Articolo metodologico

Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

DOI:

10.3791/58953

⸱

17 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo utilizza un approccio privo di mordente di visualizzare e di isolare le cellule di Purkinje nel tessuto fresco congelato dal cervelletto umano post mortem tramite laser capture microdissection. Lo scopo del presente protocollo è quello di generare una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza di RNA.

Abstract

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Microdissezione laser (LCM) è uno strumento vantaggioso che consente la raccolta di cellule citologicamente e/o fenotipico pertinenti o regioni da tessuti eterogenei. Prodotto acquisito può essere utilizzato in una varietà di metodi molecolari per le proteine, DNA o RNA isolamento. Tuttavia, la conservazione di RNA dal tessuto post mortem del cervello umano è particolarmente impegnativi. Tecniche di visualizzazione standard per LCM richiedono istologico o procedure di macchiatura immunohistochemical che possono ulteriormente degradano il mRNA. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo inox per visualizzazione in LCM con lo scopo di preservare l'integrità di RNA nel tessuto cerebrale umano post mortem. Delle cellule di Purkinje del cervelletto è un buon candidato per la visualizzazione di acciaio inox, grazie alla sua dimensione e la posizione caratteristica. La corteccia cerebellare ha livelli distinti che differiscono nella densità delle cellule, che li rende un buono archetipo per identificare al microscopio ad alto ingrandimento. Cellule di Purkinje sono grandi neuroni situati tra lo strato delle cellule del granello, che è una rete densamente cellulare dei neuroni piccoli, e lo strato molecolare, che è sparso in corpi cellulari. A causa di questa architettura, l'utilizzo di acciaio inox visualizzazione è fattibile. Altri sistemi dell'organo o cellula che imitano questo fenotipo sarebbe anche adatti. Il protocollo di acciaio inossidabile è progettato per fissare il tessuto fresco congelato con etanolo e rimuovere i lipidi con xilene per migliorare la visualizzazione morfologica nell'ambito di microscopia ad alto ingrandimento. Questo protocollo non tiene conto di altri metodi di fissazione ed è specificamente progettato per campioni di tessuto fresco congelato acquisiti utilizzando un ultravioletto (UV)-sistema di LCM. Qui, presentiamo un protocollo completo per sezionamento e fissare tessuto cerebellare umano fresco congelato post mortem e purificazione di RNA da cellule di Purkinje isolate di UV-LCM, preservando la qualità di RNA per RNA-ordinamento successivo. Nelle nostre mani, questo protocollo produce eccezionali livelli di visualizzazione cellulare senza la necessità di reagenti di colorazione e produce RNA con alti numeri di integrità di RNA (≥ 8) come necessario per gli esperimenti di profilatura trascrizionali.

Introduzione

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Microdissezione laser (LCM) è uno strumento di ricerca di valore che consente la separazione delle cellule patologicamente rilevanti per la valutazione molecolare guidata successiva. L'uso delle analisi molecolari in questi campioni di tessuto eterogeneo e la correlazione con dati clinici e patologici è un passo necessario nel valutare l'importanza traslazionale della ricerca biologica1. Quando si analizzano i dati di espressione genica da RNA, l'uso di sezioni di tessuto congelato è altamente consigliato in quanto consente di eccellente qualità di RNA così come ingrandita quantità2. È stata ben stabilita che alta qualit....

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Protocollo

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Tutti i campioni umani utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti con il consenso informato e sono stati approvati da interno Review Board (IRB) alla Columbia University e Università di Yale.

Nota: La totalità del presente protocollo deve seguire RNA rigoroso gestione delle linee guida, per cui una mano guantata viene sempre utilizzata, tutte le superfici vengono pulite con una decontaminazione di RNAsi e tutti i materiali di lavoro sono RNA/DNA/nucleasi gratis.

1. test RNA l'integrità del tessuto prima del LCM a partire

Nota: Test di qualità di....

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Risultati

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Questo protocollo dettaglia i passaggi per la preparazione del tessuto di cervello umano fresco congelato post mortem per UV-LCM. Le annotazioni e le specifiche approfondite sono riportate per il taglio di criostato, come può essere difficile da tagliare del tessuto di cervello congelato fresco con un elevato grado di precisione. Il punto più importante da considerare è che il tessuto congelato fresco è estremamente freddo e richiede una notevole quantità di tempo per ambientarsi alla tem.......

