Zona marginale B cellule (MZBs) rispondono alla forza di taglio flusso di ri-orientare il loro percorso di migrazione il flusso. Questo protocollo viene illustrato come registrare e analizzare la migrazione utilizzando un'unità fluidica, pompa, sistema di formazione immagine del microscopio e software libero.
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Articolo metodologico
Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro
In questo articolo
Sommario
Abstract
Zona marginale B cellule (MZBs) sono una popolazione delle cellule di B che risiedono nelle zone marginali splenici del mouse che avvolgono i follicoli. Per raggiungere i follicoli, MZBs necessario migrare fino la forza di taglio di flusso sanguigno. Presentiamo qui un metodo per analizzare questa migrazione di MZB flusso-indotta in vitro. In primo luogo, MZBs sono isolati dalla milza del mouse. In secondo luogo, MZBs sono sistemati su ligandi delle integrine nelle diapositive di camera di flusso, esposti per inclinare il flusso e imaged sotto un microscopio durante la migrazione. In terzo luogo, immagini di MZBs la migrazione vengono elaborati utilizzando la cella automatica MTrack2 tracking plugin per ImageJ e le tracce di cella risultante vengono quantificate utilizzando lo strumento di chemiotassi Ibidi. I dati di migrazione rivelano quanto velocemente si muovono le cellule, come spesso cambiano direzione, se il vettore di flusso di taglio influisce sulla loro direzione di migrazione e quali ligandi delle integrine sono coinvolti. Anche se usiamo MZBs, il metodo può essere facilmente adattato per l'analisi di migrazione di qualsiasi del leucocita che risponde alla forza del flusso di shear.
Introduzione
Cellule del sistema immunitario sono più le cellule nel corpo umano e spesso devono vedersela con forza di taglio dal flusso sanguigno e linfatico. Tuttavia, ci sono relativamente pochi studi sulla migrazione indotta da forza di taglio di leucociti1,2,3,4,5. Presentiamo qui un protocollo affidabile e quantitativo per analizzare la risposta di una cellula immune al flusso in vitro. Esecuzione del saggio non necessita di fabbricazione dei componenti, e tutte le attrezzature e materiali di consumo sono commerc....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti che prevedono l'uso di animali siano state preventivamente approvati dal Landesverwaltungsamt Halle (Sassonia-Anhalt), Germania, in conformità con tutte le linee guida della facoltà di medicina della Università OVGU di Magdeburgo.
1. MZB cella purificazione
-
Isolare i leucociti.
- Sacrificare un 8 a 16 settimana-vecchio mouse e rimuovere la milza16. Dissociare la milza in 5 mL di tampone cella ghiacciata [tampone fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina di siero privo di acido grasso bovino (BSA)], utilizzando un dissociatore di tessuto o schiacciare delicatamente ....
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Risultati
Abbiamo usato il protocollo descritto sopra per confrontare la migrazione di MZBs su ICAM-1-coated diapositive senza flusso (0 dyn/cm2) ed esposti per inclinare il flusso (4 dyn/cm2). Cellule sono state rilevate automaticamente con MTrack2 e la traccia risultante file erano il overlaid sui film di migrazione delle cellule di nessun flusso (0 dyn/cm2) e (4 dyn/cm2) per visualizzare la distribuzione e la forma delle tracce (Fi.......
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Discussione
Descriviamo qui un metodo per analizzare la migrazione delle cellule di rilevare la forza del flusso di shear e rispondere, modificando la loro migrazione. Un'analisi di MZBs ha mostrato che MZBs migrare spontaneamente su ICAM-1 e in presenza di flusso, migrerà il flusso. Nel nostro precedente lavoro, abbiamo mostrato che MZBs non migrano il flusso su VCAM-1, ma invece rimangono fissi in luogo. La zona marginale splenica murina contiene principalmente ICAM-1, mentre la polpa rossa contiene sia ICAM-1 e VCAM-1. Da questi .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dalla "Deutsche Forschungsgemeinschaft" SFB 854/TP11 a K.-D.F.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Filtro per celle VWR, 70 &; micro; m | VWR | 10199-656 | |
| Filtri di pre-separazione, 30 &; micro; m | Miltenyi | 130-095-823 | |
| Kit di isolamento cellulare MZB e FOB | Miltenyi | 130-100-366 | |
| B220 CD45R, clone RA3-6B2, FITC | Biolegend | 103206 | |
| CD21 / CD 35, clone 7G6, APC | BD Biosciences | 558658 | |
| CD23, clone B3B4, PE | Biolegend | 101608 | |
| HBSS | Biochrom | L2035 | |
| D-PBS 1x | Gibco di Life Technologies | 14190-094 | |
| BSA frazione di albumina V, senza acidi grassi | Roth | "0052.3" | |
| ICAM-1 | R& D Systems | 796-IC-050 | |
| Ibidi µ-scivoli VI 0,4, idrofobici, non rivestiti | Ibidi | 80601 | |
| Set di perfusione, bianco, 50 cm, 0,8 mm | Ibidi | 10963 | |
| Ibidi Sistema di pompaggio | Ibidi | 10902 |
Riferimenti
- Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinions in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
- Dominguez, G. A., Anderson, N. R., Hammer, D. A.
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Ristampe e permessi
