Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

Fanny Etienne; Vincenzo Mastrolia; Luc Maroteaux; Jean-Antoine Girault; Nicolas Gervasi; Anne Roumier

doi:10.3791/58788

Articolo metodologico

Imaging del due-fotone di attrazione dei processi Microglial verso ATP o serotonina nelle fette del cervello acuto

DOI:

10.3791/58788

⸱

31 gennaio 2019

Fanny Etienne¹^,²^,³ , Vincenzo Mastrolia¹^,²^,³ , Luc Maroteaux¹^,²^,³ , Jean-Antoine Girault¹^,²^,³ , Nicolas Gervasi^*¹^,²^,³ , Anne Roumier^*¹^,²^,³

¹Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM), UMR-S 1270 Paris, France, ²Sorbonne Université, Paris, France, ³Institut du Fer à Moulin, Paris, France

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Microglia, le cellule immunitarie residente del cervello, di rispondere rapidamente con i cambiamenti morfologici a modificazioni del loro ambiente. Questo protocollo viene descritto come utilizzare microscopia del due-fotone per studiare l'attrazione dei processi microglial verso la serotonina o ATP nelle fette acuta del cervello dei topi.

Abstract

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Cellule della microglia sono cellule immuni innate residente del cervello che costantemente la scansione loro ambiente con i loro processi lunghi e, al momento di rottura dell'omeostasi, subiscono rapidi cambiamenti morfologici. Ad esempio, una lesione laser induce in pochi minuti una crescita orientata dei processi microglial, chiamato anche "motilità direzionale", verso il luogo della ferita. Un effetto simile può essere ottenuto fornendo localmente ATP o serotonina (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In questo articolo, descriviamo un protocollo per indurre una crescita direzionale dei processi microglial verso un'applicazione locale di ATP o 5-HT in fettine di cervello acuto di topi giovani e adulti e per questa attrazione nel tempo della battuta da microscopia multifotonica. Viene proposto un semplice metodo di quantificazione con software di analisi di immagini gratuito e open-source. Una sfida che ancora caratterizza fette del cervello acuto è il periodo di tempo limitato, diminuisce con l'età, durante il quale le cellule rimangono in uno stato fisiologico. Questo protocollo, quindi, evidenzia alcuni miglioramenti tecnici (sezione imaging camera con un'aspersione doppia interfaccia medio, aria-liquido) volti ad ottimizzare la vitalità delle cellule microgliali sopra parecchie ore, soprattutto in fette da topi adulti.

Introduzione

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Cellule della microglia sono macrofagi residenti del cervello e svolgono un ruolo in entrambe le condizioni fisiologiche e patologiche¹^,². Hanno una morfologia altamente ramificata e sono costantemente estendere e ritrarre i loro processi³^,⁴. Questo comportamento "scansione" si crede di essere connessi e necessari per l'indagine del loro ambiente. La plasticità morfologica di microglia si esprime in tre modalità. In primo luogo, alcuni composti modulano rapidamente microglial morfologia: l'aggiunta di ATP⁵^,

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Protocollo

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Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal comitato etico locale (Comitato di Darwin, accordi 1170 # e #10921).

1. preparazione del vetro Micropipette per l'applicazione locale di composti

Preparare pipette da borosilicato tubi capillari in vetro a parete sottile con un estrattore di elettrodo. Regolare i parametri per ottenere pipette con un diametro di 4-5 µm alle loro estremità. Figura 2D Mostra una pipetta in campo chiaro a basso ingrandimento.

2. soluzioni

Garantire tale cristalleria unica che è stata pulita da un ciclo di autoclave, seguito da risc....

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Risultati

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Questo protocollo descrive un metodo per indurre, osservare e quantificare la crescita orientata dei processi microglial verso un composto applicato localmente, ad esempio, ATP o 5-HT, nel cervello acuto fette da giovane o adulto (almeno fino a due mesi) topi. Tra i fattori che contribuiscono al mantenimento di fette del cervello da animali adulti in uno stato integro per diverse ore è l'uso di due strumenti progettati per ottimizzare la sopravvivenza delle cellule a due passi del protoco.......

