Articolo metodologico

La tecnologia di scansione 3D che sposa microcircuiti e immagini cerebrali su macro in 3D Novel Embedding Overlapping Protocol

DOI:

10.3791/58911

⸱

12 maggio 2019

 ,  ,  , 
1Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, Kyoto University, 2Graduate School of Informatics, Kyoto University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo articolo introduce un protocollo sperimentale utilizzando la tecnologia di scansione 3D che collega due scale spaziali: la scala spaziale macroscopica dell'anatomia dell'intero cervello immagine della risonanza magnetica a >100 m e la scala spaziale microscopica delle distribuzioni neuronali utilizzando colorazione immunohistochimica e un sistema di array multielettrodi e altri metodi (10 m).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il cervello umano, essendo un sistema multiscala, ha sia segnali elettrici macroscopici, che scorrono globalmente lungo spessi fasci di fibre di materia bianca, sia microscopici picchi neuronali, che si propagano lungo assoni e dendriti. Entrambe le scale completano diversi aspetti delle funzioni cognitive e comportamentali umane. A livello macroscopico, la risonanza magnetica è stata l'attuale tecnologia di imaging standard, in cui la più piccola risoluzione spaziale, la dimensione del voxel, è di 0,1-1 mm3. Inoltre, a livello microscopico, precedenti studi fisiologici erano consapevoli di architetture neuronali non uniformi all'interno di tali voxel. Questo studio sviluppa un modo efficace per incorporare accuratamente i dati microscopici in una mappa macroscopica interfacciando la ricerca scientifica biologica con i progressi tecnologici nella tecnologia di scansione 3D. Dal momento che la tecnologia di scansione 3D è stata utilizzata principalmente per l'ingegneria e la progettazione industriale fino ad ora, è stata riproposta per la prima volta per incorporare microconnettomi in tutto il cervello, preservando i picchi naturali nelle cellule cerebrali viventi. Per raggiungere questo scopo, in primo luogo, abbiamo costruito un protocollo di scansione per ottenere immagini 3D accurate da bio-organismi viventi intrinsecamente difficili da immaginare a causa di superfici umide e riflettenti. In secondo luogo, abbiamo addestrato a mantenere la velocità per prevenire la degradazione del tessuto cerebrale vivente, che è un fattore chiave per mantenere condizioni migliori e la registrazione di picchi neuronali più naturali dai neuroni attivi nel tessuto cerebrale. Due immagini di superficie corticali, estratte in modo indipendente da due diversi moduli di imaging, vale a dire immagini di superficie rm . Questa precisione è paragonabile in scala alla risoluzione microscopica delle distanze intercellulari; inoltre, è stabile tra diversi topi singoli. Questo nuovo protocollo, il nuovo protocollo 3D che incorpora la sovrapposizione (3D-NEO), collega i livelli macroscopici e microscopici derivati da questo protocollo integrativo e accelera nuove scoperte scientifiche per studiare architetture di connettività complete (cioè, ponti microcongela).

