Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Sommario

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Abstract

Ci sono una varietà di strategie che impiegano batteri patogeni di sopravvivere e proliferare una volta all'interno della cellula eucariotica. I cosiddetti 'citosolici' patogeni (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) accedere al cytosol delle cellule infette da fisicamente ed enzimaticamente degradare la membrana vacuolar primaria. Una volta nel cytosol, questi agenti patogeni sia proliferano, nonché generano sufficienti forze meccaniche di penetrare la membrana plasmatica della cellula ospite al fine di infettare nuove cellule. Qui, ci mostrano come questa fase terminale del ciclo cellulare infezione di L. monocytogenes (Lm) può essere quantificata da saggi di unità formanti colonie e citometria a flusso e dare esempi di come sia effetto di fattori patogeno-ospite con codifica e questo processo. Mostriamo anche una stretta corrispondenza delle Lm dinamiche di infezione delle cellule coltivate infettate in vitro e quelli delle cellule epatiche derivate da topi infettati in vivo. Questi saggi basati sulla funzione sono relativamente semplici e possono essere facilmente scalati per schermi di alto-rendimento basata su individuazione per modulatori della funzione delle cellule eucariotiche.

Introduzione

Modelli sperimentali basati su infezione sono intrinsecamente impegnativi a causa della loro dipendenza dalle condizioni di partenza dello stato di ospite e patogeno, le varie strategie di infezione del patogeno e la difficoltà di attribuzione dell'agente patogeno e host-processi basati basato sui risultati. Il batterio Listeria monocytogenes (Lm) è diventato un agente patogeno ideale per sondare le risposte di difesa ospite a causa della sua trattabilità genetiche e microbiologiche, la strategia di infezione cellulare rapida e processive e relativamente chiaro relazione tra suoi fenotipi di infezione cellulare e organismica livello. L'infezione cellulare di Lm procede attraverso quattro fasi distinte¹: (i) l'invasione cellulare che si conclude con Lm essere racchiuso all'interno di un vacuolo; (ii) Lm-diretto la dissoluzione della membrana del vacuolo e rilascio di Lm nel citosol; (iii) replica intracytosolic; e (iv) penetrazione fisica della membrana plasmatica che si traduce in entrambi l'infezione delle cellule direttamente adiacenti (ad esempio in un foglio di epiteliale) o, in cellule solitarie, rilascio di Lm nell'ambiente extracellulare. Ognuna di queste fasi sono promossi da specifici Lm-codificato fattori (denominati «fattori di virulenza») che, quando eliminato, causare difetti di infezione nei modelli animali e cellulari. Questa strategia di infezione generale è stata evoluta indipendentemente da un numero del cosiddetto 'citosolico' patogeni².

Formanti colonie (CFU) unità saggi sono largamente impiegate per valutare sia in vitro (cioè, cellulare) in vivo (cioè, organismica) esiti di infezione. Oltre alla loro alta sensibilità, specialmente per le infezioni in vivo, CFU saggi forniscono una lettura univoca per l'invasione dell'agente patogeno e sopravvivenza/proliferazione intracellulare. Saggi di CFU sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Lm sia host determinanti delle cellule che hanno un impatto infezione. Come informativo come questi studi precedenti sono stati per analizzare l'invasione cellulare e intracytosolic replica, CFU saggi non sono, al meglio della nostra conoscenza, stati utilizzati per tenere traccia della quarta fase del processo di infezione Lm : fuga cellulare. Qui, descriviamo relativamente semplici mezzi di fuga come cellulare (in appresso denominato 'emersione') possono essere monitorati mediante analisi CFU (così come da citometria a flusso) e visualizza esempi di come entrambi fattori patogeno-ospite con codifica e regolano questa fase di Lm ciclo di infezione. L'analisi della fase terminale del ciclo cellulare Lm infezione può rendere possibile identificare l'agente patogeno supplementare e fattori di infezione specifica cellula ospite e attività.

Protocollo

Topi sono stati trattati umanamente secondo tutte le linee guida di governo appropriati per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e il loro uso è stati approvati per questo intero studio della cura degli animali istituzionale Università di Miami e uso Comitato (protocollo 16-053).

