Articolo metodologico

Una tecnica di occlusione dell'arteria cerebrale media per indurre la depressione post-ictus nei ratti

DOI:

10.3791/58875

⸱

22 maggio 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Anesthesiology and Critical Care, Soroka University Medical Center, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 2Department of Neurosurgery, Soroka University Medical Center, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University of the Negev, 3Department of Biophysics and Biochemistry, Faculty of Biology, Ecology, and Medicine, Oles Honchar Dnipro National University

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Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per indurre la depressione post-ictus nei ratti, occludendo l'arteria cerebrale centrale attraverso l'arteria carotide interna. Usiamo il test di nuoto forzato Porsolt e il test di preferenza del saccarosio per confermare e valutare gli Stati d'animo depressivi indotti.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La depressione post-ictus (PSD) è la più ricorrente di tutte le complicazioni psichiatriche risultanti da un ictus ischemico. Una maggioranza maggiore (circa 60%) di tutti i pazienti affetti da ictus ischemico soffrono di PSD, un disturbo considerato un precursore ischemico correlato al colpo per aumentare la morte e la degradazione in salute. La patofisiologia della PSD è ancora oscura. Per studiare il meccanismo di sviluppo e l'occorrenza di PSD ulteriormente, e per scoprire una terapia, abbiamo tentato di sviluppare un nuovo protocollo che richiede occludendo l'arteria cerebrale centrale (MCA) attraverso l'arteria carotide interna (ICA) nei ratti. Questo protocollo descrive un modello di PSD indotto nei ratti attraverso l'occlusione dell'arteria cerebrale centrale (MCAO). Utilizzati anche nell'esperimento sono il test di nuoto forzato Porsolt e il test di preferenza di saccarosio per confermare e valutare l'umore depressivo dei ratti sotto inchiesta. Invece di inserire il catetere attraverso l'arteria carotide esterna (ECA), come previsto per la procedura originaria, questa tecnica MCAO ha il monofilamento che passa direttamente attraverso l'ICA. Questa tecnica MCAO è stata sviluppata pochi anni fa e porta ad una riduzione della mortalità e della variabilità. È generalmente accettato che i criteri utilizzati siano preferenziali nella selezione dei modelli biologici. I dati ottenuti con questo protocollo dimostrano che questo modello di MCAO potrebbe essere un modo per indurre PSD nei ratti e potrebbe potenzialmente portare alla comprensione della fisiopatologia e del futuro sviluppo di nuovi farmaci e altri agenti neuroprotettivi.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'ictus è quarto nell'elenco delle malattie perpetrare la morte negli Stati Uniti1,2,3, mentre provoca la maggior parte delle disabilità negli adulti nei paesi sviluppati4; Questo rende il colpo un contendente leader tra i problemi di salute più significativi del mondo. La normalità nei pazienti colpiti da ictus è rara, con circa il 15%-40% delle vittime di sopravvivenza che soffrono di invalidità permanente, il 20% che richiede cure istituzionali 3 mesi dopo l'inizio della corsa5, e circa un terzo dei sopravvissuti di 6 mesi che necessitano di altri per aiutarli a vivere ogni giorno6. Stroke riferito anche per le crescenti spese sanitarie nazionali7. Le stime dell'associazione americana del cuore hanno costi legati all'ictus negli Stati Uniti a oltre $50 miliardi in 20108.

Non solo ictus provoca danni a lungo termine degli individui, ma alcuni sopravvissuti tendono a soffrire disturbi emotivi e comportamentali, come la demenza, affaticamento, ansia, depressione, delirio, e l'aggressione9,10,11 ,12,13,14. Il sequel psicologico più ricorrente dopo un ictus è la depressione post-ictus (PSD), diagnosticata in circa 40%-50% di sopravvivenze15,16,17. La depressione indotta da ictus provoca una maggiore morbilità e mortalità18,19,20,21,22. La fisiopatologia della PSD non è nota completamente, ma è apparentemente causata da molteplici fattori ed è legata alla disabilità, al danno cognitivo e al sito di lesione23.

Il modello di ratto dell'ischemia focale cerebrale, creato da MCAO, è il modello animale più diffuso di ictus24,25,26,27. Nel dimostrare l'induzione della PSD nei ratti attraverso l'occludendo dell'MCA tramite l'ICA, sono impiegate tecniche che riducono al minimo la mortalità e la variabilità nel modello MCAO28.