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Architetture multiscala non uniformi in varie organizzazioni fisiche e biologiche si trovano comunemente1,2. Il cervello è anche un'organizzazione di rete molto non uniforme e multiscala3,4. Varie funzioni cognitive sono codificate in tali organizzazioni di rete, tenendo cambiamenti temporali dei modelli di picco elettrici delle popolazioni neuronali in risoluzioni temporali submillisecondi. Storicamente, le reti complesse tra i neuroni sono state strutturalmente osservate in dettaglio utilizzando le tecniche di colorazione di Santiago Ramàn y Cajal da oltre 150 anni fa5. Per osservare i comportamenti di gruppo dei neuroni attivi, i ricercatori hanno sviluppato varie tecnologie di registrazione6,7,8, e i recenti sviluppi significativi di tali tecnologie ci hanno permesso di registrare attività elettriche da un numero enorme di neuroni contemporaneamente. Inoltre, da tali attività funzionali, gli scienziati sono riusciti a ricostruire reti di interazioni causali tra un numero enorme di neuroni e hanno dichiarato l'architettura topologica delle loro complesse interazioni 'microconconnectoma'9 . Osservazioni macroscopiche del cervello consentono anche per quanto riguarda un intero cervello come un'organizzazione di rete, perché molte regioni del cervello sono collegati da più fibre-bundle. L'incorporazione di microconsomi nella mappa cerebrale globale ha ancora chiare limitazioni all'interno degli attuali progressi tecnologici, motivo per cui questo protocollo di incorporamento è così importante. Tuttavia, ci sono molte sfide per lo sviluppo del protocollo di incorporamento. Per esempio, al fine di osservare le attività di circuiti neuronali locali viventi in regioni del cervello puramente isolate, le fette di cervello devono essere prodotte per le registrazioni in vitro. Inoltre, le registrazioni da fette di cervello per le registrazioni in vitro sono ancora una scelta importante per almeno due motivi. In primo luogo, non è ancora facile osservare le attività di molti singoli neuroni viventi contemporaneamente da regioni cerebrali più profonde di 1,5 mm e in alta risoluzione temporale (<1 ms). In secondo luogo, quando speriamo di conoscere l'architettura interna di un circuito neuronale locale, dobbiamo fermare tutti gli input provenienti da regioni cerebrali esterne per eliminare i fattori di confusione. Al fine di identificare le direzioni e le posizioni delle fette di cervello prodotte, sarà ulteriormente necessario integrare le posizioni spaziali di queste fette di cervello prodotte utilizzando le coordinate. Ci sono, tuttavia, alcuni modi sistematici e affidabili per fare fette di cervello in modo organizzato10,11. Qui viene introdotto un nuovo protocollo di coregistrazione, utilizzando la tecnologia di scansione 3D per la ricerca neuroscientifica al fine di fornire un protocollo integrativo. Questo protocollo agisce per coordinare micro e macroscale e incorporare i microdati MEA (multielettrode array)12,13 e i dati di colorazione su uno spazio di risonanza magnetica macroscopico attraverso superfici di scansione 3D di cervelli estratti, cervelli non registrati in modo invasivo. Sorprendentemente, questo ha mostrato un errore di distanza di soli 50 dollari come valore di modalità dell'istogramma. Di conseguenza, i valori di modalità delle distanze minime tra due superfici tra la superficie della risonanza magnetica e la superficie 3D scansionata erano quasi 50 m per tutti e sei i topi, il che è un numero adatto durante il controllo della comunanza tra gli individui. La larghezza tipica della fetta ha avuto un'attività di picco registrata di circa 300 m.

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Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutte le procedure sperimentali qui descritte sono state approvate dal Comitato per la cura degli animali dell'Università di Kyoto.

1. Animali (giorno 1)

  1. Preparare i topi c57BL/6J femminili (n - 6, di età compresa tra 3 e 5 settimane).
    NOT: Questo protocollo è applicabile a tutte le specie di roditori.

2. Impostazioni RM (giorno 1)

  1. Mettere il mouse in una scatola di anestesia acrilica posta su un tappetino riscaldatore regolato a 37 gradi centigradi utilizzando un controller di smizzo riscaldatore.
  2. Anestesizzare il mouse con 2% isoflurane in aria che scorre attraverso la scatola ad una portata di 1,4 L/min utilizzando un sistema di anestesia, che è composto da un vaporizzatore isoflurane, misuratore di flusso d'aria, e compressore d'aria.
  3. Dopo l'induzione dell'anestesia, posizionare il topo in una culla compatibile con la risonanza magnetica nella posizione prona. Controllare se l'anestesia è sufficiente tagliando un dito del mouse con una pinzetta per vedere se non sente dolore.
  4. Fissare la testa del mouse con la barra dei denti e la maschera del viso dotata della culla. Mantenete quindi l'anestesia con l'1%-1,5% di isoflurane in aria a 1,4 L/min attraverso la maschera del viso.
  5. Inserire una sonda di temperatura tetrgama nel retto del mouse e posizionare un sensore di respirazione sensibile alla pressione sul retro del mouse.
  6. Trasferire la culla sul foro di un magnete di risonanza magnetica. Regolare la concentrazione dell'isoflurane a circa l'1%-1,5% per garantire una profondità stabile e riproducibile di anestesia. Monitorare se la temperatura corporea è controllata tra i 33,35 gradi centigradi e la frequenza respiratoria compresa tra 0,5,1,3 Hz durante l'intero periodo degli esperimenti di risonanza magnetica, utilizzando un sistema di monitoraggio (Tabella deimateriali) per i parametri fisiologici dei piccoli animali con software dedicato (Tabella dei Materiali).
  7. Utilizzando il valore misurato della temperatura rettale, regolare la temperatura corporea controllando la temperatura dell'aria calda fornita nel magnete foro da un sistema di riscaldamento dotato del sistema di monitoraggio.

