Questo articolo viene illustrato un metodo potente per quantificare i mitocondri o i lisosomi delle cellule viventi. La combinazione di coloranti specifici lisosoma o mitocondri con anticorpi fluorescente coniugati contro marcatori di superficie permette la quantificazione di questi organelli in popolazioni di cellule miste, come primario cellule ottenute da campioni di tessuto, utilizzando citometria a flusso multicolor.
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Articolo metodologico
Quantificazione di basata su citometria a flusso multicolor dei mitocondri e lisosomi in cellule di T
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule T utilizzano programmi metabolici differenti per soddisfare le loro esigenze funzionale durante il differenziamento e la proliferazione. I mitocondri sono componenti cruciali cellulare responsabile della fornitura di energia delle cellule; Tuttavia, i mitocondri in eccesso producono anche le specie reattive dell'ossigeno (ROS) che potrebbero causare la morte delle cellule. Di conseguenza, il numero dei mitocondri costantemente deve essere regolato per soddisfare le esigenze delle cellule. Questa regolazione dinamica avviene in parte attraverso la funzione dei lisosomi che rimuovere macromolecole e organelli avanzo/danneggiato. Quindi, il contenuto cellulare di lisosomiale e mitocondriale è indicatori chiave per valutare la regolazione metabolica delle cellule. Con lo sviluppo di sonde per organelli, lisosoma ben caratterizzato o mitocondri specifici coloranti sono diventati disponibili in vari formati per etichettare i mitocondri e lisosomi cellulari. Citometria a flusso multicolor è uno strumento comune per fenotipi cellulari di profilo e ha la capacità di essere integrato con altri dosaggi. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato di come combinare organello specifici coloranti con marcatori di superficie macchiatura per misurare la quantità dei lisosomi e dei mitocondri in popolazioni differenti delle cellule T su un citometro a flusso.
Introduzione
L'attivazione e la proliferazione delle cellule di T sono passaggi critici per il successo delle risposte immunitarie di montaggio. Gli avanzamenti recenti suggeriscono che il metabolismo cellulare è strettamente associato con lo sviluppo e la funzioni delle cellule T. Ad esempio, le cellule T naive si basano in gran parte su fosforilazione ossidativa (OXPHOS) per soddisfare la domanda di energia durante il ricircolo tra organi linfoidi secondari. Al momento dell'attivazione, le cellule T naive subiscono drastica metabolica riprogrammazione, compresa l'induzione di glicolisi aerobica per aumentare la produzione di ATP e per soddisfare l'enorme richiesta metabolica dur....
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Protocollo
La procedura di raccolta del tessuto del mouse qui descritta è stata approvata dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della National Yang-Ming University.
1. preparazione della sospensione del linfocita da organi linfoidi
- Eutanasia il mouse da un metodo approvato come l'inalazione di CO2 in un alloggiamento acrilico trasparente seguito da dislocazione cervicale per assicurare la morte.
Nota: Mantenere il tasso di flusso di CO2 per uno spostamento di 20% al minuto della camera e non superiore a 5 psi (libbra per pollice quadrato). Ci vogliono 2-3 minuti per un mouse a perdere coscienza. Mante....
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Risultati
Identificazione dei sottoinsiemi principali delle cellule di T in milza e timo
In breve, sospensioni di cellule singole da milza e timo sono state lisate di cellule rosse del sangue, incubate con 2.4G2 surnatante, seguite da colorante specifico organello e marcatore di superficie macchiando con gli anticorpi coniugati a fluorescenza (tabella 1). La progressione dello sviluppo dei timociti può es.......
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Discussione
Questo protocollo combina organello specifici coloranti e marcatore di superficie macchiatura per quantificare la quantità di mitocondri o lisosomi in popolazioni differenti delle cellule T. Questo metodo è stato sviluppato per superare le limitazioni dei requisiti di numero e omogeneità di cella per i metodi tradizionali, come la microscopia elettronica e l'analisi di immunoblot. È particolarmente utile nell'analisi di popolazioni di cellule rare ed esaminare contemporaneamente più tipi di cellule allo stesso tempo.
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interessi.
Ringraziamenti
Lo sviluppo di questo protocollo è stato sostenuto da sovvenzioni da Taiwan Ministero della scienza e tecnologia (MOST) NSC103-2320-B-010-002-MY2 e MOST104-2628-B-010-002-MY4 a C.L. Hsu. C.W. Wei è un destinatario di eccellente tesi premio dell'Istituto di microbiologia e immunologia, National Yang-Ming University.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Pinza Graefe da 10 cm (dritta e seghettata) | Forbici per iride Dimeda | ||
| da 11 cm (diritta con teste affilate/affilate) | Dimeda | ||
| Provetta da centrifuga da 15 ml | Thermo Fisher Scientific | 339650 | |
| Siringa da 5 ml | TERUMO | ||
| Piastra di Petri da 6 cm | α-plus | ||
| 70 µ m filtro cellulare | in nylon SPL Lifesciences | 93070 | |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | Sigma | A9434 | |
| Anti-topo CD25 | Biolegend | 102007 | Clone:PC61 |
| Anti-topo CD4 | Biolegend | 100453 | Clone:GK1.5 |
| Anti-topo CD44 | Biolegend | 103029 | Clone:IM7 |
| Anti-mouse CD62L | Biolegend | 104407 | Clone:MEL-14 |
| Anti-mouse CD8 | Biolegend | 100713 | Clone:53-6.7 |
| Anti-mouse TCRβ | Biolegend | 109233 | clone:H57-579 |
| BD LSRFortessa | BD Biosciences | ||
| 6381-92-6 | |||
| FALCON 5ml Polistirene Tubo a fondo tondo (tubo FACS) | BD Biosciences | 352052 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Hyclone | ATD161145 | |
| Flowjo, LLC | BD Biosciences | ||
| Acido idrossietilpiperazineetansolfonico (HEPES) | Sigma | H4034 | |
| L-glutammina (200 mM) | Gibco | A2916801 | |
| LysoTracker Green DND26 | Thermo Fisher Scientific | L7526 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali (100X) | Gibco | 11140050 | |
| MitoTracker Green FM | Thermo Fisher Scientific | M7514 | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Bicarbonato di potassio (KHCO3) | J.T.baker | 298-14-6 | |
| Soluzione di ioduro di propidio | Sigma | 25535-16-4 | |
| RPMI 1640 medium (polvere) | Gibco | 31800089 | |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Piruvato di sodio (100 mM) | Gibco | 11360070 |
Riferimenti
- Buck, M. D., O'Sullivan, D., Pearce, E. L. T cell metabolism drives immunity. Journal of Experimental Medicine. 212 (9), 1345-1360 (2015).
- Marelli-Berg, F. M., Fu, H., Mauro, C. Molecular mechanisms of metabolic reprogramming in proliferating cells: i....
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