Articolo metodologico

Isolamento e caratterizzazione di umani cellule staminali mesenchimali del cordone ombelicale-derivato da prematuri e neonati a termine

DOI:

10.3791/58806

⸱

26 gennaio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Kobe University Graduate School of Medicine, 2Department of Pathology, Kobe Children's Hospital, 3Department of Pediatrics, Hyogo College of Medicine, 4Department of Developmental Pediatrics, Shizuoka Children's Hospital, 5Department of Pediatrics, Nihon University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cordone ombelicale umano (UC) possono essere ottenuti durante il periodo perinatale a seguito di termine prematuro e postterm consegna. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-derivati di cellule staminali mesenchimali (MSCs-UC) da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) hanno un notevole potenziale terapeutico e attrarre l'interesse crescente in campo biomedico. MSCs sono originariamente isolato e caratterizzato dal midollo osseo (BM), poi acquisita da tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB) e del cordone ombelicale (UC). MSCs sono una popolazione eterogenea delle cellule con la capacità per (1) l'adesione alla plastica in condizioni di coltura standard, espressione di marcatori (2) superficie di CD73+/CD90+/CD105+/CD45 /CD34––/CD14 /CD19– Fenotipi /HLA-DR– –e (3) trilineage differenziazione in adipociti, osteociti e condrociti, come attualmente definiti dalla società internazionale per la terapia cellulare (ISCT). Sebbene BM è la fonte più ampiamente usata di MSCs, la natura invasiva di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da UC hanno vantaggi come la capacità di differenziazione e proliferazione vigorosa. Non c'è nessuna preoccupazione etica per il campionamento di UC, come è in genere considerato come rifiuti sanitari. UC umano inizia a sviluppare con la continua crescita della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a raggiungere 50-60 cm di lunghezza, e può essere isolato durante il periodo di consegna tutto neonato. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, abbiamo usato UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale. In questo protocollo, descriviamo l'isolamento e la caratterizzazione di UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellule staminali mesenchimali (MSCs) sono originariamente isolate e caratterizzata dal midollo osseo (BM)1,2 , ma può essere ottenute anche da una vasta gamma di tessuti compreso il tessuto adiposo, synovium, pelle, polpa dentale e degli annessi fetali 3. MSCs sono riconosciuti come una popolazione cellulare eterogenea che può proliferare e differenziarsi in condrociti, osteociti e adipociti. Inoltre, MSCs possiedono la capacità di migrare verso luoghi della ferita, sopprimere e modulare le risposte immunitarie e ritoccare e riparare le lesioni. Attualmente, MSCs da diverse fonti hanno attirato l'interesse crescente come una fonte per la terapia cellulare contro un certo numero di malattie intrattabili, compreso la malattia dell'innesto - contro - ospite, infarto miocardico e infarto cerebrale4,5 .

Sebbene BM è la fonte più ben caratterizzata di MSCs, l'invasività di aspirazione BM eticamente limita la sua accessibilità. Capacità di proliferazione e differenziazione di cellule staminali mesenchimali ottenute da BM generalmente diminuiscono con l'età del donatore. Al contrario, MSCs fetale ottenuto da annessi fetali come la placenta, sangue del cordone ombelicale (UCB), e del cordone ombelicale (UC) hanno vantaggi tra cui meno etiche preoccupazioni per quanto riguarda il campionamento e robusta la proliferazione e differenziazione capacità6 , 7. tra annessi fetali che solitamente vengono scartati come rifiuti sanitari, UCB e UC sono considerati un organo fetale, mentre la placenta è considerata di fetomaternal. Inoltre, placenta e UCB devono essere provati e raccolti nel momento esatto di consegna neonato, considerando che la placenta e UC possono essere raccolti ed elaborati dopo la consegna del neonato. Di conseguenza, UC è una promettente fonte MSC per terapia cellulare8,9.

UC umano inizia a sviluppare con la progressiva espansione della cavità amniotic a 4-8 settimane di gestazione, continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza e possono essere isolati durante tutto il periodo di consegna neonato10. Per guadagnare la comprensione nella patofisiologia delle malattie intrattabili, usiamo UC-derivato MSCs (UC-MSCs) da infanti consegnati alle varie età gestazionale11,12. In questo protocollo, descriviamo come isolare e caratterizzare UC-MSCs da OSSC a 19-40 settimane della gestazione.

