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Articolo metodologico

Un protocollo di acciaio inox per l'isolamento di RNA di alta qualità da Laser catturare cellule Microdissected Purkinje nel cervelletto umano Post-Mortem

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⸱

DOI:

10.3791/58953

⸱

17 gennaio 2019

 ,  , 
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University, 2Division of Movement Disorders, Department of Neurology, Yale University, 3Department of Chronic Disease Epidemiology, Yale School of Public Health, Yale University, 4Center for Neuroepidemiology and Clinical Neurological Research, Yale School of Medicine, Yale University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo utilizza un approccio privo di mordente di visualizzare e di isolare le cellule di Purkinje nel tessuto fresco congelato dal cervelletto umano post mortem tramite laser capture microdissection. Lo scopo del presente protocollo è quello di generare una quantità sufficiente di RNA di alta qualità per la sequenza di RNA.

Abstract

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento vantaggioso che consente la raccolta di cellule citologicamente e/o fenotipico pertinenti o regioni da tessuti eterogenei. Prodotto acquisito può essere utilizzato in una varietà di metodi molecolari per le proteine, DNA o RNA isolamento. Tuttavia, la conservazione di RNA dal tessuto post mortem del cervello umano è particolarmente impegnativi. Tecniche di visualizzazione standard per LCM richiedono istologico o procedure di macchiatura immunohistochemical che possono ulteriormente degradano il mRNA. Pertanto, abbiamo progettato un protocollo inox per visualizzazione in LCM con lo scopo di preservare l'integrità di RNA nel tessuto cerebrale umano post mortem. Delle cellule di Purkinje del cervelletto è un buon candidato per la visualizzazione di acciaio inox, grazie alla sua dimensione e la posizione caratteristica. La corteccia cerebellare ha livelli distinti che differiscono nella densità delle cellule, che li rende un buono archetipo per identificare al microscopio ad alto ingrandimento. Cellule di Purkinje sono grandi neuroni situati tra lo strato delle cellule del granello, che è una rete densamente cellulare dei neuroni piccoli, e lo strato molecolare, che è sparso in corpi cellulari. A causa di questa architettura, l'utilizzo di acciaio inox visualizzazione è fattibile. Altri sistemi dell'organo o cellula che imitano questo fenotipo sarebbe anche adatti. Il protocollo di acciaio inossidabile è progettato per fissare il tessuto fresco congelato con etanolo e rimuovere i lipidi con xilene per migliorare la visualizzazione morfologica nell'ambito di microscopia ad alto ingrandimento. Questo protocollo non tiene conto di altri metodi di fissazione ed è specificamente progettato per campioni di tessuto fresco congelato acquisiti utilizzando un ultravioletto (UV)-sistema di LCM. Qui, presentiamo un protocollo completo per sezionamento e fissare tessuto cerebellare umano fresco congelato post mortem e purificazione di RNA da cellule di Purkinje isolate di UV-LCM, preservando la qualità di RNA per RNA-ordinamento successivo. Nelle nostre mani, questo protocollo produce eccezionali livelli di visualizzazione cellulare senza la necessità di reagenti di colorazione e produce RNA con alti numeri di integrità di RNA (≥ 8) come necessario per gli esperimenti di profilatura trascrizionali.

Introduzione

Microdissezione laser (LCM) è uno strumento di ricerca di valore che consente la separazione delle cellule patologicamente rilevanti per la valutazione molecolare guidata successiva. L'uso delle analisi molecolari in questi campioni di tessuto eterogeneo e la correlazione con dati clinici e patologici è un passo necessario nel valutare l'importanza traslazionale della ricerca biologica1. Quando si analizzano i dati di espressione genica da RNA, l'uso di sezioni di tessuto congelato è altamente consigliato in quanto consente di eccellente qualità di RNA così come ingrandita quantità2. È stata ben stabilita che alta qualità e la quantità di RNA sono essenziali per dati significativi da RNA sequenza3. Tuttavia, quando si utilizza RNA dal tessuto fresco congelato post mortem per LCM, degradazione del RNA è una sfida importante, come si verifica immediatamente dopo la morte e la sua estensione è mediata da vari fattori connessi con il tessuto collezione metodo4,5 . Inoltre, degradazione del RNA è aggravata quando tecniche di colorazione sono necessari per riconoscere dettagli istologici e l'identificazione delle cellule. Specializzata macchiatura tecniche come l'ematossilina ed eosina, di Nissl, immunofluorescenza e immunoistochimica sono utili nella differenziazione delle cellule dallo stroma circostante ma hanno dimostrati di degradare il mRNA e alterare l'espressione di trascrizione profili6. Di conseguenza, il nostro laboratorio ha creato un protocollo inox specificamente progettato per preservare il RNA in cervelletto umano post mortem ai fini del sequenziamento di RNA dopo l'isolamento di LCM di neuroni di Purkinje.