3. Acquisizioni MRI (giorno 1)

  1. Preparativi per la risonanza magnetica 3D T2 ad alta risoluzione
    1. Acquisire tre immagini di risonanza magnetica (MR) in tre piani ortogonali (assiali, coronali e sagittale) per controllare la posizione del topo.
    2. Riferendosi a queste immagini, regolare la posizione del mouse spostando la culla in modo che il centro del cervello del mouse è posizionato al centro del risonatore così come al centro delle bobine di gradiente in direzione assiale.
    3. Regolare il sistema DI risonanza magnetica regolando l'omogeneità del campo magnetico statico (shimming) e la frequenza di base e calibrando la potenza della radiofrequenza (RF).
    4. Acquisire immagini a bassa risoluzione 2D multifetta T2 ponderate T2 (T2W) con orientamenti coronali e sagittali. Sulla base di queste immagini, determinare il campo visivo (FOV) per una scansione RM T2W 3DW ad alta risoluzione.
    5. Eseguire lo shimming localizzato utilizzando un algoritmo di shim automatico FASTMAP. Per il protocollo FASTMAP, selezionare un'area rettangolare che copra l'intero cervello. Dopo il completamento dello shimming localizzato, confermare l'inomogeneità del campo B0 all'interno dell'area del cervello mediante uno spettro localizzato di 1H utilizzando la spettroscopia risolta in punti (PRESS).
    6. Acquisire immagini T2W 3D a bassa risoluzione per assicurarsi che le impostazioni di scansione per la risonanza magnetica T2W 3D ad alta risoluzione siano appropriate controllando la posizione appropriata dell'FOV, l'assenza di artefatti avvolgenti (aliasing) e l'efficiente soppressione dei segnali di grasso.
  2. Sequenza di impulsi di imaging
    1. Dopo i preparativi descritti sopra, acquisire immagini T2W 3D ad alta risoluzione dell'intero cervello del mouse, utilizzando una rapida acquisizione con la sequenza di miglioramento del rilassamento (RARE).
      NOT: In questo articolo sono stati condotti esperimenti di risonanza magnetica su un foro orizzontale 7 T, 210 mm, scanner preclinico, dotato di un sistema di gradiente di 440 mT/m al tempo di rampa 100 . Un risonatore del volume della quadratura con un diametro interno di 35 mm è stato utilizzato per l'eccitazione RF e la ricezione del segnale. I dati della risonanza magnetica sono stati acquisiti con un software di operazione dedicato. I parametri di acquisizione della sequenza di impulsi RARE 3D utilizzata in questo studio sono riassunti nella Tabella 1.

4. Preparazione di soluzioni sperimentali (giorno 2)

  1. Preparare 500 mL di una soluzione di taglio a freddo ghiaccio (2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 7 mM MgCl2, 15 mM di glucosio, 25 mM NaHCO3, 0,5 mM CaCl2, 11,6 m di sodio ascorbate, 3,1 mM di pyruvate di sodio e 100 mM di cloruro di colina, bollito con 95% O2 e 5% CO2). Regolare il pH a 7,3-7,4.
  2. Preparare 1 L del liquido cerebrospinale artificiale (ACSF; 127 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 1 mM MgCl2, 15 mM di glucosio, 25 mM NaHCO3e 2 mM CaCl2, bolla con 95% O2 e 5% CO2). Regolare il pH su 7.3–7.4.