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Protocollo

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L'uso di campioni umani per questo studio è stato approvato dal comitato etico della Kobe University Graduate School of Medicine (approvazione n ° 1370 e 1694) e condotto in conformità con gli orientamenti approvati.

1. isolamento e coltura di UC-MSCs

Nota: UC-MSCs sono state correttamente isolate, coltivate, ed espansa (più di numero di passaggio 4) da più di 200 UCs sottoposto al presente protocollo. Tra più di 200 UCs, 100% hanno dimostrato il successo isolamento UC-MSC, meno del 5% hanno mostrato una contaminazione accidentale, a meno di 15% hanno indicato l'arresto di crescita, e più di 80% hanno mostrato riuscita espansione UC-MSC.

  1. Raccogliere UC.
    1. Preparare una provetta di plastica da 50 mL, una forbice asettico e una bottiglia di 500 mL di alfa modificato medium essenziale dell'Aquila minimo (alfa MEM) a 4 ° C.
    2. Asetticamente UC tagliare con una forbice chirurgica a circa 5-10 cm di lunghezza e ritirarlo subito dopo la nascita neonato dalla sezione cesarean.
    3. Immediatamente posto la UC in un tubo di plastica da 50 mL e aggiungere 20-30 mL di alfa MEM nel tubo.
    4. Memorizzare la UC a temperatura ambiente (TA) fino a quando è trasportato al laboratorio.
      Nota: Asettica UC sono memorizzabili in medium senza siero a RT fino a 2 giorni. Di conseguenza, UC ottenuti dagli ospedali vicini possono essere raccolti se è trasportato al laboratorio entro 2 giorni.
  2. Sezionare la UC.
    1. Preparare un vassoio di plastica, pipette di 25 mL di forbici e pinze, pipette da 10 mL, sterilizzati, due piastre di coltura del tessuto da 60 mm, tampone fosfato salino (PBS), enzima purificato si fonde (Vedi Tabella materiali, ricostituito con PBS sterile in una concentrazione 13 Wünsch unità/ml e conservati a-80 ° C) e una bottiglia di 500 mL di mezzo di riduttore del siero (Vedi Tabella materiali).
    2. Scaldare il PBS, enzima purificato fonde, ridotto del siero medio e terreno di coltura [alfa MEM contenente 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% soluzione antibiotico antimicotico (AA) conservato a 4 ° C] a RT.
    3. Estrarre il UC dal tubo e inserirlo in un vassoio di plastica.
    4. Pesare e sezionare 5 g di UC con una forbice sterilizzata.
    5. Versare 10 mL di etanolo al 70% sopra la UC per sterilizzazione utilizzando una pipetta da 10 mL.
    6. Lavare la UC con 10 mL di PBS due volte utilizzando una pipetta da 10 mL.
    7. Posizionare il UC in un piatto di coltura del tessuto sterilizzato 60 mm (Vedi Figura 1, passaggio 1).
    8. Aggiungere 10 mL di mezzo di riduttore del siero nel piatto.
    9. Aggiungere 0,5 mL di miscele di enzima purificato per raggiungere una concentrazione finale di circa 0,62 Wünsch unità/mL.
      Nota: L'uso di miscele di enzima purificato invece di collagenasi tradizionale è stato indicato per migliorare il rendimento e redditività di UC-cellule staminali mesenchimali isolate da UC.
    10. Tagliare il UC in pezzi di 2-3 mm con forbici sterilizzate e forcipe (Vedi Figura 1, passaggio 2).
      Nota: Questo processo richiede circa 30 min.
    11. Incubare i pezzi UC a 37 ° C per 30 min in un'incubatrice di 5% CO2 .
    12. Tagliare i pezzi UC parzialmente digerito in pezzi più piccoli che scorrono facilmente attraverso una pipetta da 25 mL.
      Nota: Questo processo richiede circa 30 min.
    13. Incubare i pezzi più piccoli UC a 37 ° C per 15-45 min in un'incubatrice di 5% CO2 .