1. preparare le celle per infezione

1. Propagare la linea di macrofago-come delle cellule di topo 264,7 in terreni di coltura di tessuto DMEM completati con 10% di siero fetale di vitello (d'ora in poi denominato DMEM/FCS) utilizzando un pallone da 125 mL e un incubatore di coltura del tessuto mantenuta a 37 °C/5% CO₂.
2. Il giorno prima dell'infezione, utilizzare un raschietto di cella per rimuovere le cellule dal pallone di espansione e raccogliere in una provetta conica da 15 mL tappo a vite. Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 min, decantare il supernatante e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/FCS (senza antibiotici) e determinarne il titolo usando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
3. Regolare titolo a 2 x 10⁶ cellule/mL e aggiungere 0,10 mL (2 x 10⁵ cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Garantire che la sospensione cellulare copre l'intera superficie del pozzo.
   1. Cellule di piastra in ulteriori pozzi per una fonte successiva dei media condizionati. Inoltre posizionare 0,10 mL di DMEM/FCS in ulteriori tre pozzi per servire come un 'nessun controllo di cella'.
4. Incubare per una notte in un incubatore di coltura del tessuto a 37 °C/5% CO₂. Il giorno successivo, non rimuovere dalla incubatrice fino a quando l'inoculo del batterio è preparato e pronto all'uso.

2. preparazione Listeria monocytogenes (Lm) per infezione

1. Inoculare 2 mL di infusione cervello-cuore (BHI) con una singola Colonia da una piastra di agar appena striato (< 2 giorni) di Lm e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 130 rotazioni/min.
2. Il giorno successivo, aggiungere 0,10 mL di coltura durante la notte a 2 mL pre-riscaldati BHI e continuare fino a quando la densità ottica (OD₆₀₀) è compreso fra 0,4 e 0,6 in incubazione a 37 ° C con agitazione.
3. Determinarne approssimativo titolo batterica utilizzando una formula di conversione empiricamente derivati. Nel nostro laboratorio, una cultura di Lm in crescita esponenziale in BHI è circa 1.3 x 10⁹ Colonia formando unità (CFU) /OD₆₀₀. Ridurre al minimo la quantità di tempo le colture batteriche sono esposti a temperatura ambiente.
4. Appena prima dell'infezione è necessario regolare il titolo a 5 x 10⁷ CFU/mL utilizzando pre-riscaldato DMEM/FCS come diluente.

3. infezione

1. Lavorare rapidamente e con precisione, aggiungere 20 µ l (1 x 10⁶ CFU; molteplicità di infezione, MOI = 5) dell'inoculo da Lm preparata (passaggio 2.4 sopra) ai pozzetti inclinando leggermente il piatto e posizionando accuratamente il puntale in media sovrastanti;
   Nota: evitare di toccare le pareti del pozzo con il puntale.
2. Delicatamente dispensare il contenuto di ogni pozzetto per garantire la completa miscelazione; non agitare o significativamente inclinare il piatto come questo si diffonderà Lm sopra le pareti del pozzo. 37 °C/5% CO₂ incubator, tornare piastra di coltura delle cellule.
3. Preparare una soluzione di gentamicina 10 µ g/mL usando media condizionati da pozzi non infetti come diluente.
4. A 30 minuti post infezione (mpi), attentamente aggiungere 30 µ l della soluzione di gentamicina (concentrazione finale di 2,5 µ g/mL) e delicatamente dispensare il contenuto del bene come prima e piastra di coltura cellulare ritorno all'incubatore a 37 °C/5% CO₂ .
5. A 60 mpi, vendemmia appositi pozzetti per analisi di CFU (60 mpi punto di tempo) o analisi FCM (come descritto di seguito nelle sezioni 4 e 5, rispettivamente).
6. Per pozzetti rimanenti, in tempi diversi da allora in poi sia raccogliere le cellule come prima o, per il dosaggio di emersione Lm , interamente di rimuovere il supporto dal pozzo e sostituire con 150 µ l di gentamicina-free media condizionati.

4. elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm dall'analisi di CFU di campionamento

1. Per raccogliere, inclinando leggermente il piatto e rimuovere con attenzione il supporto intero dal pozzo. Aggiungere 0,50 mL di acqua distillata sterile (dsH₂O). Dopo 30 s, trasferire l'acqua risultante lisato (10⁰) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
2. Preparare 10^-1 e 10^-2 diluizioni aggiungendo o 4,5 µ l o 50 µ l di acqua lisato a 450 µ l di dsH₂O e brevemente vortex per garantire la completa miscelazione.
3. Diffusione di 50 µ l del 10⁰, 10^-1 e/o 10^-2 campioni su piastre di agar Lisogenesi brodo (LB).
4. Dosaggio per emergente Lm (passo 3.6 sopra), rimuovere 10 µ l di media sovrapposizione e dividerlo in aliquote di due 5 µ l: ad un'aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS e per la seconda aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS contenente 5 µ g/mL Gentamicina. Il controllo di quest'ultimo distingue tra extracellulare Lm (gentamicina sensibile) e intracellulare Lm (gentamicina resistente) nel CFU successivo analisi.
5. Dopo 5 min a temperatura ambiente, aggiungere 90 µ l di dsH₂O, vortexare vigorosamente per 10 s e diffusione 50 µ l su piastre di agar LB.
6. Enumerare Lm colonie su piastre di agar LB dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C.