5. Preparazione dell'attrezzatura (giorno 2)

  1. Preparare un magnete "anello" di 6,6 cm2 quadrati, 0,5 cm di spessore e, in primo luogo, posizionare nastro nero e, secondo, nastro chirurgico sull'anello (Figura 1c-2). Si noti che questo materiale è chiamato una base di blocco cerebrale (BBB), e tenerlo freddo su blocchi di ghiaccio.
    NOT: Successivamente, i nastri saranno attaccati alla stazione di taglio con blocchi cerebrali per il vibratoma. L'anello quadrato viene utilizzato come base inferiore della BBB per soddisfare due scopi, vale a dire migrare i blocchi cerebrali senza problemi dalla stazione di scansione 3D a un vibratoma e misurare con precisione le altezze dei blocchi cerebrali nella fase di scansione.
  2. Impostare il BBB con un giradischi automatico. Accendere lo scanner e il giradischi. Avviare il software di elaborazione delle immagini.
  3. Precedendo tutti gli esperimenti, eseguire calibrazioni delle telecamere e il giradischi collegato di una proiezione di luce strutturata e scanner 3D desktop-tipo.
    1. Accendere il proiettore centrale, le due telecamere e il giradischi. Quindi, aprire il software. Nel software, fare clic su Configurazione ottica e selezionare l'area dell'immagine come 100 x 80 e i numeri della griglia come 100 x 100. Quindi, la calibrazione della fotocamera inizia secondo i seguenti quattro passaggi.
      1. Per l'impostazione del proiettore, posizionare il foglio di calibrazione sulla banchiera e posizionare la scheda di calibrazione sul foglio di calibrazione per regolare il punto di fissaggio dell'area di misura al centro del foglio e l'orientamento verso la parte anteriore. Regolare la distanza tra il proiettore e la scheda a circa 200 mm. Allentare le viti fissando le due manopole e ruotare le manopole per regolare la sensibilità della luce e la messa a fuoco delle due telecamere. Quindi, fare clic su freccia per andare al passaggio successivo.
      2. Per orientare le telecamere, allentare le viti fissando le due telecamere stesse e spostare le posizioni e le rotazioni per sovrapporsi alla linea centrale sulla scheda di calibrazione, la linea verticale e la croce gialla proiettata dal proiettore. Fissare le telecamere e fare di nuovo clic su Freccia. Quindi, lo schermo diventerà scuro.
      3. Per mettere a fuoco le telecamere, dopo aver allentato le viti di fissaggio delle manopole, aumentare la sensibilità della luce e regolare nuovamente la messa a fuoco. Quindi, fare clic su freccia per andare al passaggio successivo.
      4. Per il valore F e il grado di esposizione (della fotocamera), regolare nuovamente la sensibilità della luce appena sotto il punto in cui la regione rossa scompare. Quindi, fare di nuovo clic su freccia e fare clic su Inizio calibrazionee scegliere Sì se viene richiesto Hai completato l'impostazione ottica?
    2. Fare clic su Inizializza la calibrazionee verificare se i valori dei pixel sono normalizzati tra 0 e 255. Quindi, fare clic su Continua.
    3. Seguendo le posizioni suggerite, registrare le immagini di nove diverse angolazioni relative dello scanner e della scheda di calibrazione e terminare dopo aver confermato il processo di calibrazione e, infine, fare clic su Aggiorna della calibrazione.
    4. Sostituire la scheda di calibrazione per il giradischi e fare clic sulla calibrazione tavola girevole.
      NOT: Ora, tutte le calibrazioni sono finite.