      Nota: Incubazione deve continuare fino a quando gli omogeneati diventano viscosi. Il tempo di digestione totale è di circa 120 min. Nel caso di utilizzo UCs da infanti prematuri, tuttavia, il tempo di digestione può essere accorciato perché quelli sono facilmente tagliare e digeriti.
  3. Isolare il UC-MSCs.
    1. Preparare quattro provette di plastica da 50 mL e una bottiglia di 500 mL di terreno di coltura.
    2. Dividere l'omogenato UC in due provette di plastica da 50 mL utilizzando una pipetta 25 mL, con circa 7,5 mL in ogni provetta.
    3. Aggiungere 20 mL di terreno di coltura in ogni provetta e mescolare bene.
    4. Filtrare ogni omogeneato UC attraverso un colino di cella di 100 µm posizionato sopra un nuovo tubo di raccolta di 50 mL, utilizzando una pipetta 25 mL per raccogliere le cellule derivate da UC.
      Nota: Questo processo dura circa 15 minuti ciascuno, come la soluzione UC digerita è appiccicosa.
    5. Centrifugare due tubi a 1.000 x g per 5 min.
    6. Attentamente, aspirare il supernatante e scartarlo.
    7. Risospendere il pellet cellulare in due tubi con 5 mL di terreno di coltura.
    8. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra di 60 mm e la coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, passaggio 3).
  4. Cultura UC-MSCs.
    1. Scaldare il PBS, tripsina-EDTA (0.25 w/v%) e cultura medio (alfa MEM contenente 10% FBS e 1% AA) a RT.
    2. Quando le cellule sono fissate ad una piastra di 60 mm, rimuovere il terreno di coltura e lavare con 5 mL di PBS due volte per rimuovere i detriti e globuli rossi.
      Nota: Cellule di solito appaiono in 3-5 giorni dopo il placcaggio iniziale (Vedi Figura 1, passaggio 4).
    3. Sostituire il terreno di coltura due volte a settimana e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% fino al confluency di 90-100%.
      Nota: Ciò richiede solitamente 7-14 giorni dopo il placcaggio iniziale.
    4. Lavare le cellule con 5 mL di PBS due volte, aggiungere 0,5 mL di tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
    5. Quando le cellule diventano arrotondate e distaccato, aggiungere 9 mL di terreno di coltura e mescolare bene per inattivare la tripsina.
    6. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra di 100 mm e la coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, punto 5).
    7. Sostituire il terreno di coltura due volte a settimana e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% fino al confluency di 90-100%.
      Nota: Questo di solito prende 4-8 giorni dopo il placcaggio iniziale.
    8. Lavare le cellule con 10 mL di PBS due volte, aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA e incubare a 37 ° C per 5-10 min.
    9. Quando le cellule diventano arrotondate e distaccato, aggiungere 9 mL di terreno di coltura e mescolare bene per inattivare la tripsina.
    10. Trasferire la sospensione cellulare in due nuove piastre di 100 mm e coltura a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% (Vedi Figura 1, punto 5).
    11. Ripetere la sottocultura (1:2 divisioni) fino al decimo passaggio (vedere Figura 1, punto 5).
      Nota: Perché le cellule coltivate in condizioni meno confluenti tendono a raggiungere precedente arresto della proliferazione, è importante per le cellule di passaggio con un rapporto di divisione di 1:2.
    12. Utilizzare celle al quinto a ottavo passaggio per analisi di superficie dell'indicatore delle cellule, analisi di differenziazione delle cellule ed altri esperimenti.
      Nota: Per mantenere la proliferazione vigorosa per quanto possibile, le cellule sono coltivate generalmente sotto più di 70-80% confluenti condizioni.