L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di delineare i passi per indurre PSD nei ratti, occludendo l'MCA attraverso l'ICA, un modello modificato di MCAO, che riduce la mortalità e il risultato della variabilità28. Gli obiettivi specifici includono l'esecuzione di esami neurologici e istologici (che determinano il Punteggio di gravità neurologica [NSS], il volume della zona di infarto e l'edema cerebrale) per verificare l'efficacia di MCAO e l'utilizzo di test comportamentali per esaminare la influenza di questa procedura MCAO sullo sviluppo di disturbi emotivi, principalmente PSD.

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Protocollo

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Il Comitato per la cura degli animali dell'Università Ben-Gurion del Negev, Israele ha approvato tutte le procedure di trattamento e di prova utilizzate in questo protocollo.

1. preparazione dei ratti per la procedura sperimentale

Nota: Selezionare maschi adulti Sprague-Dawley ratti di peso 300-350 g.

  1. Casa i ratti, quattro per gabbia, in un Vivarium a 22 ° c e 40% di umidità, con un invertito 12 h ciclo chiaro/scuro (luci off a 8:00 a.m.) e accesso illimitato al cibo e acqua.
  2. Assegna casualmente i ratti a due gruppi, vale a dire un gruppo MCAO (n = 24) e un gruppo Sham (n = 19).

2. preparazione di ratti per la chirurgia

  1. Per preparare i ratti per la procedura MCAO modificata, anestetizzare ogni ratto per 30 min con una miscela di isoflurano (4% per induzione, 2% per chirurgia, e 1,3% per la manutenzione) in 24% ossigeno (2 L/min) in una camera di induzione e lasciare respirare spontaneamente29 ,30.
    Nota: Stimolare il riflesso di prelievo del pedale pizzicando la pelle tra le dita dei piedi e/o i piedini utilizzando pinze smussati. Considerare la profondità di anestesia adeguata quando il riflesso scompare.
  2. Mantenere la temperatura corporea di base a 37 ° c con una piastra riscaldante.
  3. Misurare la temperatura corporea di tutti i ratti attraverso una sonda posta nel retto del ratto prima di iniziare la procedura chirurgica.
  4. Mantenere costante la temperatura corporea (37 ° c) per tutti i ratti per minimizzare qualsiasi effetto ipotermico sul risultato neurologico e qualsiasi lesione neurologica.
  5. Applicare lacrime artificiali unguento ad entrambi gli occhi di ogni animale mentre si trovano sul tavolo di preparazione.
  6. Radersi il collo di ogni ratto e disinfettare la pelle con 70% di clorexidina alcolica (70% di alcol e 0,5% di clorexidina gluconato). Ripetere la procedura di disinfezione altre due volte.
  7. Coprire i ratti con le tende chirurgiche sterilizzate.

3. chirurgia (la tecnica MCAO)

Nota: Eseguire un intervento chirurgico come descritto da Boyko et al.28 e utilizzare gli strumenti forniti da McGarry et al.29 e Uluç et al.30.

  1. Eseguire un'incisione della linea mediana ventrale e sezionare la fascia superficiale.
  2. Eseguire con cautela una dissezione affilata e smussata all'interno dei tre muscoli a forma di triangolo (lo sternoioide, il digastrico e il muscolo sternomastoide) per identificare le arterie carotide (la ECA, l'ICA e l'arteria carotide comune [CCA]).
  3. Sezionare e esporre con cautela il CCA e l'ICA giusti.
  4. Separare la CCA destra e ICA dal nervo vago.
    Nota: Dopo aver identificato le arterie carotidi come previsto al punto 3,2, l'ICA verrebbe riconosciuta come metà dei rami CCA a fianco della Corte dei conti europea.
  5. Inserire un catetere (termo-blunted o rivestito in silicone 4-0 nylon) monofilamento direttamente attraverso l'ICA, ~ 18,5-19 mm dal punto di biforcazione del CCA destra nel cerchio di Willis fino a raggiungere una lieve resistenza, a occludere MCA.
    Nota: Il filamento termo-smussato e il nylon 4-0 rivestito in silicone giocano lo stesso ruolo e sono i monofilamenti più preferiti negli ultimi tempi, dato che forniscono una migliore occlusione rispetto al filo di nylon28,30.
  6. Legare una sutura di seta 4-0 intorno alla ICA appena sopra la destra CCA (arteria pterygopalatina) biforcazione per bloccare l'ICA prossimale al punto di inserimento del filamento permanentemente e distale ad esso temporaneamente.
  7. Legare l'ICA intorno al filo intraluminale per fissare la sutura di seta per prevenire il sanguinamento.
  8. Sottoporre i ratti sham-operati alla stessa procedura chirurgica dei ratti MCAO ma inserire un filo di nylon invece28.
    Nota: Il filo di nylon, come il nylon rivestito di silicio, occlude l'ICA, ma non è così efficace come quest'ultimo.
  9. Chiudere la ferita sul collo del ratto dopo aver occludere l'MCA, spegnere l'anestesia e posizionare il ratto in un incubatore sotto osservazione fino a quando non si sveglia.
    Nota: La necessità della Legazione prossimale è quella di occludere l'ICA, e quella della Legazione distale aggiuntiva è quella di ridurre il sanguinamento intorno al filamento e fissarlo in posizione. Inoltre, il ratto dovrebbe svegliarsi pochi minuti dopo la sua ferita è stata chiusa.