Nell'elaborazione di tessuto congelato fresco per LCM, il metodo di fissazione variabilmente può influenzare l'integrità del tessuto e del RNA. Fissazione in formalina è standard per conservazione morfologica, ma cause cross-linking che possono frammentare RNA e interferire con l'amplificazione di RNA7. Fissazione dell'etanolo è un'alternativa migliore per l'isolamento di RNA, come è un fissativo coagulante che non induce la reticolazione1. Per migliorare la visualizzazione della morfologia del tessuto, xilene è la scelta migliore, in quanto rimuove i lipidi dal tessuto. Tuttavia, ci sono note alcune limitazioni quando si utilizza xilene in LCM, come i tessuti possono asciugarsi e diventare fragili che causano frammentazione del tessuto su laser capture7. Xilene è anche una tossina volatile e deve essere gestito correttamente in una cappa aspirante. Tuttavia, xilene è stato indicato per migliorare la visualizzazione del tessuto preservando anche RNA integrità8. Di conseguenza, il nostro protocollo centri intorno all'uso della fissazione dell'etanolo 70% ed etanolo disidratazione, seguita da incubazione di xilene per chiarezza morfologica.

È importante notare i diversi tipi di sistemi basati sul laser microdissection, come essi hanno dimostrati di differiscono in velocità, precisione e qualità di RNA. Il laser infrarosso (IR) capture microdissection e i sistemi di raggi ultravioletti (UV) laser microbeam microdissection erano entrambe le piattaforme LCM romanzo emerse quasi contemporaneamente8. Il sistema IR-LCM si avvale di un "sistema di contatto" utilizzando una pellicola termoplastica trasparente collocata direttamente sulla sezione di tessuto, e celle di interesse selettivamente aderiscano la pellicola da impulsi focalizzati da un laser a infrarossi. In alternativa, il sistema UV-LCM è un sistema"senza contatto", per cui un raggio laser focalizzato taglia via le cellule o le regioni di interesse nel tessuto; a seconda della configurazione in due piattaforme commerciali attualmente disponibili che utilizzano entrambi un design microscopio invertito o in posizione verticale, tessuto viene acquisito in un dispositivo di raccolta da un'onda di pressione indotta da laser che si catapulta contro la gravità o il tessuto è raccolti dalla forza di gravità, rispettivamente. Vantaggi del sistema UV-LCM includono acquisizione delle cellule più veloce, privo di contaminazione insieme con l'approccio di non-contatto e più precisa dissezione dovuto un molto più piccolo laser fascio diametro9. Questo protocollo è stato specificamente progettato per un sistema UV-LCM e non è stato testato in un sistema di IR-LCM. Nella progettazione di sistema o UV-LCM, quando cellule accumula nella PAC raccolta, l'uso di un vetrino coprioggetto che migliora la chiarezza cellulare durante la microscopia non è adatto, come le cellule sarebbe in grado di entrare nella PAC collezione. Di conseguenza, per migliorare la visualizzazione del tessuto, abbiamo testato l'uso di tappi insieme opaco, che sono progettati per fungere da un vetrino coprioggetto per visualizzazione microscopica in sistemi UV-LCM, contro tappi di raccolta del liquido riempito. Tappi di raccolta del liquido riempito possono essere difficile, come il liquido è soggetta a evaporazione e dovrà essere sostituito frequentemente mentre si lavora al microscopio. Tempo diventa un fattore importante per la stabilità del RNA, mentre il tessuto catturato si dissolve immediatamente7.