5. campionamento di elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm da citometria a flusso (FCM)

1. Preparare 264.7 celle grezze come descritto ai punti 1.1-4. Regolare le cellule a 1 x 10⁶ cellule/mL e aggiungere 1 mL (1 x 10⁶ cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.
2. Preparare l'inoculo del batterio come descritto al punto 2.1-2.3 e infettare le cellule con volume di inoculo corrispondente a un MOI di 50 (5 x 10⁷ CFU).
3. A 1,5 ore post infezione (hpi), raccogliere media dalla prima serie di pozzi e mettere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati.
4. Per raccogliere intracellulare Lm, aggiungere 1 mL di dsH₂O al pozzo e dopo 60 s, trasferire l'acqua risultante lisato di una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di 4% PFA. Vortexare vigorosamente per 10 s e posto su ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati. (Elaborazione del campione è descritta nel passaggio 5.8 qui sotto).
5. Per pozzetti rimanenti, rimuovere i supporti e sostituire con 1 mL di DMEM/FCS con 5 gentamicina µ g/mL per uccidere extracellulare Lm e restituire immediatamente le cellule a incubatore.
6. Dopo 30 min (2 hpi) rimuovere i supporti e sostituire con DMEM/FCS senza gentamicina.
7. Dopo 2 e 4 h (4 e 6 hpi) prendere la seconda e la terza volta punti raccogliendo media e lisati come punti 5.3 e 5.4.
8. Centrifugare le provette a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.
9. Sospendere ogni pallina nella macchiatura cocktail di 50 µ l di 4% PFA e 15 µ l di falloidina. Incubare le provette al buio a 4 ° C per 20 min.
10. Dopo incubazione aggiungere 1 mL di tampone di FACS a ciascuna provetta e pipetta su e giù per mescolare.
11. Gira tubi a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.
12. Sospendere ogni pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per un'analisi successiva.
13. Eseguire i campioni su un flusso cytometry e analizzare i dati raccolti.

6. elaborazione ed analisi di colonizzazione di Lm e risposte dell'ospite nel fegato di campionamento

1. Preparare Lm per infezione come descritto al punto 2.1-2.3.
2. Calcolare la quantità necessaria di sottocultura per titolo desiderato di 3 x 10⁶ CFU/mL.
3. Appena prima dell'infezione diluire la quantità di batteri calcolati con pre-riscaldato di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) in un volume finale di 1 mL. Questo è l'inoculo di input che viene iniettato nel mouse.
4. Usando una siringa da insulina 100U g ½ 28, disegnare 100 µ l (3 x 10⁵ CFU) di ingresso dell'inoculo e rimuovere eventuali bolle d'aria visibili.
5. Inserire il mouse (ceppo C57BL/6; maschi tra 6 e 12 settimane) il sistema di ritenuta della holding e utilizzare acqua tiepida (non più di 45 ° C) per dilatare la vena della coda, quindi iniettare l'inoculo ingresso nella vena.
6. Piastra 10^-2 e 10^-3 diluizioni dell'inoculo ingresso su piastre LB agar 10bcm e incubare per una notte a 37 ° C per determinare il dosaggio di ingresso effettivo.
7. Alle 18 hpi, umanamente eutanasia mouse (CO₂ asfissia seguita da dislocazione cervicale) e usando il peritoneo del mouse Apri taglio forbici sterili per raccogliere del lobo frontale del fegato utilizzando singole paia di forbici e pinzette per l'esterno e all'interno di il mouse. Posizionare il fegato in un 6cm di Petri sul ghiaccio.
8. Tagliare il fegato a dadini e inserire in un flaconcino di vetro con un'ancoretta magnetica. Aggiungere 2 mL di collagenasi di 2 mg/mL D ricostituito in DMEM senza FCS. Incubare le fiale a 37 ° C su un agitatore magnetico per 30−45 min. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, aggiungere 3 mL di DMEM/FCS per inattivare la collagenosi.
9. Filtrare le cellule attraverso un colino di cella di 70 µm in un tubo conico, eventualmente aggiungendo ulteriori DMEM/FCS.
10. Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone ACK per lisare cellule rosse del sangue.
11. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min nel buffer di ACK. Sospendere le cellule in 1 mL di DMEM/FCS.
12. Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere in 1 mL di DMEM/FCS. Quindi, contare le celle utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.
13. Trasferimento 1 x 10⁶ cellule in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e spin a pellet. Quindi sospendere in 1 mL di dsH₂O e vortexare per lisare le cellule. Piastra 50 µ l su piastre LB a non diluito e 10^-2 diluizioni e incubare a 37 ° C per enumerare Lm per analisi CFU.
14. 1 x 10⁶ cellule di trasferimento nelle provette di FACS per ogni campione di tessuto secondo i conteggi delle cellule e lavare con 1 mL di tampone di FACS.
15. Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.
16. Preparare un cocktail di anticorpi che contiene gli anticorpi di interesse basato sulla concentrazione consigliata per ogni anticorpo e FACS buffer. Vedi Tabella materiali per gli importi raccomandati utilizzati nell'analisi.
17. Sospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo cocktail e incubare le provette al buio a 4 ° C per 30 min.
18. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di buffer di FACS in ogni provetta e sospendere le cellule.
19. Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C e scartare il surnatante. Quindi sospendere il pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per più tardi.
20. Analizzare le cellule tramite flusso cytometry (Vedi punto 5.13).