4. recupero post-chirurgico

  1. Somministrare 5 mL di soluzione salina al 0,9% per ogni ratto intraperitoneale, immediatamente dopo l'intervento chirurgico, per prevenire la disidratazione.
  2. Somministrare analgesia incondizionatamente il primo giorno dopo l'operazione; utilizzare Meloxicam 1 mg/kg SQ q24 h. dare dipyrone diluito (0,5 g disciolto in 400 mL di acqua potabile) ai ratti che mostrano sintomi di dolore durante i primi 3 giorni.
  3. Sacrifica qualsiasi ratto con convulsioni (le convulsioni sono causate dall'aumento della pressione intracraniale da edema cerebrale o emorragia cerebrale28).

5. Punteggio di gravità neurologico31

Nota: Questa procedura viene eseguita da due osservatori che non partecipano alla procedura chirurgica; testano i deficit neurologici e i deficit motori di grado su un punteggio cumulativo di 0-432. La valutazione di questo punteggio può essere eseguita a intervalli di tempo diversi; in questa indagine, è stato eseguito 50 minuti, 24 ore, 7, 15 e 30 giorni dopo l'intervento chirurgico. Di seguito sono riportati i passaggi per la valutazione del NSS. Anche se non è una necessità in questa situazione, questo punteggio è necessario per accertare l'ictus nei roditori al fine di somministrare il trattamento.

  1. Posizionare il ratto su un pavimento di ceramica e permettergli di muoversi liberamente per 1 min.
  2. Tirare delicatamente il ratto indietro per la coda e il grado come segue.
    1. Grade il ratto con punteggio 0 per nessun deficit neurologico.
    2. Classificare il ratto con il Punteggio 1 per la flessione arto anteriore.
    3. Classificare il ratto con il punteggio 2 per la presa arto anteriore debole contralaterale.
    4. Classificare il ratto con il Punteggio 3 per circondavano il lato paretico quando tirato dalla coda.
    5. Grade il ratto con il Punteggio 4 per il cerchio spontaneo32.
      Nota: Se si osservano più di una delle reazioni, la preferenza viene data all'azione con un punteggio più alto.

6. determinazione del volume infartuale (esame Hhistologic)