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Discussione

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Mantenendo, a differenza di in dissociato o organotipiche affettare cultura, un'integrità strutturale con regolazioni di rete limitata, fettine di cervello acuto permettono ai ricercatori di studiare microglia nel loro ambiente fisiologico. Tuttavia, uno dei principali limiti è il fatto che la procedura per affettare crea le lesioni che possono rapidamente compromettere la vitalità dei neuroni, specialmente nel cervello adulto. Come la microglia è particolarmente reattivo al danno cellulare, è importante limitare il più .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Ringraziamo la cellula e tessuto Imaging Facility del Institut du Fer à Moulin, dove sono state eseguite tutte le analisi e acquisizione delle immagini. Questo lavoro è stato supportato in parte dal Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, le scienze di Université Sorbonne e dalle sovvenzioni dalla Sorbonne Universités-Pierre et Marie Curie Università ( Programma Emergence-UPMC 2011/2014), la Fondation pour la Recherche sur le Cerveau, Fondation de France, la Fondation pour la Recherche Médicale "Equipe FRM DEQ2014039529", il Ministero francese della ricerca (Agence Nationale pour la Recherche Pr....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
per preparazione di pipette
Clark Borosilicate Thin Wall Capillaries	Harvard Apparatus	30-0065	Borosilicato a parete sottile senza filamento, 1,5 mm OD, 1,17 mm ID, 75 mm L , Confezione da 225
DMZ Estrattore universale	Zeitz Instrumente
Nome	Azienda	Numero catalogo	Comments
for solutions
Cloruro di calcio diidrato (CaCl₂)Sigma		C5080
Cloruro di colina	Sigma	C7527
D-(+)-Glucosio	Sigma	G8270
Acido L-ascorbico	Sigma	A5960
Soluzione di cloruro di magnesio 1 M (MgCl₂)	Sigma	63020
Cloruro di potassio SigmaUltra >99,0% (KCl)	Sigma	P9333
Bicarbonato di sodio (NaHCO₃)	Sigma	S5761
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma	S5886
Fosfato di sodio monobasico	Sigma	S5011
Piruvato di sodio	Sigma	P2256
Acqua ultrapura	MilliQ		per tutte le soluzioni
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
per preparazione della fetta
2x 200 mL piastre
80 mL Becher
Antlia-3C Pompa peristaltica digitale	DD Biolab	178961	Per la perfusione nei topi e la perfusione in camera a 2 fotoni (aCSF)
Carbogen 5% CO₂/95% O₂	Air Liquide France Industrie
Dolethal	Vetoquinol	Dolethal 50 mg/mL
Carte da filtro (Whatman)	Sigma	WHA1001042	Carta da filtro qualitativa Whatman, Grado 1 (Dimensione dei pori: 11µ M)
Forbici fini - Strumenti affilati	per le scienze fini	14060-60
Scatola per alimenti 10 cm di diametro, 8 cm di altezza colla
(cianoacrilato di etile)	Colla	super Loctite 3 power flex
Strumento ippocampale (spatola)	Strumenti per le scienze fini	10099-15	L'estremità più grande deve essere angolata a 90 gradi;
Ice
Iris Pinze (curve)	Moria	MC31
Panno per la pulizia delle lenti	THOR LABS
Filtro			diametro 7 cm
Lame di rasoio	Microscopia elettronica Scienze	72000	Per l'affettatrice,
lama
supporto per interfaccia fetta			fatto in casa, il file per la stampa 3D è fornito in Materiale supplementare
Forbici chirurgiche - Sharp	Fine Science Tools	14002-14
