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Articolo metodologico

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

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DOI:

10.3791/58938

⸱

20 gennaio 2019

 ,  , 
1Comprehensive Cancer Center, James Cancer Hospital and Solove Research Center, Ohio State University, 2Department of Biomedical Engineering, College of Engineering, Ohio State University

In questo articolo

Sommario

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

Abstract

Lo scopo di questo metodo è quello di misurare l'attività proteolitica dei campioni biologici complessi. I campioni sono separati dal peso molecolare tramite l'elettroforesi attraverso un gel di risoluzione incorporato con un substrato degradabile. Questo metodo si differenzia dal tradizionale gel zymography in quanto un peptide fluorogenico estiguuto covalentemente incorporò il gel di risoluzione invece di proteine integrale, come gelatina o caseina. Uso dei peptidi fluorogenici consente il rilevamento diretto di attività proteolitica senza ulteriori passaggi di colorazione. Gli enzimi all'interno i campioni biologici fendono il peptide fluorogenico estiguuto, conseguente a un aumento di fluorescenza. Il segnale fluorescente nel gel è allora imaged con uno scanner standard del gel fluorescente e quantificati tramite densitometria. L'uso di peptidi come il substrato degradabile espande notevolmente le possibili proteasi rilevabile con le tecniche di zymographic.

Introduzione

Zymography gel è una tecnica biologica utilizzata per misurare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici, quali fluidi corporei o delle cellule di coltura1,2,3. I campioni sono separati dai loro pesi molecolari con l'elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide incorporato con un substrato degradabile. I substrati degradabili comuni includono gelatina, caseina, collagene ed elastina, che sono stati utilizzati per misurare l'attività delle metalloproteinasi di matrice (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, oltre ad una varietà di catepsine1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. dopo elettroforesi, gli enzimi sono rinaturalizzato e permesso di degradare le proteine all'interno del gel. In zymography tradizionale gel, il gel è colorato con un colorante di proteine, come blu di Coomassie, e l'attività della proteasi è rilevato come una perdita di segnale, cioè, bianco bande (degradazione della proteina) su uno sfondo blu scuro.

Qui, descriviamo un protocollo per un metodo alternativo di gel zymography, in cui il substrato degradabile è un breve, peptide fluorogenico covalentemente incorporato in gel di poliacrilammide (Figura 1). La sostituzione di peptidi sintetici come i substrati degradabile consente il rilevamento di una gamma più ampia di proteasi rispetto al tradizionale gel zymography con proteine native9. Covalente del peptide fluorogenico impedisce la diffusione del peptide e la migrazione durante l'elettroforesi del gel, osservato con precedenti metodi9,10. Inoltre, l'uso di un substrato fluorogenico consente rilevazione diretta delle attività della proteasi senza ulteriori macchiatura e passi de-colorazione. L'obiettivo generale di questo metodo è la rilevazione di attività di proteasi in campioni biologici tramite l'incorporazione covalente di peptidi fluorogenici in gel di zymogram.

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Protocollo

1. preparazione di strato di Gel di risoluzione

  1. Preparare un poliacrilammide 10% Risoluzione soluzione di gel come da tabella 1. Aggiungere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e l'ammonio persolfato (APS) immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.
  2. Riempire un vassoio del mini-gel vuoto 1,5 mm a metà strada (5 mL) con la soluzione di gel di risoluzione 10%.
  3. Aggiungere uno strato sottile di isopropanolo (~ 500 µ l) nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un livello gel e prevenire bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 40 min).