  1. Misurazione del volume dell'infarto
    Nota: Eseguire questa procedura come descritto in precedenza33,34. Misurare il volume di infarto del cervello utilizzando 2, 3, 5-triphenyltetrazolium cloruro (TTC) colorazione 24 h dopo la riperfusione.
    1. Euthanize cinque ratti di ogni gruppo, 24 h dopo l'ultimo NSS, esponendoli a un sovradosaggio di isoflurano in una camera a induzione.
    2. Decapitate i ratti e isolate rapidamente il loro cervello usando piccole forbici e pinze.
    3. Lavare il cervello isolato in 0,9% di soluzione salina.
    4. Esaminare i punti di sanguinamento sul cervello per escludere i topi che hanno subito un'emorragia subaracnoidea al circolo di Willis.
    5. Posizionare ogni cervello su un vetrino pulito su una confezione di ghiaccio-20 ° c e poi metterli in un frigorifero-20 ° c per 5 minuti per rendere il cervello più facile da affettare.
    6. Prendere il vetrino con il cervello su di esso fuori del-20 ° c frigo, rimetterlo sul-20 ° c ghiaccio Pack, e sezionare il palo frontale e il cervelletto con lama e pinze.
    7. Tagliare le sezioni cerebrali orizzontalmente in 2 mm di spessore con una lama per produrre sei fette.
    8. Preparare una soluzione 0,05% TTC aggiungendo 1,25 g di polvere TTC a 500 mL di soluzione salina normale prima del sacrificio, trasferire la soluzione a una piastra 24-Well (1 mL per pozzetto) rivestita in lamina e conservarla a 4 ° c.
      Nota: TTC e tessuto macchiato con TTC sono sensibili alla luce.
    9. Utilizzando pinze, trasferire le fette cerebrali alla piastra 24-well contenente la soluzione TTC (una fetta per pozzo) e allungare le fette nella soluzione.
    10. Incubare il contenuto della lastra a 37 ° c in un bagno d'acqua poco profondo per 30 min.
    11. Aspirare la soluzione TTC dalla piastra con una pipetta, lavarle con un fluido per il lavaggio del cervello e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
    12. Posizionare le fette nell'ordine in cui sono state tagliate su un vetro di laboratorio ed esaminare i segmenti con uno scanner.
    13. Analizza la dimensione dell'infarto come percentuale dell'intera fetta cerebrale, utilizzando il software di analisi ImageJ, basato sull'identificazione visiva.
  2. Analisi del volume infartuale35
    1. Quantificare il volume dell'infarto utilizzando un software di analisi immagine standard (ImageJ) e analizzare il volume cerebrale infartuale come percentuale dell'intero cervello dimensioni33.
    2. Posizionare le fette cerebrali sulle diapositive del microscopio in vetro e scansionarle con uno scanner ottico ad alta risoluzione (1.600 x 1.600 dpi) per un'analisi adeguata.
    3. Ritagliare le immagini e standardizzare la scala per tutte le immagini, utilizzando il righello metrico incluso nell'immagine acquisita.
    4. Misurare l'area del pallore contrassegnato in sei sezioni coronali di 2 mm consecutive utilizzando uno strumento bacchetta (tracciatura) e una selezione a mano libera sul software ImageJ 1.37 v36.
    5. Calcola il volume dell'infarto indiretto utilizzando la seguente formula37.

7. misurazione dell'edema cerebrale38

Nota: L'edema cerebrale è stato misurato 24 h dopo l'ultimo MCAO.  Euthanize animali con grave deficit neurologico interferire con mangiare e/o bere per almeno tre giorni, più di 20% perdita di peso, emiplegia o convulsioni.

  1. Valutare la grandezza dell'edema dell'emisfero destro utilizzando la sommatoria delle aree a fette coronale per calcolare i volumi degli emisferi destro e sinistro in unità arbitrarie (pixel).
    Nota: Utilizzare il software ImageJ 1.37 v per questo calcolo, dopo la scansione ottica (risoluzione: 1.600 x 1.600 dpi). Selezionare l'area di interesse e utilizzare la funzione misura dal menu analisi . Le macro sono state usate nella nostra indagine.
  2. Esprimere l'area dell'edema cerebrale come percentuale delle aree standard nell'emisfero controlaterale inalterato.
  3. Calcola il grado di gonfiore usando l'equazione sviluppata in precedenza39.