Affettatrice vibrante	Thermo Scientific	720-2709	Modello: HM 650V (Microtomo a lama vibrante)
Bagnomaria			Set a 32 ° C (prima fase di recupero)
Name	Azienda	Numero di catalogo	Comments
per l'imaging a fette
&volte; 25 0,95 NA Obiettivo a immersione in acqua	Leica Microsystems (Germania)	HCX Irapo
Microscopio verticale MP5 a 2 fotoni con scanner risonanti (8 kHz) e due rivelatori HyD Hybrid Leica	Microsystems (Germania)
Antlia-3C Pompa peristaltica digitale	DD Biolab	178961	Per la perfusione in camera a 2 fotoni con aCSF
Carbogen 5% CO₂/95% O₂	Air Liquide France Industrie	I1501L50R2A001
Chameleon Ultra2 Ti: laser allo zaffiro	coerenti (Germania),
bocca larga	ThermoFischer scientific	: 232-11	5,8 mL con punta ad alette, ma l'abbiamo tagliato (circa 7 cm) per avere un filtro di emissione a bocca di 4 mm di diametro
SP680	Leica Microsystems (Germania)
cubo fluorescente contenente un filtro di emissione 525/50 e un filtro dicroico 560 (per la raccolta della fluorescenza)	Bicchiere in vetro Leica Microsystems (Germania)
con 50 mL di ACSF per mantenere costante la perfusione della fetta
Sistema di riscaldamento	Warner Instrument Corporation	Automatic Heater Controller TC-324B	per mantenere la soluzione di perfusione a 32 ° C
camera			fatta in casa, il file per la stampa 3D è fornito in Materiale supplementare
porta fette ("arpa")			fatto in casa : forcina realizzata in platino con i due rami uniti da fili di nylon paralleli
Nome	Azienda	Catalog Number	Osservazioni
per la stimolazione della fetta
Adenosine 5′-trifosfato sale disodico idrato (ATP)	Sigma	A-26209	da preparare estemporaneamente: 1 mg/mL (3 mM) soluzione madre preparata il giorno dell'esperimento, mantenuta a 4 gradi; C (poche ore) e diluito poco prima dell'uso
Fluoresceina (opzionale)	Sigma	F-6377	utilizzare a 1 µ M finale
Micromanipolatore	Luigs e Neumann	SM7	collegato alla tenuta della micropipetta
per micropipette			uguale a quello per l'elettrofisiologia
Serotonina cloridrato	Sigma	H-9523	aliquote di 50mM di soluzione madre in H₂0 mantenuta a -20 °C. 500 &; Soluzione M preparata il giorno dell'esperimento.
Siringa 5 mL (senza ago)	Terumo medical products	SS+05S1
Tubo trasparente	Fischer Scientific	11750105	Saint Gobain Performance Plastics™ Tygon&commercio; E-3603 Tubi non
DEHPNome	Azienda	Numero di catalogo	Comments
per l'analisi delle immagini
Fiji		https://fiji.sc	Schindelin, J. et al Nat. Methods (2012) doi 10.1038
Icy	Institut	http://icy.bioimageanalysis.orgMetodi	(2012)
Nome	strongAzienda	Numero di catalogo	Comments
mice
CX3CR1-GFP topi	Jung et al, 2000		maschi o femmine, da P3 a 2 mesi; Abbiamo reincrociato questi topi su sfondo 129SV.
CX3CR1creER-YFP topi	Parkhurst et al 2013		maschi o femmine, da P3 a 2 mesi; abbiamo reincrociato questi topi su uno sfondo di 129sv.

di cristallizzazionein Pyrex a rete in nylon per bisturi, Pipette di trasferimento monouso ad esempio a di perfusione Supporto

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salter, M. W., Stevens, B. Microglia emerge as central players in brain disease. Nature Publishing Group. 23 (9), 1018-1027 (2017).
Tay, T. L., Savage, J., Hui, C. W., Bisht, K., Tremblay, M. -È Microglia across the lifespan: from origi....

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