2. superficie dell'indicatore espressione di UC-MSCs

  1. Preparare le cellule in un piatto di 100 mm e dissociare li con 1 mL di tripsina-EDTA a 37 ° C per 5-10 min.
  2. Aggiungere 9 mL di terreno di coltura e centrifugare a 1.000 x g per 5 min.
  3. Aspirare il supernatante e scartarlo.
  4. Risospendere il pellet di cellule con 10 mL di PBS e centrifugare a 1.000 x g per 5 min, ripetere questo passaggio di lavaggio due volte.
  5. Risospendere le cellule con buffer di flusso cytometry (FCM) (PBS contenente 2 mM EDTA e 10% reagente bloccante) a ~ 1 × 106 cellule/mL.
  6. Trasferire 50-100 µ l di sospensione cellulare in una provetta da 1,5 mL; aggiungere ficoeritrina (PE)-anticorpi contro CD14, CD19, CD34, CD45, CD73, CD90, CD105 o HLA-DR; e incubare in ghiaccio per 45 min.
  7. Lavare le cellule con FCM buffer due volte e aggiungere 50-100 µ l di soluzione colorante attuabilità di 0,2% (Vedi Tabella materiali).
  8. Incubare a RT per 15 min, lavare le cellule con buffer di FCM due volte e celle filtranti attraverso un colino di cella di 70 µm.
  9. Eseguire le cellule attraverso il FCM e analizzare i risultati ottenuti utilizzando il software FCM secondo le istruzioni del produttore.

3. Trilineage differenziazione delle UC-MSC

  1. Eseguire il adipogenesis.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 5 × 103 cellule/mL.
    2. Piastra 1 mL di sospensione cellulare in un piatto di 12-pozzetti e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per ~ 24 h.
    3. Sostituire il terreno di coltura con mezzo di differenziazione adipogenico (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% per 2-3 settimane. Cambiare mezzo di differenziazione adipogenico due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte e con 60% isopropanolo tre volte.
    7. Preparare soluzione 0,5% olio rosso O sciogliendo 84 mg di olio rosso O in 10 mL di isopropanolo 100% e l'aggiunta di 6,7 mL di acqua distillata. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione 0,5% olio rosso O a temperatura ambiente per 20 min.
    8. Lavare le cellule con 60% isopropanolo tre volte e visualizzare sotto un microscopio.
  2. Eseguire l'osteogenesi.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 1 × 104 cellule/mL.
    2. Piastra 1 mL di sospensione cellulare in un piatto di 12-pozzetti e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per ~ 24 h.
    3. Sostituire il terreno di coltura con osteogeneic mezzo di differenziazione (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 1-2 settimane. Sostituire il differenziamento osteogenico terreno due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    7. Preparare 2% colore rosso di alizarina S soluzione sciogliendo 200 mg di alizarina S rossa con 10 mL di acqua distillata. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione al 2% colore rosso di alizarina S a RT per 3 min.
    8. Lavare i pozzetti con PBS tre volte e visualizzare sotto un microscopio.
  3. Eseguire chondrogenesis.
    1. Preparare una sospensione di cellule in terreno di coltura ad una concentrazione di 1,6 × 107 cellule/mL.
    2. Posizionare una goccia di 5 µ l di sospensione cellulare al centro del pozzo in un piatto di 12-pozzetti (micromass culture) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 2-3 h.
    3. Delicatamente aggiungere 1 mL di mezzo di differenziazione condrogenica (Vedi Tabella materiali) e incubare a 37 ° C in un incubatore di 5% CO2 per 4-7 giorni. Cambiare mezzo di differenziazione condrogenica due volte a settimana.
    4. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    5. Incubare le cellule in soluzione di formaldeide 4% per 30 minuti a TA.
    6. Lavare le cellule con PBS tre volte.
    7. Preparare soluzione allo 0,05% blu di toluidina sciogliendo 250 mg di blu di toluidina con 500 mL di tampone di acetato di sodio 0.1 M a pH 4.1. Macchia le cellule con 1 mL di soluzione di blu di toluidina allo 0,05% a temperatura ambiente per 30 min.
    8. Lavare le cellule con PBS tre volte e visualizzare sotto un microscopio.

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Risultati

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Le procedure da collezione UC alla cultura MSC sono riassunti nella Figura 1. UC di circa 5-10 cm di lunghezza possono essere raccolti da tutti i neonati trasportati dalla sezione cesarean. UC inizia a svilupparsi a 4-8 settimane di gestazione e continua a crescere fino a 50-60 cm di lunghezza, come mostrato nella Figura 2. Ci sono due arterie (A), una vena (V), cavo fodera (CL) e gelatina di Wharton (WJ) nel UC, come raffigurato...