6. Scansione della superficie del cervello, affettatura e registrazione MEA (giorno 2)

  1. Anestesizza un topo con l'1%-1,5% di isoflurane e decapita il topo. Utilizzare un bisturi per aprire la pelle ed esporre il cranio.
  2. Tagliare il cuoio capelluto del topo anestetizzato lungo la sutura sagittale con un coltello chirurgico e tagliare il cranio in direzioni diagonali dal punto lambda ad un punto un po 'di fronte al bregma utilizzando forbici chirurgiche. Quindi, staccare delicatamente il cranio dal cervello utilizzando una pinzetta curva.
  3. Utilizzare una spatola per sollevare il cervello e trasferirlo in un piatto Petri (100 mm x 20 mm) con soluzione di taglio ghiacciato (preparata al punto 4.1). Aria di flusso contenente 95% O2 e 5% CO2 da una bomba a gas esterna con una velocità di rotazione controllata della pompa (4,0 rpm) per generare piccole bolle nella soluzione di taglio ghiacciata (Figura 1a).
  4. Dopo 1–2 min, mettere il cervello su un panno in microfibra la cui superficie è leggermente coperta da un setaccio di farina e pulire il liquido dalla superficie del cervello, utilizzando delicatamente il panno in microfibra (Figura 1b).
  5. Mettere il cervello con il suo aspetto dorsale sul supporto campione sul BBB, e anche mettere la BBB al centro del giradischi automatico.
  6. Scurire la stanza durante la scansione 3D ed eseguire una scansione 3D sul giradischi. Per verificare se la scansione 3D funziona bene, fare clic su Scansione 3D selezionando l'angolo tra due scatti come 22,5, l'angolo iniziale come 0 e l'angolo finale come 360 (Figura 1c-1).
  7. Spostare il cervello a un piatto Petri, e bollo il cervello nella soluzione di taglio per circa 10 s.
  8. Tagliare il cervello in due blocchi al centro del piano coronale utilizzando un coltello chirurgico, e spostare i due blocchi cerebrali delicatamente sulla superficie piatta utilizzando una spatola chirurgica.
  9. Attaccare i blocchi cerebrali del BBB utilizzando colla istantanea, e delicatamente e con attenzione pulire il fluido dalla superficie del cervello entro 1–2 min, utilizzando di nuovo un panno in microfibra. Quindi, eseguire nuovamente una scansione 3D (Figura 1c-2).
  10. Fissare il nastro nero che copre il centro del BBB al centro della fase di taglio per un vibratome (Figura 1d).
  11. Versare la soluzione di taglio nella fase di taglio e impostare la fase di taglio sul vibratoma. Regolare la velocità di taglio e l'ampiezza. Fare 2-5 fette coronali (300 m di spessore) dai due blocchi cerebrali. Mantenere la soluzione nella fase di taglio bubbling, se possibile (Figura 1e).
  12. Fissare una lama al supporto della lama del vibratoma e ottimizzare la velocità di taglio, la frequenza e l'ampiezza delle vibrazioni del sistema impostandole come 12,7 mm/min per la velocità, 87-88 Hz per la frequenza e 0,8–1,0 mm per la larghezza dell'oscillazione. Quando è necessario un taglio attento, rallentare la velocità al livello 2–3.
  13. Durante il taglio delle fette di cervello, registrare la coordinata suddivisa nel formato, inclusa la coordinata anteriore-posteriore, l'emisfero e altre condizioni (Figura 2c).
  14. Trasferire delicatamente le fette di cervello in un becher pieno di ACSF preriscaldato (34 gradi centigradi) utilizzando una pipetta di plastica spessa, e incubarle nel becher a 34 gradi centigradi per 1 h. Durante questo periodo, eseguire una scansione 3D dei restanti blocchi cerebrali nella fase di taglio (Figura 1c-2).
  15. Impostare un chip MEA su un'unità di registrazione. Collegare il chip a una pompa peristaltica utilizzando due tubi. Utilizzare un tubo per guidare lo stesso ACSF nel chip MEA e nell'altro tubo per guidare ACSF fuori dal chip MEA.
  16. Attaccare due aghi (0,60 mm x 19 mm), collegati alle punte dei due tubi, alla parte superiore della parete del chip MEA, e fissare le loro posizioni con le loro punte seguendo la parete interna del chip MEA. Impostare la portata dell'ACSF su 4,1 rpm.
  17. Dopo 1 h è passato, spostare una fetta sul chip utilizzando una pipetta di plastica spessa, e impostare la posizione utilizzando un pennello morbido. Quindi, avviare il processo di registrazione delle attività neuronali (Figura 2-d).

7. Colorazione immunosofiche (giorni 3 e 4)

  1. Al termine della registrazione MEA, trasferire le fette a tubi da 1,5 mL riempiti con il 4% di paraformaldeide (PFA) in salina con buffer fosfato (PBS). Incubarli durante la notte a 4 gradi centigradi. Quindi, rimuovere la soluzione PFA 4% e lavare le fette 3x con PBS per un totale di 5 min.
    NOT: Se necessario, incorporare le fette nel 20% gelatina/PBS e resezione la fetta per renderla più sottile di 50 m, utilizzando il vibratoma.
  2. Preparare la soluzione di recupero dell'antigene (10 mM di citrato di sodio, pH 6.0). Rimuovere il PBS dall'ultimo lavaggio e aggiungere la soluzione di recupero dell'antigene.
  3. Far bollire l'acqua in una pentola elettrica e incubare i tubi con le fette per 20 min a 95-98 gradi centigradi nella pentola, seguita dal raffreddamento naturale.
  4. Preparare una salina da 50 mM con buffer Tris e aggiungere l'1% di Na bisulfite (1% della soluzione Na bisulfite-Tris). Regolare il pH a 7,5. Quindi lavare le fette con la soluzione Na bisulfite-Tris dell'1% Per 5 min a temperatura ambiente .
  5. Preparare la soluzione di blocco aggiungendo il 4% del siero di capra normale e l'ethoxylalate dell'ottilfenolo dello 0,5% alla soluzione 1% Na bisulfite-Tris.
  6. Rimuovere la soluzione 1% Na bisulfite-Tris dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione di blocco. Incubare per 2 h a temperatura ambiente.
  7. Preparare la soluzione anticorpale primaria aggiungendo 1% siero di capra normale e 0,5% Triton X-100 alla soluzione 1% Na bisulfite-Tris e diluendo gli anticorpi primari. Utilizzare le seguenti concentrazioni di anticorpi primari: 1:800 di topo anti-GAD67 e 1:500 di coniglio anti-NeuN.
  8. Rimuovere la soluzione 1% Na bisulfite-Tris dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione anticorpale primaria. Incubarlo per una notte a 4 gradi centigradi.
  9. Preparare una salina da 50 mM con buffer Tris e aggiungere 8,5 g/L NaCl (soluzione Tris-NaCl). Dissacrare il pH a 7,5. Quindi, lavare le fette 3x con la soluzione Tris-NaCl (20-25 gradi centigradi) per un totale di 5 min.
  10. Preparare la seconda soluzione anticorpale aggiungendo il 3% del siero di capra normale e lo 0,3% Triton X-100 alla soluzione Tris-NaCl e diluindo gli anticorpi secondari. Utilizzare le seguenti concentrazioni di anticorpi secondari: 1:500 di capra anti-topo e 1:500 di capra anti-coniglio.
  11. Rimuovere la soluzione Tris-NaCl dai tubi con le fette e aggiungere la soluzione anticorpale secondaria. Incubarlo per 2 h a temperatura ambiente. Quindi, lavare le fette 3x con la soluzione Tris-NaCl per 5 min in totale.
  12. Posizionare le fette sulla diapositiva utilizzando un pennello piccolo e applicare supporti di montaggio e un coverslip. Esaminare i vetrini con un microscopio confocale. Scattare immagini della superficie di una sezione (Figura 2e).