2. preparazione della molecola del Linker Azido-PEG3-maleimide

  1. Mentre il primo strato di gel di risoluzione è polimerizzando, recuperare il kit azido-PEG3-maleimide dallo stoccaggio-20 ° C e lasciare i componenti a temperatura ambiente. Ci sono due componenti in ogni kit. 1 flaconcino contiene un estere di maleimide-NHS, un bianco sporco al grigio solido. Flacone 2 contiene azido-PEG3-ammina, un olio leggermente giallo.
    Nota: Gli autori suggeriscono utilizzando il kit di azido-PEG3-maleimide 25 mg come può essere conservato solo per brevi periodi di tempo (1-2 ore) a-20 ° C dopo essere preparati prima che inizia a degradare. 25 mg è sufficiente a produrre 10 peptide gel. Utilizzare gel entro 3 settimane di preparazione.
  2. Sciogliere i componenti del flaconcino 2 nel produttore consigliato volume di solfossido dimetilico (DMSO) e vortex per 30 s per garantire i liquidi sono stati mescolati bene.
  3. Trasferire il contenuto di 1 fiala in un pallone asciutto 100 mL contenente un'ancoretta.
    Nota: Risciacquare il matraccio con acetone e asciugare completamente prima dell'uso per evitare che l'umidità da interferire con la reazione.
  4. Immediatamente inserire un tappo di setto di gomma con un diaframma che può essere perforato con una siringa nella bocca del pallone. Lavorare rapidamente per impedire all'umidità di entrare il pallone.
  5. Inserisci due 18 gauge siringa aghi nel diaframma e collegare uno ad un serbatoio di gas inerte (ad es. gas argon). Lasciare il gas inerte per riempire il pallone per 3 min Mix i componenti di fiale 1 e 2 sotto gas inerte per evitare che i prodotti di reazione indesiderabile.
    Attenzione: Il secondo ago di siringa è quello di fornire uno sfogo, consentendo in tal modo l'aria atmosferica contenuta all'interno della muffola a fluire fuori il pallone come si riempie con gas inerte. Non dimenticate di includere un ago di sfiato!
  6. Chiudere il gas inerte e staccarlo dall'ago. Utilizzando una siringa, iniettare l'intero contenuto del flaconcino 2 nel pallone.
  7. Rimuovere la siringa e aghi e consentire ai componenti di mescolare per 30 min a temperatura ambiente mescolando.
  8. Rimuovere il tappo di gomma del setto e trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga pulita 5 mL. La soluzione di azido-PEG3-maleimide deve essere utilizzata entro 1 ora a temperatura ambiente.

3. preparazione del Peptide risoluzione strato di Gel

  1. Una volta che il primo strato di gel di risoluzione ha polimerizzato, versare lo strato di isopropanolo. Sciacquare la parte superiore del gel di pipettaggio 1 mL di acqua deionizzata sulla parte superiore del gel e quindi versare l'acqua.
  2. Recuperare il peptide fluorescente del tiolo-funzionalizzati da-80 ° C stoccaggio e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente.
    Nota: Il peptide del tiolo-funzionalizzate possa essere preparato come descritto in precedenza11,12. Commercialmente disponibile peptidi possono anche essere usati ma richiedono l'aggiunta di un residuo di cisteina terminale per abilitare il maleimide-tiolo clicca reazione. Sciogliere il peptide ad una concentrazione stock di 10 mM e conservare a-80 ° C in piccole aliquote (30 uL) per limitare i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
  3. Preparare un 10% risoluzione dei gel di soluzione contenente la molecola azido-PEG3-maleimide del linker e il peptide fluorescente come da tabella 1. Aggiungere il TEMED e APS immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.
  4. Riempire a metà della parte restante del vassoio del gel (3 mL) con il peptide soluzione gel di risoluzione.
    Nota: Un approccio di gel di risoluzione multistrato riduce la quantità di peptide e del linker necessario per ogni gel. La dimensione dello strato di gel di risoluzione del peptide può essere regolata per soddisfare un'ampia gamma di pesi molecolari come necessario.
  5. Pipettare un sottile strato di isopropanolo (~ 500 µ l) alla parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un livello gel e prevenire bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 40 min).
    Nota: Il peptide fluorescente è sensibile alla luce. Mantenere i gel coperti con carta stagnola per evitare che photobleaching durante lo sviluppo, l'elettroforesi, lavaggio e preparazione del gel.
  6. Versare lo strato di isopropanolo e sciacquare la parte superiore del peptide risoluzione dei gel con acqua deionizzata come descritto al punto 3.1.
  7. Se si utilizza il gel immediatamente, procedere al passaggio 4, in caso contrario, immergere i gel preparati in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C in una scatola di plastica per evitare che il gel secchi: 1x. Avvolgere la scatola in carta stagnola per evitare che photobleaching. Gel possono essere memorizzati in PBS per fino a 3 settimane prima dell'uso.