Il nostro laboratorio studia i cambiamenti neuropathologic post mortem nel cervelletto dei pazienti con tremore essenziale (ET) e disordini neurodegenerative correlate del cervelletto. Abbiamo dimostrato i cambiamenti morfologici centrati sulle cellule di Purkinje che distinguono ET casi contro i comandi, tra cui un numero ridotto di cellule di Purkinje, aumentato dendritiche regressione e una varietà di cambiamenti axonal, che ci porta a postulare che Purkinje degenerazione delle cellule è una caratteristica biologica di core ET patogenesi10,11,12,13. Profiling trascrizionale è stato utilizzato in molte malattie neurologiche per esplorare la base molecolare sottostante dei cambiamenti cellulari degeneranti. Tuttavia, profili trascrizionali da campioni eterogenei, quali regioni del tessuto di cervello, efficacemente possono mascherare l'espressione delle trascrizioni di abbondanza bassa e/o diminuire la rilevazione dei cambiamenti molecolari che si verificano solo in una piccola popolazione di interessati cellule, come le cellule di Purkinje nella corteccia cerebellare. Per esempio, cellule di Purkinje sono grave inferiorità numerica da parte delle cellule del granello abbondante nella corteccia cerebellare di circa 1: 3000; così, efficacemente destinazione loro transcriptome richiede l'isolamento specifico di questi neuroni. La corteccia cerebellare è delineata da strati distinti che differiscono nella densità delle cellule e la dimensione della cella. Questa architettura cellulare è ideale per visualizzare in un campione di tessuto fresco congelato senza tintura-contenente i reagenti di colorazione. In teoria, questo protocollo potrebbe essere applicato anche ad altri tipi di tessuto che hanno tessuto distintivo simile organizzazione.

Questo protocollo è stato progettato per lavorare in modo specifico per la visualizzazione delle cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem. Esistono numerosi protocolli per la fissazione, colorazione, visualizzazione e conservazione di RNA di molti tipi di tessuti ai fini di entrambi LCM IR e UV. Quando contemplando un disegno sperimentale per UV-LCM, gli individui dovrebbero adattare loro protocollo per adattarsi al meglio le esigenze e i requisiti di inizio e fine di materiali. Qui, uniamo molti aspetti dei diversi protocolli di LCM per fornire un metodo avanzato per la visualizzazione di cellule di Purkinje nel cervelletto umano post mortem senza dover preparare il RNA di alta qualità per il trascrittoma di colorante contenente i reagenti di colorazione sequenziamento.

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Protocollo

Tutti i campioni umani utilizzati in questo protocollo sono stati ottenuti con il consenso informato e sono stati approvati da interno Review Board (IRB) alla Columbia University e Università di Yale.

Nota: La totalità del presente protocollo deve seguire RNA rigoroso gestione delle linee guida, per cui una mano guantata viene sempre utilizzata, tutte le superfici vengono pulite con una decontaminazione di RNAsi e tutti i materiali di lavoro sono RNA/DNA/nucleasi gratis.

1. test RNA l'integrità del tessuto prima del LCM a partire

Nota: Test di qualità di RNA può essere fatto da molti metodi. Garantire che RNA dall'intera sezione è testato per fornire un numero rappresentativo di integrità RNA (RIN) per il campione.