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Discussione

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Il protocollo presentato qui è specificamente modificato per essere un approccio inox nel visualizzare tessuti morfologicamente distinte per UV-LCM. Questo metodo è progettato per massimizzare l'integrità di RNA per successivo sequenziamento diretto di RNA, pur mantenendo un livello avanzato di visualizzazione del tessuto. La capacità di distinguere diversi tipi di cellule per la cattura, per creare la popolazione più pura delle cellule possibili, è essenziale per la comprensione di diversi profili molecolari in tessuti .......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori desidera ringraziare la New York Brain Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel e Dr. Etty Cortés, per la loro assistenza in taglio e conservare i campioni di tessuto di cervello umano congelato per questi esperimenti. Gli autori desidera ringraziare gli individui che hanno generosamente donato il loro cervello per la continua ricerca nel tremore essenziale. Dr. Faust e Dr. Martuscello desidera ringraziare Columbia University Dipartimento di patologia e biologia delle cellule per il loro continuo supporto e spazio di ricerca di base. Gli autori desidera ringraziare NIH R01 NS088257 Louis/Faust) finanziamenti per la ricerca per questo progetto. Immagini di LCM sono sta....

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MembraneSlide NF 1.0 PENZeiss415190-9081-000Vetrini a membrana per tessuti. Si sconsiglia l'uso di vetrini.
AdhesiveCap 500 OpaqueZeiss415190-9201-000I cappucci opachi sono utilizzati per migliorare la visualizzazione solo su endoscopi invertiti
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11Sono adatti anche altri prodotti per la decontaminazione con RNasi. Utilizzare per pulire tutte le superfici prima del lavoro.
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701Se si utilizza etanolo alternativo, garantire un'alta qualità. Essenziale per la fissazione dei tessuti.
Xileni (certificato ACS)Fisher ScientificX5P-1GALSe si utilizza xilene alternativo, garantire un'alta qualità. Essenziale per la visualizzazione dei tessuti.
Acqua distillata ultrapuraInvitrogen10977-015anche ad altre acque prive di RNA/DNA/nucleasi. Utilizzato solo nella diluizione dell'etanolo.
Barattoli per vetrini Slide-FixEvergreen240-5440-G8KÈ adatto anche qualsiasi supporto per vetrini/barattolo. Deve essere pulito prima dell'uso. Utilizzato per il fissaggio dopo il sezionamento.
Piastra antirollio, 70 mm 100 μ mLeica Biosystems14041933980Il tipo di piastra antirollio è determinato dal tipo di criostato e dalla posizione di attacco sul tavolino. Tutti i criostati hanno requisiti diversi.
Dietil pirocarbonato (DEPC)Sigma AldrichD5758-50mLDEPC da qualsiasi fornitore andrà bene. Seguire le indicazioni per il trattamento dell'acqua.
KimwipesFisher Scientific06-666ALe salviette Kimwipes possono essere ordinate da qualsiasi fornitore e utilizzate in qualsiasi dimensione. Le salviette Kimwipe devono essere utilizzate per pulire il microscopio e il criostato.
Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571Qualsiasi marca di OCT è accettabile. Nessun tessuto sarà incorporato nell'OCT, è sufficiente attaccare il tessuto al 'chuck'.
Lame per microtomo a basso profilo Edge-RiteThermo Scientific4280Lè determinato dal tipo di criostato. Tutti i criostati hanno requisiti diversi.
Leica Microsystems 3P  25 + 30 MM MANDRINI CRIOSTATICIFisher ScientificNC0558768tipo di mandrino è determinato dal tipo di criostato. Tutti i criostati hanno requisiti diversi. Entrambe le dimensioni sono adatte.
RNeasy Micro Kit (50)Qiagen74004Necessario per l'estrazione dell'RNA post LCM. Tampone di lisi RLT essenziale per raccogliere le cellule catturate dal tappo opaco.
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Necessario per l'estrazione dell'RNA delle preparazioni delle sezioni, che vengono eseguite prima della LCM per testare l'integrità dell'RNA dei tessuti di partenza.
Il set di DNasi senza RNasiQiagen79254Dnase rimuoverà qualsiasi DNA per consentire una popolazione di RNA pura. Assicurati che Dnase sia fatto fresco.
2-MercaptoetanoloSigma AldrichM6250-100MLVolume acquistato a discrezione dell'utente. Necessario per l'aggiunta al tampone RLT per la lisi cellulare. Previene l'attività della RNasi.
Globo scientifico  Lotto Provetta per microcentrifuga graduata certificata (2 mL)Fisher Scientific22-010-092Qualsiasi provetta da 2 mL priva di RNasi, DNasi, DNA umano e pirogeni andrà bene.
Adatto Il tipo di lama

Riferimenti

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  1. Liu, H., et al. Laser capture microdissection for the investigative pathologist. Veterinary Pathology. 51 (1), 257-269 (2014).
  2. Datta, S., et al. Laser capture microdissection: Big data from small samples. Histology and Histopathology.

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Microdissezione laser assistitasistema UV LCMfissazione con xilenedisidratazione con etanolodecontaminazione da RNasinumero di integrit dell RNA

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