8. Elaborazione dei dati RM per estrarre volumi corticali

  1. Installare il software libero FSL (https://fsl.fmrib.ox.ac.uk/fsl/fslwiki/FslInstallation). Preparare le immagini RM acquisite nella sezione 3.
  2. Modificare il formato dell'immagine utilizzando il comando fslchfiletype NIFTI_PAIR_G. Espandere l'immagine del cervello per renderla grande come un cervello umano utilizzando il comando fslcreatehd e, se necessario, modificare l'orientamento utilizzando fslorient con l'opzione -setqformcode 1. Dopodiché, recuperare il formato di file originale utilizzando fslchfiletype NIFTI_G Il comando esatto è il seguente.
    fslchfiletype NFTI_PAIR [immagine di input].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 160 1 0.95 0.6 1.15 0 0 0 0 4 [immagine di input].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [immagine di input].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_G
  3. Digitare fsl per aprire il software FSL. Estrarre i cervelli utilizzando il comando di scommessa dall'interfaccia utente grafica (GUI), ma non sbucciare troppo. Quindi, controllare attentamente le soglie di intensità frazionaria, ... e le coordinate del centro della sfera iniziale della superficie cerebrale. I valori ottimali sono diversi per i singoli dati.
  4. Ridimensionare l'immagine del cervello alla dimensione originale del cervello del mouse, utilizzando la stessa procedura come nel passaggio 8.2. Il comando esatto è come segue:
    fslchfiletype NFTI_PAIR [immagine di input].nii.gz
    fslcreatehd 144 196 180 1 0.1 0.1 0.08 0 0 0 0 0 4 [immagine di input].hdr.gz
    fslorient –setqformmcode 1 [immagine di input].hdr.gz
    fslchfiletype NIFTI_G
  5. Coregistrare tutte le immagini del cervello utilizzando il comando flirt, e produrre un'immagine media del cervello utilizzando l'opzione -add e l'opzione -div del comando fslmaths.
    fslmaths [immagine del cervello 1] –aggiungere ... –aggiungere [immagine del cervello N] –div N [nome immagine mediata] –odt float
  6. Rendere il cervello medio più pulito utilizzando l'opzione -thr del comando fslmaths. Selezionare quindi un valore soglia ottimale adattivo ai singoli casi.
    fslmaths [nome immagine media] –thr [valore, ad esempio 5000] [immagine media con soglia]
  7. Infine, rimodella l'immagine media del cervello nella coordinata di un individuo usando di nuovo il comando flirt. Quindi, preparare corteccia estratti abbastanza pulite (Figura 2a).
    NOTA: Purtroppo, il bulbo olfattivo e il cervelletto non saranno perfetti nella superficie cerebrale ricostruita dai volumi di risonanza magnetica a causa delle limitazioni essenziali del software FSL per sbirciare tutte le parti del cervello, tra cui bulbo olfattivo e cervelletto.