8. paradigmi comportamentali

  1. Esegui test comportamentali tra i giorni 30 e 33 dopo l'intervento chirurgico in una stanza chiusa, silenziosa e controllata dalla luce.
  2. Assegna gli investigatori accecati a tutte le procedure sperimentali per videocassetta tutti i test comportamentali con un programma disponibile in commercio.
  3. Test preferenza saccarosio40,41
    1. Collocare i ratti in singole gabbie nella stessa stanza in cui sono alloggiati durante il ciclo scuro.
    2. Per le prossime 24 ore, mettere una bottiglia di 100 mL di soluzione di saccarosio 1% (w/v) in ogni gabbia con il ratto da testare e consentire l'adattamento del ratto.
    3. Dopo 24 h, privare i ratti di cibo e acqua per 12 h rimuovendo le bottiglie.
    4. Poi dopo 12 h, posizionare due bottiglie in ogni gabbia per 4 h, una contenente 100 mL di acqua di rubinetto e un'altra contenente 100 mL di soluzione di saccarosio (1% [w/v]).
    5. Registrare la quantità di soluzione di saccarosio e acqua consumata dai ratti in millilitri. Calcolare l'affinità per la preferenza di saccarosio come segue.
  4. Porsolt forzato Swim test42
    Nota: Il test di nuoto forzato Porsolt è stato effettuato come descritto in un precedente protocollo pubblicato da Zeldetz et al.40 e Boyko et al.42. Il principio di questo test afferma che, quando i ratti sono costretti a nuotare in una zona ristretta da dove, non possono fuggire, alla fine diventano immobili, cessando qualsiasi tentativo di sfuggire all'acqua43,44. Questo test è stato effettuato in una stanza diversa durante il ciclo scuro.
    1. Collocare ogni ratto in un cilindro verticale in plexiglass (altezza: 100 cm; diametro: 40 cm) contenente 80 cm di acqua a 25 ° c per 15 min per abituarsi.
    2. Estrarre il ratto e lasciare asciugare per 15 minuti in una custodia riscaldata (32 ° c).
    3. Riportare il ratto alla sua gabbia di casa (originale).
    4. Ripetere il passo 8.4.1 24 h più tardi, questa volta per l'inchiesta, per 5 min.
    5. Videotape il test 5 min e calcolare la durata totale dell'immobilità durante quel periodo.

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Risultati

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I risultati istologici (tabella 1) hanno rivelato un volume di infarto statisticamente significativo come percentuale del cervello totale (p < 0,0001) post-MCAO rispetto agli animali del gruppo Sham-Control. Anche riferito è stato un edema cerebrale statisticamente significativo quando la valutazione dal gruppo sperimentale (p < 0,0003) è stato messo fianco a fianco con quello del gruppo Sham-controllo.

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Uno dei modi in cui la tecnica MCAO qui presentata potrebbe essere ritenuta più sicura rispetto al modello originale MCAO è illustrata dal fatto che la Corte dei conti e le sue filiali, tra cui l'arteria occipitale, la lingua terminale e l'arteria mascellare, non sono compromesse Quando si occludere l'MCA tramite l'ICA. L'offset originale del modello MCAO della ECA (e delle sue filiali), dissezione e coagulando distalmente i46, provoca la masticazione compromessa, a causa di un compromesso con l'a...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il professor Olena Severynovska del dipartimento di fisiologia, facoltà di biologia, ecologia e medicina, Oles Honchar Dnipro University, Dnipro, Ucraina per il suo sostegno e utili contributi alle nostre discussioni. I dati ottenuti fanno parte della tesi di dottorato di R.K..

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Tampone assorbente---
Scatola in perspex nero senza lucentezza-(120 cm & volte; 60 cm & volte; 60 cm), divisa in una zona centrale del 25% e nella zona di confine circostante
BottiglieTechniplastACBT0262SUbottiglie da 150 ml riempite con 100 ml di acqua e 100 ml di soluzione di saccarosio all'1% (p/v)
ElectricShock Heat System Ultasonic Inc.--
Horizon-XLMennen Medical Ltd
Imaging SystemKodak-Perl'imaging e la quantificazione
Monofilamento---
Asciugamani di cartaFarmacia-Asciugamaniasciutti utilizzati per mantenere asciutti i ratti dopo averli immersi in acqua
Cilindro Pexiglass--un cilindro alto 100 cm e di diametro 40 cm utilizzato per l'esecuzione del test di nuoto forzato
Purina ChowPurina5001Il cibo da laboratorio per roditori somministrato a ratti, topi e criceti è un alimento del ciclo di vita che è stato utilizzato nella ricerca biomedica per oltre 5 decenni. Fornito ai ratti ad libitum in questo esperimento
Gabbie per rattiTechniplast2000PAlloggiamento convenzionale per roditori. È stato utilizzato per alloggiare i ratti durante l'esperimento
Scanner Canon CanoScan4200F-Videocamera
ETHO-VISION (Noldus)-Videocamera digitale per la registrazione ad alta definizione del comportamento dei ratti in test in campo aperto

Riferimenti

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Formal Correction: Erratum: A Middle Cerebral Artery Occlusion Technique for Inducing Post-stroke Depression in Rats
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