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Discussione

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MSCs può essere isolato da una varietà di tessuti e sono una popolazione eterogenea di cellule che fare express non tutti gli stessi marcatori fenotipici. Qui, abbiamo delineato un protocollo che guida la raccolta e la dissezione di UC dai neonati pretermine e a termine e consente l'isolamento e la coltura di UC-MSCs. A seguito di questo protocollo, abbiamo isolato correttamente UC-MSCs che soddisfano i criteri ISCT19 da OSSC trasportato a 19-40 settimane di gestazione e ha dimostrato che rapprese...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato supportato da localizzativi per Scientific Research (C) (concessione numero: 25461644) e giovani scienziati (B) (concedere numeri: 15 K 19614, 26860845, 17 K 16298) di JSPS KAKENHI.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Provetta di plastica da 50 mLAS One Coporation, Osaka, GiapponeViolamo 1-3500-22
Piastra a 12 pozzettiAGC Techno Glass, Tokyo, GiapponeIwaki 3815-012
Piastra da 60 mmAGC Techno Glass, Tokyo, GiapponeIwaki 3010-060
Filtro cellulare (100 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2360
Filtro cellulare (70 μ m)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA Falcon 35-2350
Alpha MEMWako Pure Chemical, Osaka, Giappone135-15175
Siero fetale bovinoSigma Aldrich, St. Louis, MO172012
Siero ridotto medioThermo Fisher Scientific, waltham, MAOPTI-MEM Gibco 31985-070
Antibiotico-antimicoticoThermo Fisher Scientific, Waltham, MA Gibco 15240-062
Trypsin-EDTAWako Pure Chemical, Osaka, Giappone209-16941
PBSTakara BIO, Shiga, GiapponeT900
Miscele enzimatiche purificateRoche, Mannheim, GermaniaLiberase DH Research Grade 05401054001
PE-coniugato anticorpo primario di topo contro CD14BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347497lotto: 3220644, RRID: AB_400312
anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD19BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ340364Lotto: 3198741, RRID:
AB_400018 anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD34BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555822Lotto: 3079912, RRID:
AB_396151 anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD45BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555483Lotto: 2300520, RRID:
AB_395875 anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD73BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ550257Lotto: 3057778, RRID:
AB_393561 anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD90BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555596Lotto: 3128616, RRID:
AB_395970 anticorpo primario di topo coniugato PE contro CD105BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ560839Lotto: 4339624, RRID: AB_2033932
anticorpo primario di topo coniugato PE contro HLA-DRBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ347367Lotto: 3219843, RRID: AB_400293
topo coniugato PE IgG1 k isotipoBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555749Lotto: 3046675, RRID: AB_396091
topo coniugato PE IgG2a k isotipoBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555574Lotto: 3035934, RRID: AB_ 395953
IgG2b k di topo coniugato PE isotipoBD Bioscience, Franklin Lakes, NJ555743Lotto: 3098896, RRID: AB_396086
Colorante di vitalitàBD Bioscience, Franklin Lakes, NJFixable Viability Stain 450 562247
reagente bloccanteDainippon Pharmaceutical, Osaka, GiapponeBlock Ace UKB80
FCMBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSAria  III Cell Sorter
FCM softwareBD Bioscience, Franklin Lakes, NJBD FACSDiva
Terreno di differenziazione adipogenicoInvitrogen, Carlsbad, CAStemPro Kit di differenziazione per adipogenesi A10070-01
Mezzo di differenziazione osteogenicaInvitrogen, Carlsbad, CAKit di differenziazione per osteogenesi StemPro A10072-01
Differenziazione condrogenica medio Invitrogen, Carlsbad, CAKit di differenziazione per condrogenesi StemPro A10071-01
FormaldeidePolyscience, Warrigton, PA16% Formaldeide ultrapura EM Grado #18814
Olio rosso OSigma Aldrich, St. Louis, MOO0625
Arizarina rosso SSigma Aldrich, St. Louis, MOA5533
Blu toluidinaSigma Aldrich, St. Louis, MO
MicroscopioKeyence, Osaka, GiapponeBZ-X700
198161

Riferimenti

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