  1. Selezionare con attenzione i campioni di tessuto per l'inclusione che corrispondono all'interno del parametro di disegno sperimentale. Se tagliare al criostato, spostare al punto 1.2. In caso contrario, elaborare di conseguenza il tessuto e passare al punto 1.11.
  2. Ottenere due contenitori di ghiaccio secco. La dimensione dipenderà il numero di campioni.
    1. Nel primo contenitore del ghiaccio secco, posizionare un tubo 2ml vuota, con etichetta con il codice del tessuto.
      Nota: Ci vogliono 10 minuti per i tubi di congelare. Tubi devono essere congelate prima di posizionare il tessuto in loro; in caso contrario, il tessuto si scioglierà sulla superficie del tubo.
    2. In un secondo contenitore di ghiaccio secco, posizionare il tessuto da un congelatore-80 ° C che richiede controllo di RNA.
  3. Pulire il criostato. Vedere passaggio 4.7 per una dettagliata procedura di pulizia.
  4. Rimuovere il tessuto da ghiaccio secco e tagliare una piccola sezione del tessuto con una lama di rasoio di RNAsi decontaminata. Il tessuto dovrebbe essere circa 1 cm x 1 cm nel formato.
  5. Posizionare un tumulo alto di circa 3 mm di temperatura di taglio ottimale (OCT) composto un criostato 'chuck' e farlo congelare parzialmente. Quindi, posizionare il tessuto in cima l'OCT — non spingere in OCT, semplicemente lasciare riposare sulla parte superiore.
  6. Una volta che si indurisce OCT, posizionare il mandrino con il tessuto montato nel braccio di taglio del criostato e posizione di fronte la lama del criostato.
  7. Trim a 30 μm sezioni fino a quando il tessuto è ancora.
  8. Tagliare 300 μm del tessuto e posto in un tubo 2ml congelati. Inserire il tubo di ghiaccio secco.
  9. Rimuovere il tessuto dal 'mandrino' e mettete in ghiaccio secco fino al momento di mettere via.
  10. Ripetere i passaggi da 1.4-1.9 per tutti i tessuti.
  11. Una volta completati tutti i campioni, estrarre RNA usando il kit di estrazione RNA fornito (Tabella materiali #15). Un protocollo dettagliato è fornito con il kit di estrazione di RNA. Seguire tutte le istruzioni comprese il passaggio facoltativo per asciugare la membrana del tubo di raccolta e il passaggio facoltativo per la digestione della dnasi (Tabella materiali #16).
  12. Verificare l'integrità del RNA estratto tramite una valutazione di qualità bioanalyzer14.

2. preparare prima del sezionamento a partire per LCM

  1. Pulire i possessori di diapositive prima di ogni turno di taglio del tessuto di LCM. Eseguire la procedura di pulizia il giorno prima dell'uso per permettere completa asciugatura durante la notte.
    Nota:     portavetrini sono utilizzati per il fissaggio del tessuto sezione in etanolo e schiarimento in xilene.
    1. Far scorrere supporto procedura di pulizia: lavare con decontaminazione RNasi seguita da dietil pirocarbonato trattato (DEPC) acqua. Lasciar asciugare durante la notte capovolta su una superficie libera di RNA/DNA/nucleasi, evitando eventuali tracce di polvere o altri contaminanti aerei.
      Attenzione: DEPC è altamente tossico e dovrebbe essere maneggiato ed eliminato utilizzando il protocollo standard sostanze chimiche pericolose EH & S.
  2. Pulire le spazzole per il sezionamento con RNAsi decontaminator e lasciar asciugare durante la notte. Evitare eventuali tracce di polvere e altri contaminanti.
  3. Posto la membrana scivola sotto luce UV per 30 min a temperatura ambiente. Fare non esporre che le diapositive ai raggi UV più di 1 – 2 giorni prima di utilizzano. Questo migliora l'associazione del tessuto alla diapositiva di membrana.
    Nota: Passo 2.3 può essere combinato con passo 4, che consente per diapositiva il trattamento UV si verificano nello stesso giorno come tessuto sezionamento (Vedi punto 4.4).

3. preparare soluzioni di fissaggio con RNAsi libera acqua ed etanolo di alta qualità

Nota: Tutte le soluzioni sono preparate freschi per ogni esperimento. Assicurarsi che il supporto per diapositive pulizia procedura dal passo 1.1 è completato. Tutte le soluzioni vengono preparate nel portavetrini.

  1. Posto 30 mL di etanolo al 100% in un portavetrini.
  2. Etanolo diluito con acqua gratuita RNasi/dnasi/nucleasi. Posto 30 mL di etanolo al 95% in una diapositiva titolare e mettere il ghiaccio.
  3. Etanolo diluito con acqua gratuita RNasi/dnasi/nucleasi. Posto 30 mL di etanolo al 70% in una diapositiva titolare e mettere il ghiaccio.
  4. Posto 30 mL di xilene 100% in due separate portavetrini ed etichettarli come #1 e #2.