4. preparazione del Gel d'impilamento

  1. Preparare una soluzione di gel d'impilamento 5% secondo la tabella 1. Aggiungere il TEMED e APS immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.
  2. Riempire la parte vuota rimanente del vassoio del gel (~ 2 mL) con la soluzione di gel di impilamento.
  3. Inserire rapidamente un pettine di gel di 1,5 mm in strato di gel d'impilamento, assicurandosi che non ci sono bolle rimangono intrappolate sotto i pozzi. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 10 min).
  4. Rimuovere delicatamente il pettine e il nastro dal retro del vassoio del gel.

5. preparazione dei campioni biologici per elettroforesi

  1. Preparare la media condizionato delle cellule, lisati cellulari, omogenati e MMP standard come descritto altrove sotto non riducenti condizioni2. Non riscaldare i campioni.
  2. Ad esempio, preparare media condizionato delle cellule come segue:
    1. Cellule a piastra 40.000 cellule/cm2 in una piastra a 6 pozzetti in terreni di coltura di 10% siero bovino fetale (FBS). Incubare le cellule in una camera umidificata (5% CO2 a 37 ° C) per 24 ore e consentire loro di raggiungere la confluenza di 70-80%.
      Nota: Se le cellule non hanno raggiunto la confluenza desiderato dopo 24 ore, consentire loro di crescere in terreni di coltura di 10% FBS per altre 24 ore.
    2. Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere 2 mL di terreno di coltura privo di siero. Incubare le cellule in una camera umidificata (5% CO2 a 37 ° C) per altre 24 ore.
    3. Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere i media condizionati da ciascun pozzetto. Centrifugare i media a 1200 rpm per 3 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Prendere il surnatante e concentrarsi utilizzando un 15 mL, filtro centrifugo cutoff peso molecolare 10 kDa. Centrifugare le unità filtro a 4.000 x g per 15 min in un rotore oscillante o 5.000 x g per 15 min in un rotore ad angolo fisso.
      Nota: Questo passaggio è facoltativo, ma può migliorare l'intensità delle bande proteolitici nei gel di zymography del peptide.
    4. Trasferire il filtrato concentrato in una provetta da centrifuga fresca 1,5 mL. Aliquotare e conservare i campioni a-80 ° C per fino a tre cicli di gelo-disgelo.
  3. Quantificare il contenuto di proteine usando un'analisi di quantificazione della proteina standard (ad es. BCA, analisi di Bradford, ecc.).

6. elettroforesi del biologico campioni in Peptide Zymography gel

  1. Sciogliere i campioni nel buffer del campione convenzionale zymography (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glicerolo, 4% SDS, 0,01% bromofenolo). Per i campioni di cellule e tessuti, ~ 30 µ g di proteina totale per pozzetto è raccomandato e 50-100 ng di proteina per gli standard di MMP.
  2. Aggiungere 400 mL di 1 x Tris-glicina SDS Running Buffer all'apparato di gel. Caricare fino a 35 µ l di campione per pozzetto. Eseguire gli esempi a 120 V a 4 ° C per 1,5 ore o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse sono all'interno del peptide risoluzione strato di gel (che ha un colore arancio visibile).
    Nota: La maggior parte delle MMPs e loro varianti cadono all'interno della gamma di 35-100 kDa. Quando gli standard di peso molecolare indicano che quei pesi sono all'interno del peptide risoluzione strato di gel, elettroforesi può essere fermato. Lo stesso principio può essere applicato ad altre classi di proteasi con pesi molecolari noti. Se c'è un interesse nella rilevazione della proteasi più sopra una più vasta gamma di pesi molecolari, ridurre le dimensioni della risoluzione strato di gel e aumentare le dimensioni dello strato di gel di risoluzione del peptide.
  3. A seguito di elettroforesi, rimuovere il gel dalla cassetta plastica e lavare gel tre volte per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente sotto agitazione delicata in tampone di rinaturazione con 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2e 5 mM CaCl2 a 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.
  4. Trasferimento gel per una sviluppo soluzione tampone contenente 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 e 5 mM CaCl2 a 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 per 15 min. Sostituisci con sviluppo fresco soluzione tampone e incubare gel a 37 ° C sotto agitazione delicata per 24 ore , assicurandosi che i gel sono completamente immerso nella soluzione.