9. Elaborazione dell'immagine RMA su superfici corticali a strisce

  1. Scaricare un altro software gratuito, 3D Slicer (https://download.slicer.org/).
  2. Aprire le immagini MR dei cervelli estratti (fare clic su File e selezionare Aggiungidati) prodotte in base alla sezione 8, utilizzando i moduli Volume Rendering e Editor in 3D Slicer.
  3. Modificare la modalità da Editor a Rendering volumee fare clic su un pulsante di destinazione per fare in modo che l'immagine del cervello arrivi al centro dello schermo.
  4. Selezionare la modalità MR-T2-cervello e regolare la soglia spostando la barra Maiusc. Quindi, tornare da Rendering volume a Editor e fare clic sul pulsante Soglia effetto.
  5. Applicare l'etichetta 41. La corteccia cerebrale e salva i dati della superficie cerebrale come file .stl. Quindi, modificare il formato del file da .vtk a .stle salvare il file controllando il modulo.

10. Pre-elaborazione dei dati di scansione 3D

  1. Eseguire una coregistrazione automatica tra 8 o 16 immagini scattate da 8 o 16 diverse angolazioni all'interno di una sequenza di una scansione per correggere piccole mancate corrispondenze tra di esse facendo clic su Registrazione globale inclusa nell'opzione Allineamento e integrarle. Ripetere le scansioni da diverse angolazioni per ottenere l'intera superficie del cervello (Figura 2b).
    1. Se l'integrazione tra immagini digitalizzate da diverse angolazioni non è riuscita, fare clic su Allineamento manuale e selezionare una coppia di un'immagine fissa e un'immaginein movimento .
    2. Fare clic su Avvia per avviare l'allineamento manuale delle immagini selezionando tre o quattro punti comuni in immagini diverse. Quindi, fare clic su OK. L'algoritmo di ottimizzazione è l'algoritmo iterativo del punto più vicino (ICP)10. Non include una deformazione non lineare.
  2. Creare una mesh di tutte le immagini allineate (cioè dei set di dati dei punti) selezionando tutte le immagini e facendo clic sul pulsante Generazione mesh. Quindi, selezionare l'opzione Piccolo oggetto artistico per ottenere la mesh con la risoluzione più alta. Quindi, salvare l'immagine come binario .stl o in formato ASCII.

11. Registrazione della superficie RM e della superficie di scansione 3D

  1. Aprire la superficie RM e unirla alla superficie di scansione 3D utilizzando il software di elaborazione della superficie. Quindi, eseguire un processo di allineamento manuale utilizzando la stessa procedura descritta nei passaggi 10.1.1 e 10.1.2. Quindi, salvare nuovamente queste immagini di superficie coregistrate (Figura 2a,b).
    1. Se necessario, pulire i singoli dati di superficie, ad esempio, cancellando piccoli rumori che circondano la regione del cervello, in particolare nel caso dei dati della risonanza magnetica, e riempiendo i fori se esistono, soprattutto nel caso dei dati di scansione 3D.
  2. Infine, aprire i dati di superficie con un software di analisi dei dati, ad esempio MATLAB, ed eseguire e valutare gli istogrammi delle distanze minime tra le due superfici.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo valutato le distanze tra le superfici corticali, prodotte dallo stripping del volume della risonanza magnetica, e le superfici ottenute da scansioni 3D di cervelli estratti. I valori di modalità dell'istogramma delle distanze sono solo 55 m (Figura 3a). Inoltre, quando si accumula l'istogramma dal punto in cui la distanza è uguale a zero, il valore accumulato raggiunge il 90% dei numeri di campione totali a 300 m (Figura 3b