4. preparare il criostato per il taglio di tessuto

  1. Prendi un secchio di ghiaccio per soluzioni di etanolo e un contenitore con ghiaccio secco per il tessuto.
    Attenzione: Il ghiaccio secco è estremamente freddo, quindi utilizzare guanti protettivi. Non collocare nello stesso contenitore di ghiaccio e ghiaccio secco. Temperature diverse nel ghiaccio e ghiaccio secco li farà a forma insieme a una temperatura indeterminata.
  2. Rimuovere il tessuto dal congelatore a-80 ° C e posto il ghiaccio secco per il trasporto al criostato.
  3. Impostazioni di criostato:
    1. Impostare lo spessore di sezione a 14 μm.
    2. Impostare lo spessore di taglio a 30 μm per conservare la quantità di tessuto.
    3. Per criostati con doppia camera ed esemplare che tiene le temperature, impostare la temperatura della camera (CT) a-18 ° C. Per criostati con una sola impostazione, impostare la temperatura a-17 ° C.
    4. Per criostati con doppia camera ed esemplare che tiene la temperatura, regolare la temperatura dell'oggetto (OT)-16 ° C.
      Nota: L'OT ha bisogno di essere più caldo che il CT per garantire anche un taglio. Se il tessuto è ancora triturazione, l'OT può essere aumentata a-15 ° C e il CT può essere aumentato a-18 ° C.
  4. Posizionare il tessuto nel criostato per almeno 20 min consentire a temperatura ottima.
    Nota: Se il tessuto non è a temperatura ottima, esso verrà tagliuzzare al momento del taglio. Non collocare il tessuto a-20 ° C la sera prima per preservare l'integrità del RNA e per prevenire la formazione di cristalli di ghiaccio. Consentire il tessuto come molto tempo come necessario stabilizzare a temperatura ottimale per tagliare senza problemi. Implementazione facoltativa di incubazione diapositiva sotto UV può verificarsi qui (Vedi punto 1.3).
  5. Posizionare il mandrino di' ' del criostato per almeno 20 min consentire di venire giù per la temperatura del criostato.
  6. Posizionare le spazzole pulite nel criostato per almeno 20 min consentire di venire giù per la temperatura del criostato.
  7. Pulire il criostato
    1. Pulire il palco con una miscela 1:1 di RNAsi decontaminazione e 70% di etanolo diluito con acqua gratuita di RNA/DNA/Nuclease per evitare il congelamento sul palco.
    2. Pulire una nuova lama monouso criostato con decontaminazione RNasi e posto del portalama sul palco. Consentire almeno 20 min per la lama di criostato a temperatura del criostato.
    3. Pulire la piastra stendi-fetta con decontaminazione RNasi e allo stage. Consentire almeno 20 min per la piastra a temperatura del criostato.
      Nota: Una piastra non è necessaria per il taglio, ma è altamente consigliata. Se non è disponibile una piastra, un pennello pulito funziona come un'alternativa. Se la piastra non è alla giusta temperatura, il tessuto sarà sciogliere o bastone su taglio.