7. formazione immagine del Peptide Zymography gel

  1. Dopo 24 ore, gel di immagine utilizzando un fluorescente gel scanner/imager utilizzando i filtri di eccitazione e di emissione appropriati. Ad esempio, i gel di peptide indicati nei risultati rappresentativi sono coniugati con fluoresceina ed erano imaged utilizzando un filtro di eccitazione di 488 nm e un filtro di emissione di 521 nm. Utilizzando i filtri appropriati per il fluoroforo ci permetterà di ottimizzare il rilevamento di attività proteolitica.
    Nota: Immagini possono anche essere preso con un imager di gel con un transilluminatore UV, spesso utilizzato per l'imaging del DNA gel colorato con bromuro di etidio. Immagine del gel utilizzando il transilluminatore UV (365 nm) impostazione e un filtro di emissione di 590 nm.
  2. Condurre la valutazione densitometrica delle intensità di banda usando ImageJ come descritto altrove13.

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Risultati

Utilizzando il metodo descritto qui, due peptidi di proteasi-degradabile fluorescenti sono state incorporate in gel di poliacrilammide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abbreviato come QGIW in tutto il testo e le figure) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abbreviato come LACW in tutto il testo e le figure). ↓ indica il sito di clivaggio. QGIW è un collagene-I derivati sequenza progettato per rilevare le collagenasi cellulare14. LACW è una sequenza che...

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Discussione

Le attuali tecniche di zymographic si affidano l'incorporazione di substrati nativi in gel di poliacrilammide per la rilevazione di proteolisi. Mentre queste tecniche hanno raccolto l'uso molto diffuso, sono ancora limitati nel numero di proteasi che sono in grado di rilevare. Qui, un protocollo è stato descritto in quali peptidi fluorescenti, proteasi-degradabile sono incorporate la risoluzione di gel di poliacrilammide. Covalente accoppiamento usando una molecola del linker azido-PEG3-maleimide consente la separazione ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Finanziamento fornito da The Ohio State University College of Engineering, dipartimento di ingegneria biomedica e il Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital e Richard J. Solove Research Institute.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Cassette di gel vuote da 1,5 mmThermoFisher ScientificNC2015
Pettini per cassette di gel vuote da 1,5 mm, 10 pozzettiThermoFisher ScientificNC3510
1x soluzione salina tamponata con fosfatoFisher Scientific10-010-049
Soluzione SDS al 20%AmbionAM9820
3x tampone per campioni per zimografiaBio-Rad1610764
40% (p/v) Acrilammide/Bis (19:1)AmbionAM9022
Piastre per colture tissutali a 6 pozzettiThermoFisher Scientific087721B
Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)Sigma-AldrichUFC201024
Ammounium PersulfateSigma-AldrichA3678
Azido-PEG3-Maleimmide KitClicca sulla chimica StrumentiAZ107
Cloruro di calcioThermoFisher ScientificBP510100
Dimetil solfossidoFisher ScientificBP231
IsopropanoloFisher ScientificA416P
Kit di analisi delle proteine Micro BCAThermoFisher Scientific23235
N N N' N' -Tetrametiletilendiammina (TEMED)Sigma-AldrichT9281
PowerPac Alimentatore di baseBio-Rad1645050
Precision Plus Protein Dual Color StandardBio-Rad161-0374
Aghi ipodermici PrecisionGlideScientific14-826
Pallone a fondo tondo (100 mL)Fisher Scientific50-873-144
Tappo in gomma del settoFisher Scientific50-872-546
Siringa sterile con punta scorrevole (1 mL)Fisher Scientific14-823-434
Triton X-100Sigma-AldrichX100
Trizma hydrochlroideSigma-AldrichT5941
Typhoon 9410 Molecular ImagerGE Amersham8149-30-9410
Cloruro di zincoSigma-Aldrich
Fisher 208086

Riferimenti

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