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo chiamato protocollo 3D-NEO per colmare scale spaziali macroscopiche e microscopiche sovrapponendo due superfici cerebrali in modo più accurato rispetto a prima. Originariamente, c'erano due sfide nella creazione di questo protocollo che ha reso possibile la sovrapposizione accurata di due immagini di superficie del cervello e la registrazione di attività neuronali sane da organismi viventi. In primo luogo, è stato necessario pulire efficacemente la soluzione di taglio che circonda i...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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M.S. è grata per il supporto di tutto il personale nel corso di ingegneria dell'informazione medica presso la Graduate School of Medicine and Faculty of Medicine, e vuole ringraziare il professor Tetsuya Takakuwa, il prof. Commenti. Questo studio è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca esplorativa impegnativa e dal programma Leading Initiative for Excellent Young Researchers (LEADER) a M.S. da MEXT (The Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology). Gli esperimenti di risonanza magnetica in questo lavoro sono stati eseguiti nella Divisione per la risonanza magnetica dei piccoli animali, Centro di supporto per la ricerca medica, Graduate School of Medicine, Università di Kyoto, Giappone.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Compressore d'ariaKimura MedicalKA-100Preparazione animale per risonanza magnetica
Microscopio a fluorescenza all-in-oneKEYENCEBZ-X710
Scatola per anestesiaBio Research CenterRIC-01Preparazione animale per risonanza magnetica
Sistema di anestesiaACOMA Medical IndustryNS-5000APreparazione animale per risonanza magnetica
Anti-GAD67, clone 1G10.2Merk MilliporeMAB5406Per immunocolorazione
Calcium Chrolidenacalai tesque06729-55aCSF
Cloruro di colinanacalai tesque08809-45aCSF
Pinze
Bisturi per lo smaltimentoKai10
D-PBS(-) senza Ca e Mg, liquido (10x)nacalai tesquePer l'immunocolorazione
D(+)-glucosioWako049-31165aCSF
Gelatinanacalai tesque16605-42re-sectioning
IgG di capra (H+L) Anticorpo secondario altamente adsorbito in modo incrociato, Alexa Fluor Plus 488InvitrogenA32723Per l'immunocolorazione
Anticorpo secondario anti-coniglio IgG di capra (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor Plus 555InvitrogenA32732Per l'immunocolorazione
Tappetino riscaldanteBio Research CenterHM-10Preparazione animale per la risonanza magnetica
Controllore del tappetino riscaldanteBio Research CenterBWT-100APreparazione animale per il
sistema di riscaldamentoInstrumentsriscaldamento per piccoli animali compatibilemagnetica Preparazione animale per la risonanza magnetica
IsofluranoAbbViePreparazione animale per MRI
Vaporizzatore di isofluranoACOMA Medical IndustryMKIIIaiPreparazione animale per MRI
Affettatrice lineareDOSAKANeo Linear Slicer MT
L(+)-Acido ascorbico Sale di sodioWako196-01252aCSF
Magnesio Crolide EsaidratoWako135-00165aCSF
MaxOne Single-Well MEAMaxWell Biosystems Spatola
in metallo
Sistema di monitoraggioSA InstrumentsModello 1025Preparazione degli animali per il
software di monitoraggioMRI SA InstrumentsPC-SAM V.5.12Preparazione degli animali per la risonanza magnetica
Culla compatibile con la risonanza magneticaBruker BioSpinT12812Preparazione degli animali per la risonanza magnetica
Bobina per risonanza magneticaBruker BioSpinT9988per risonanza magnetica
Software operativo per risonanza magneticaBruker BioSpinParaVision 5.1per risonanza magnetica
Neo LinearSlicer MTD.S.K.NLS-MT
NeuN (D4G40) XP Segnalazione cellulare mAb di coniglio24307Per l'immunocolorazione
Siero di capra normaleWako143-06561Per l'immunocolorazione
Cloruro di potassioWako163-03545aCSF
Polietilenglicole Mono-p-isoottilfenil Eterenacalai tesque12967-45Per immunocolorazione
Sensore di respirazione sensibile alla pressioneSA InstrumentsRS-301Preparazione animale per risonanza magnetica
Scanner MRI preclinicoBruker BioSpinBioSpec 70/20 USRPer risonanza magnetica
Acido piruvico Sale di sodionacalai tesque29806-54aCSF
SCAN in a BOXOpen Technologies srl
Setaccio a forbice
flaconeTIGERCROWN81Per scansione 3D
SlowFade Gold Antifade MountantInvitrogenS36937Per immunocolorazione
Cloruro di sodioWako191-01665aCSF
Diidrogeno fosfato di sodioWako197-09705aCSF
Carbonato acido di sodioWako191-01305aCSF
Idrogeno solfito di sodionacalai tesque31220-15Per immunocolorazione
Sonda di temperatura a termistoreSA InstrumentsRTP-101-B, PLTPC-300Preparazione animale per la risonanza magnetica
Barra dentaleBruker BioSpinT10146Preparazione animale per la risonanza magnetica
Ago endovenoso alatoTERUMOSV-23CLKPer perfusione
1 mol/l-Tris-HCl Soluzione tamponenacalai tesque35436-01Per l'immunocolorazione
1 mol/l-acido cloridriconacalai tesque37314-15Per l'aggiustamento del pH della soluzione
16%-Paraformaldeide Soluzione acquosaMicroscopia elettronica Scienze15710Per l'immunocolorazione
smussate curve MRI SA Sistema di con la risonanza

Riferimenti

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