-temporale. Tutti i passaggi di post-elaborazione immagine necessaria per generare dataset multidimensionale in imaging dal vivo, cioè registrazione e combinazione dei singoli canali, sono forniti in una macro auto-scritta per il software open source ImageJ. L'imaging di proteine fluorescenti durante l'inizio e la maturazione dei complessi di adesione, così come la formazione della rete del citoscheletro di actina, è stato utilizzato come una prova di principio per questo nuovo approccio. La combinazione di microscopia 3D ad alta risoluzione e TIRF ha fornito una descrizione dettagliata di questi processi complessi all'interno dell'ambiente cellulare e, allo stesso tempo, precisa localizzazione delle molecole di membrana-collegato rilevato con un alto rapporto di segnale--fondo.
Introduzione
Nostri giorni, tecniche di microscopia chiara fornendo alta/super risoluzione imaging in fissa ed esemplare vivente sono in rapida evoluzione. Tecniche di Super-risoluzione stimolato microscopia di emissione svuotamento (STED), strutturato illuminazione (SIM) e microscopia di localizzazione foto-attivazione (PALM) o microscopia diretta ricostruzione ottica stocastica (tempesta), rispettivamente, sono disponibili in commercio e permettono la formazione immagine di strutture subcellulari mostrano dettagli quasi su scala molecolare1,2,3,4,....
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Protocollo
1. preparazione delle celle
- Due giorni prima dell'esperimento, seme 3 * 105 HeLa o NIH3T3 cellule in 2 mL di terreno di sviluppo completo per pozzetto di una piastra di coltura cellulare 6 pozzetti. Assicurarsi che le celle vengano gestite in una cappa a flusso laminare in tutto questo protocollo.
- Un giorno prima dell'esperimento, preparare i reagenti di transfezione secondo le raccomandazioni del produttore o un protocollo empiricamente determinato, ad esempio:
- Diluire 1 µ g di RFP-Lifeact e 1 µ g di YFP-Vinculin in un totale di 200 µ l ridotto medio del siero. Vortice il reagente di transfezione brevemente, aggiungere ....
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Risultati
Al fine di mostrare il potenziale di formazione immagine SD-TIRF, che un'analisi è stata sviluppata che dovrebbe rivelare l'organizzazione spazio-temporale dei complessi di adesione cellula-matrice e loro interazione con il citoscheletro durante l'adesione cellulare. Di conseguenza, aderente HeLa o, in alternativa, NIH3T3 cellule transfected con YFP-vinculina e RFP-Lifeact per 18-24 h, tripsinizzate e seminate su piatti di fondo di vetro rivestite di fibronectina. Queste linee cellulari s.......
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Discussione
In questa carta è stata presentata la prima implementazione di successo di SD e TIRF microscopia in una configurazione adatta per l'esecuzione di esperimenti imaging di cellule vive, cioè i tassi di acquisizione alta quali 2 serie di SD-TIRF immagini al minuto a 3 diversi stadi posizioni, corrispondenti a un totale di 168 fotogrammi (circa 3 fotogrammi al secondo), sono state acquisite. I microscopi di SD-TIRF pochi che erano precedentemente descritto12,13
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo enormemente la comunità scientifica della University Medical Center Hamburg-Eppendorf per averci sostenuto con campioni per la valutazione. Vale a dire, noi ringraziamo Sabine Windhorst per cellule NIH3T3, Andrea Mordhorst per YFP-vinculina e Maren Rudolph per RFP-Lifeact.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Microscopio e accessori | |||
| SD-TIRF microscopio | Visitron Systems | ||
| Ti con sistema di messa a fuoco perfetta | Nikon | Supporto per microscopio invertito | |
| CSU-W1 T2 | Yokogawa | Unità disco rotante in configurazione a doppia fotocamera | |
| iLAS2 | Scanner TIRF/FRAP | Roper Scientific | |
| Evolve | Telecamere fotometriche | EM-CCD | |
| Stadio PiezoZ | Ludl Electronic Products | Stadio Z motorizzato | |
| Bioprecision2 Stadio XY | Ludl Electronic Products | Stadio XY motorizzato | |
| Camera di incubazione superiore dello stadio | Okolab | Bold Line | Temperatura, CO2 e umidità di fornitura |
| Coltura cellulare | |||
| Cellule tumorali cervicali HeLa | DSMZ | ACC-57 | |
| NIH3T3 fibroblasti | DSMZ | ACC-59 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (PBS) | Gibco | 14190144 | |
| Tripsina-EDTA 0,05% | Gibco | 25300054 | |
| Eagle modificato di Dulbecco Medium + GlutaMAX-I (DMEM) | Gibco | 31966-021 | |
| OptiMEM | Gibco | 31985070 | Siero di base a siero |
| ridotto Siero fetale di vitello (FCS) | Gibco | 10500064 | |
| Penicillina/Streptomicina (PenStrep) | Gibco | 15140148 | |
| Terreno di crescita completo (DMEM integrato con il 10% di FCS e l'1% di PenStrep) | |||
| Trasfezione TurboFect | ThermoFisher Scientific | R0531 | reagente |
| Acido ascorbico (AA) | Sigma | A544-25G | |
| Piastra per colture cellulari a 6 pozzetti | Sarstedt | 83.392 | |
| Piastre con fondo in vetro | MatTek | P35G-1.5-10-C | 35mm, vetrino coprioggetti in vetro da 0,17 mm |
| Fibronectina, plasma bovino | ThermoFisher Scientific | 33010018 | |
| Neubauer camera migliorata | VWR | 631-0696 | |
| Perle TetraSpeck | ThermoFisher Scientific | T7279 | |
| Plasmidi | |||
| RFP-Lifeact | Maren Rudolph, Istituto di Microbiologia Medica, Centro Medico Universitario di Amburgo Eppendorf, Germania | ||
| YFP-Vinculina | Andrea Mordhorst, Istituto di Microbiologia Medica, Centro Medico Universitario di Amburgo Eppendorf, Germania | ||
| Software e plugin | |||
| VisiView | Visitron Systems | Versione 3 | |
| ImageJ | Versione 1.52c | ||
| Turboreg plugin | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | ||
| Macro "SD-TIRF_helper_JoVE.ijm" | questa pubblicazione | https://github.com/bzobiak/ImageJ | |
| Volocity | PerkinElmer | Versione 6.2.2 |
Riferimenti
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Optics Letters. 19 (11), 780(1994).
- Gustafsson, M. G. L.
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Ristampe e permessi
