Qui, presentiamo un protocollo che descrive il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e consente valutazioni ripetitivi mini-endoscopica del colon distale in situ per la presenza, caratteristiche e la severità di infiammazione colica all'interno dal vivo topi affetti da malattia intestinale graft - versus - host.
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Articolo metodologico
Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattia di acuta dell'innesto - contro - ospite (GvHD) rappresenta la complicazione più grave che i pazienti precedentemente sottoposti a faccia (allo-HCT) il trapianto di cellule staminali emopoietiche allogeniche e frequentemente è associata con un risultato clinico difficile. Mentre, per esempio, GvHD manifestazioni della pelle sono solitamente rispondenti alle terapie immune-soppressivi stabilite e sono, quindi, non prendendo un corso mortale, la presenza e l'intensità di GvHD intestinale, soprattutto delle parti metà inferiore dell'intestino, fortemente influenzare il risultato e nel complesso la sopravvivenza dei pazienti con acuta GvHD. opzioni terapeutiche sono essenzialmente limitata agli agenti immune-soppressivi classici cedendo solo moderati malattia-attenuare gli effetti. Quindi, conoscenza dettagliata circa la cascata immune residente in tessuto, cambiamenti del microbiota intestinale, e la risposta stromal prima, al momento e dopo l'inizio di GvHD intestinale sono urgentemente necessarie per comprendere gli eventi e i meccanismi sottostanti la patogenesi e a sviluppare opzioni terapeutiche innovative. Modelli murini di GvHD sono utilizzati spesso per identificare e valutare funzionalmente molecole e vie putativamente guida GvHD intestinale. Tuttavia, mezzi per monitorare e valutare l'infiammazione intestinale nel corso del tempo sono essenzialmente carenti poiché punteggi stabiliti per valutare e GvHD acuta di grado ordinariamente sono costituiti da vari parametri che riflettono piuttosto GvHD sistemica manifestazioni. La valutazione dettagliata di GvHD intestinale è stata limitata agli studi facendo uso dei topi eutanasizzati, escluse quindi essenzialmente longitudinale (cioè, cinetica) analisi del comparto Colico sotto una determinata condizione sperimentale (ad es., anticorpo-mediata blocco di una citochina proinflammatory) in topi dal vivo (cioè, in vivo). La valutazione in situ mini-endoscopica del colon distale dei topi allo-HCT-trattati qui descritto consente un) una dettagliata valutazione macroscopica dei diversi aspetti dell'infiammazione intestinale e b) la possibilità di raccogliere campioni di tessuto per analisi successive alle vari intervalli di tempo nel corso del periodo di osservazione. Nel complesso, l'approccio mini-endoscopico fornisce un avanzamento importante nel monitoraggio non invasivo preclinico e valutazione di GvHD intestinale.
Introduzione
Malignità ematopoietiche direttamente derivanti dal compartimento di cellule staminali ematopoietiche e incontrollata, rapida progressione e gravi disordini immune-mediati sono spesso indicazioni per eseguire allo-HCT1,2. Tuttavia, anche se la contabilità per l'avvenimento della risposta prognostica favorevole dell'innesto-contro-tumore, linfociti del donatore sono frequentemente inducendo e promuovere un attacco immune-mediata indesiderato delle componenti del tessuto sano all'interno il destinatario allo-HCT , un processo che viene chiamato malattia dell'innesto - contro - ospite3. Ma....
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Protocollo
I metodi sperimentali descritti qui sono stati approvati dal governo di Baviera, Baviera, Germania.
1. GvHD induzione
- Giorno 0: Irradiazione dal corpo intero dei topi destinatari
- Utilizzare femmina CD45.2+ H2kd+ BALB/c topi che sono almeno 10 settimane di vita come destinatari.
- Pesare e registrare il peso dei topi destinatari prima di induzione di GvHD.
Nota: Assicurarsi che il destinatario abbia un peso corporeo minimo di 20 g. Il peso corporeo iniziale servirà come valore di riferimento per calcolare la perdita di peso del mouse individuo nel corso d....
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Risultati
Il protocollo attuale, che descrive la valutazione mini-endoscopica delle lesioni associate a GvHD intestinale del colon distale, è stato stabilito e convalidato in topi precedentemente sottoposti ad induzione sistemica di un modello di GvHD acuto severo. In questo studio, abbiamo usato un MHC di classe mal adattato completamente sistema di modello in cui BALB/c topi sono stati irradiati letalmente, seguita da trapianto di T-cellula-esaurito allogeneic del midollo osseo e dall'amministraz.......
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Discussione
Il protocollo descrive la metodologia di induzione e mini-endoscopica valutazione del fenotipo Colico osservato nel corso della GvHD intestinale. Serve lo scopo più ampio di consentendo agli scienziati di studiare la GvHD intestinale longitudinalmente e non invadente nel corso intero della malattia (cioè, fin dall'inizio della manifestazione colica e progressione fino alle attività di malattia massima).