5. taglio tessuto

  1. Tagliare un piccolo pezzo di tessuto (~ 1 cm x 1 cm) per il sezionamento. Tornare il tessuto restante del congelatore di ghiaccio secco /-80 ° C.
    Nota: Assicurarsi che la sezione di tessuto corteccia cerebellare ~ 95%, dove si trovano le cellule di Purkinje.
  2. Posto un tumulo alto di circa 3 mm di OCT per coprire il 'mandrino'. Iniziare con la costruzione degli strati in cima in un movimento circolare, lento, fino a quando c'è un piccolo tumulo.
  3. Una volta OCT è parzialmente congelato, ma c'è ancora un po' di liquido nel centro, posizionare il tessuto in cima OCT. Non spingere il tessuto profondamente in ott. Consenti il tessuto per sedersi in cima OCT fino a quando completamente congelato. Questo richiederà 1 – 2 min.
  4. Inserire il braccio di taglio criostato 'mandrino' con OCT congelati e il tessuto. Regolare il tessuto in modo che sia allineato con lama di taglio.
  5. Consentire al tessuto di sedersi in braccio di taglio per 15 – 20 min di adattarsi alla nuova temperatura.
    Nota: A seconda dello spessore del tessuto, il tempo necessario per acclimatazione di temperatura. Consentire al tessuto di sedersi come necessaria per tagliare in modo pulito. Regolare OT e CT per assistere con acclimatazione di temperatura dei tessuti.
  6. Spostare lentamente il tessuto più vicino alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, avviare il processo di finitura. Spessore di taglio deve essere impostato su 30 μm.
  7. Tagliare 2 – 3 volte fino a quando gli strati di corteccia sono visibili.
  8. Posizionare e allineare la piastra stendi-fetta appena sopra la lama del criostato.
    Nota: Verrà visualizzata una riga d'argento dalla luce nella criostato all'interfaccia della lama e della piastra stendi-fetta. Questo indica che la piastra è direttamente sopra il bordo della lama.
  9. Iniziare a tagliare le sezioni a 14 μm. Sezioni tagliate correttamente sarà piatta sotto la piastra stendi-fetta.
    Nota: Se il tessuto è bloccato, è necessario assicurarsi che la piastra sia abbastanza fredda. Se necessario, mettendo un pezzo di a secco di ghiaccio sulla volontà esterna (lato non toccando la fase) rapidamente raffreddare la piastra stendi-fetta.
  10. Tagliare 4 – 6 sezioni e allinearle orizzontalmente in tutta la fase del criostato.
  11. Pesca la diapositiva, raccogliere tutti i pezzi del tessuto in una sola volta.
    Nota: Utilizzando i pennelli, sollevare l'estremità del tessuto per essere più facilmente disponibili per la diapositiva al momento del prelevamento. Non aspirare una sezione alla volta. L'esposizione all'aria a temperatura ambiente si degrada l'integrità di RNA.
    Attenzione: La membrana non devono toccare la fase del criostato. Se la membrana tocca la fase, esso inizierà a staccarsi dal vetrino e causerà errori quando si tenta di LCM.
  12. Immediatamente spostare al passaggio 6. Non ritardare la fissazione.

6. fissaggio del tessuto/macchia meno visualizzazione

  1. Spostare immediatamente il protocollo di fissazione dell'etanolo
  2. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 70% per 2 min — sul ghiaccio.
  3. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 95% per 45 s — sul ghiaccio.
  4. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con etanolo al 100% per 2 min — a TA.
  5. Immergere il vetrino 3 volte nel supporto per diapositive con xilene 1 — a TA.
  6. Porre il vetrino nel supporto per diapositive con xilene 2 per 5 min — a TA.
  7. Lasciare per asciugare in una zona pulita per almeno 30 min più lunghi tempi di asciugatura sono ottimali, fino a 60 min.
    Attenzione: Alzarsi diapositive per l'essiccazione in una cappa aspirante. Xilene è volatile. Diapositive posa piatto causerà xilene al pool nella sezione del tessuto, che causerà il tessuto essere troppo scuro.

7. opzionale — Slide Storage

  1. Mettere i vetrini essiccati in provette individuali da 50 mL (una diapositiva per tubo) e mettere in congelatore-80 ° C fino a 7 giorni.
    Nota: Diapositive devono essere asciutti prima di mettere nel congelatore-80 ° C. Non utilizzare essiccante all'interno del tubo come particolato verrà incorporato nel tessuto e membrana. Assicurarsi che il cappuccio del tubo è stretto; in caso contrario, condensazione si verificherà sulla diapositiva quando si scioglie per l'uso.
    Attenzione: Integrità di RNA diminuisce dopo 7 giorni, così come la qualità di visualizzazione del tessuto.

8. lo scongelamento memorizzati scivoli per l'uso

  1. Rimuovere il tubo con una singola diapositiva dal congelatore-80 ° C 1 h prima dell'uso previsto.
  2. Non aprire immediatamente il tubo. Lasciare il tubo a temperatura ambiente. Si verificherà la condensa sulla parte esterna del tubo solo.
  3. Una volta che il tubo è venuto a temperatura ambiente e condensa tutto è andata (circa 30 – 40 min), togliere il tappo ed esporre il vetrino all'aria a temperatura ambiente.
  4. Lasciar acclimatare a temperatura ambiente per 15 – 20 min. congedo rimosso il vetrino all'interno del tubo con il tappo.
    Nota: Diapositiva è ora pronto per LCM.