Risultati

Valutare il ruolo dell'agente patogeno e codificata in host fattori che incidono infezione cellulare
Utilizzando le condizioni di infezione sopra descritte, 0,15% del selvaggio-tipo ingresso Lm viene recuperato dopo 1,5 h di co-incubazione con macrofagi coltivati (Figura 1A). Nei successivi 1,5 h di co-incubazione (3h post infezione, hpi), c'era un aumento di 4 volte nel recupero di vitali Lm e da 3 a 6 h...

Discussione

Grazie al suo programma di infezione cellulare rapida e processive, Lm è un patogeno ideale per sondare le attività cellulari che hanno un impatto infezione. È stata identificata una serie di fattori dell'ospite che positivamente o negativamente influenzare Lm infezione cellulare^11,12,13,14. Due tali host fattori caratterizzati nel nostro laboratorio, perforina-2 e l'inibitore...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
ACK Tampone di lisi	Gibco
Perline di compensazione reattiva all'ammina ArC	Life Technologies	A10346
BHI (Brain Heart Infusion) brodo	EMD Milipore	110493
Filtro cellulare, 70 &; m	VWR	10199-656
Collagenasi D	Roche	11088858001
DMEM media	Gibco	11965-092
Tubi FACS	BD Falcon	352054
FBS - Calore inattivato	Sigma-Aldrich	F4135-500ML
Hanks ' Soluzione salina bilanciata	Sigma-Aldrich	H6648-6X500ML
LB agar	Grow Cells MS	MBPE-4040
LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte gialle riparabili.	Life Technologies	L349S9
Rodamina Falloidina	Thermo Fischer	R415
SP6800 Analizzatore spettrale	Sony
Siringa 28 G 1/2" 1cc	BD	329461
TPP Coltura tissutale 48 piastre a pozzetti	MIDSCI	TP92048
Piastre per colture tissutali TPP a 6 pozzetti	MIDSCI	TP92406
UltraComp eBeads	eBioscience	01-2222-42
antigene
CD11b	Biolegend		Flurocromo = PE Cy5, Diluizione = 1/100, Clone = M1/70
CD11c	Biolegend		Flurochrome = AF 647, Diluizione = 1/100, Clone = N418
CD45	Biolegend		Flurochrome = APC Cy7, Diluizione = 1/100, Clone = 30-F11
F4/80	Biolegend		Flurochrome = PE, Diluizione = 1/100, Clone = BM8
Live/Dead	Invitrogen		Flurocromo = AmCyN, Diluizione = 1/100
Ly6C	Biolegend		Flurochrome = PacBlue, Diluizione = 1/200, Clone = HK1.4
MHC II	Biolegend		Flurochrome = AF 700, Diluizione = 1/200, Clone = M5/114.15.2
NK 1.1	Biolegend		Flurochrome = BV 605, Diluizione = 1/100, Clone = PK136