Tuttavia, ci sono alcuni passaggi critici e importanti limitazioni inerenti alle metodologi.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Collaborative Research Center (CRC) 221 (CRC/TR221-DFG, #324392634; progetto B03) (a K.H.) e CRC 1181 (CRC-DFG, progetto B05) (a K.H.), entrambi finanziati dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| BIOBEAM 2000 Gamma Irradiator | Gamma-Service Meical GmbH | ||
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS ) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | D8662-6x500ML | |
| Semken Ropeps (lunghezza: 13 cm; punte seghettate e curve) | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Forbici fini temprate (lunghezza: 8,5 cm; punte dritte; tagliente: 24 mm) | Fine Science Tools | 14090-09 | |
| RPMI-1640 Medium | Sigma-Aldrich Co. LLC. | R8758-500ML | |
| Ago ipodermico (26 G) | B. Braun Melsungen AG | 4657683 | |
| 1 mL syring | B. Braun Melsungen AG | 9166017V | |
| Provetta da 50 mL | Sarstedt Ag & Co.KG | 62.547.254 | |
| Filtro cellulare con 40 &; m rete | rete BD Falcon | 352340 | |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | Sigma-Aldrich Co. LLC. | 11209 | ingrediente del tampone di lisi ACK |
| Acido etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (Na2EDTA) | Carl Roth GmbH & Co.KG | 8043.2 | ingrediente del tampone di lisi ACK |
| Bicarbonato di potassio (KHCO3) | Merck KGaA | 1.048.540.500 | ingrediente del tampone di lisi ACK |
| CD90.2 MicroBeads, topo | Miltenyi Biotec GmbH | 130-049-101 | separazione di cellule magnetiche per isolare cellule del midollo osseo impoverite di cellule T |
| Pan Kit di isolamento delle cellule T II, | topo Miltenyi Biotec GmbH | 130-095-130 | separazione di cellule magnetiche per isolare le cellule T spleniche |
| Alexa Fluor 700 anti-topo CD45.2 Antibody (clone: 104; lotto: B252126; RRID: AB_493731) | Biolegend | 109822 | |
| Pacific Blue anti-mouse CD3 Antibody (clone: 17A2; lotto: B227246; RRID: AB_493645) | Biolegend | 100214 | |
| FITC anti-topo CD4 Antibody (clone: GK1.5; lotto: B225057; RRID: AB_312691) | Biolegend | 100406 | |
| PE/Cy7 anti-topo CD45.1 Anticorpo (clone: A20; lotto: B217246; RRID: AB_1134168) | Biolegend | 110730 | |
| APC/Cy7 anti-topo CD8a Anticorpo (clone: 53-6.7, lotto: B247008; RRID: AB_312753) | Biolegend | 100714 | |
| Siero bovino filtrato | Pan Biotec | P40-47500 | ingrediente del tampone FACS |
| Piastre con fondo a V in polistirene a 96 pozzetti | Greiner Bio-One | 651201 | |
| Provetta a fondo tondo in polistirene (5 mL) | Falcon | 352052 | |
| BD LSRCcitometro a flusso Falcon | BD Bioscience Co. | ||
| Siringa da insulina con interno sterile (30 G) | BD | 324826 | |
| Oxy Vet Oxymat 3 | Concentratore di ossigeno Eickemeyer | per anestesia | |
| NarkoVet | Eickemeyer | ||
| Eickemeyer | 214620 | ||
| Telescopio dritto | KARL STORZ SE & Co KG | 64301 AA | parte del setup sperimentale per la protezione della colonscopia |
| e la guaina d'esame | KARL STORZ SE & Co KG | 61029 C | parte del setup sperimentale per colonscopia |
| Guaina d'esame con canale di lavoro | KARL STORZ SE & Co KG | 61029 D | parte del setup sperimentale per colonscopia |
| Pinze per biopsia | KARL STORZ SE & Co KG | 61071 ZJ | Parte del setup sperimentale per la colonscopia |
| 175 Watt SCB XenonSorgente luminosa | KARL STORZ SE & Co KG | 20132120 | parte del setup sperimentale per la colonscopia |
| Cavo luminoso in fibra ottica | KARL STORZ SE & Co KG | 495 NL | parte del setup sperimentale per la colonscopia |
| Image 1 S3 Camera Head | KARL STORZ SE & Co KG | 22220030 | parte della configurazione sperimentale per la colonscopia |
| Immagine 1 SCB Unità di controllo della telecamera | KARL STORZ SE & Co KG | 22200020 | parte della configurazione sperimentale per la colonscopia |
| Monitor LCD | Olympus | OEV181H | parte della configurazione sperimentale per la colonscopia |
| Forano / Isofluran | AbbVie Inc. | B506 | |
| Soluzione di formaldeide 37 % | Carl Roth GmbH & Co.KG | 7398.1 | |
| 5.0 mL Puntale per dispenser | Eppendorf AG 30089456 |
Riferimenti
- Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P., Holler, E. Graft-versus-host disease. The Lancet. 373, 1550-1561 (2009).
- Magenau, J., Runaas, L., Reddy, P. Advances in understanding the pathogenesis of graft-versus-host disease. British Journal of Haematology. 173, 190-205 (2016).....
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Ristampe e permessi