9. laser Capture Microdissection delle cellule di Purkinje:

Nota: In questa sezione del protocollo discuterà solo specifiche legate alla cattura di cellule di Purkinje per la successiva sequenza di RNA. Questa sezione si presuppone che l'utente abbia familiarità con il microscopio di acquisizione laser UV e il software affiliato.

  1. Pulire il tavolino del microscopio e la raccolta di tappo braccio con decontaminazione RNasi.
  2. Con le mani guantate, posizionare il vetrino sul microscopio e 500 μL opaco tappo nel braccio insieme.
    Nota: Sempre garantire la corretta tecnica di RNA di pulizia dell'area di lavoro con decontaminazione RNasi e utilizzare mani inguantate mentre si tocca la diapositiva o il cappuccio di colore opaco. Guanti possono essere rimossa dopo lo scivolo e il cappuccio sono in atto e laser capture ha avviato.
  3. A basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco con il tessuto cerebellare, assicurando che il tappo copre tutta l'area visualizzata dell'oculare.
    Nota: Solo l'oculare del microscopio mostrerà se il cappuccio opaco è centrato. La fotocamera non mostrerà se il tappo è centrato sopra il tessuto. Secondo il disegno di ambito di acquisizione laser, la visualizzazione attraverso il tappo opaco sarà nel pezzo occhio solo o visualizzato nella parte dell'occhio e macchina fotografica.
  4. Visualizzare gli strati cerebellari con 5x - 10x diametro obiettivo e posizionare il cursore sopra la sezione intersezione tra strato molecolare e strato delle cellule del granello (lo strato delle cellule di Purkinje).
  5. Spostare a 40x e visualizzare le cellule di Purkinje.
    Nota: Per effetti grafici di esempio, vedere Figura 1 e Figura 2 .
  6. Iniziare a catturare le cellule di Purkinje.
    Nota: Per eseguire la sequenza di RNA, almeno 5 ng di RNA è necessaria. Circa 1600 – 2000 Purkinje cellule causare abbastanza materiale di RNA per il sequenziamento. RNA sarà stabile per fino a 8 h al microscopio. Test di energia UV e UV concentrazione prima della raccolta che i livelli siano corretti. Nel corso del tempo, il tessuto continuerà ad asciugare e l'energia UV e UV potrebbe essere necessario essere modificato.

10. RNA collezione post LCM

  1. Preparare il tampone di lisi delle cellule (preparare fresco ogni volta)
    1. Diluire 2-mercaptoetanolo in tampone di Lisi a 1: 100 (10 mL di μL:1, rispettivamente). Buffer di lisi (RLT) è fornito in Tabella materiali (#14 e #15).
  2. Aggiungere 50 μL di tampone di lisi delle cellule al tappo opaco, con il tappo rivolto verso l'alto. Chiudere accuratamente il tubo sopra il tappo.
  3. Lasciare il tubo capovolto per 1 min.
  4. Vortice del tubo per 30 s e ruota velocemente il buffer di lisi alla parte inferiore del tubo.
  5. Riaprire il tubo e ripetere i passaggi da 10.2-10.4.
  6. Collocare la provetta contenente 100 μL di tampone di lisi e RNA dal congelatore-80 ° C fino a quando tutti i campioni sono finito e pronto per l'estrazione di RNA (Tabella materiali #14).

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Risultati

Questo protocollo dettaglia i passaggi per la preparazione del tessuto di cervello umano fresco congelato post mortem per UV-LCM. Le annotazioni e le specifiche approfondite sono riportate per il taglio di criostato, come può essere difficile da tagliare del tessuto di cervello congelato fresco con un elevato grado di precisione. Il punto più importante da considerare è che il tessuto congelato fresco è estremamente freddo e richiede una notevole quantità di tempo per ambientarsi alla tem...

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Discussione

Il protocollo presentato qui è specificamente modificato per essere un approccio inox nel visualizzare tessuti morfologicamente distinte per UV-LCM. Questo metodo è progettato per massimizzare l'integrità di RNA per successivo sequenziamento diretto di RNA, pur mantenendo un livello avanzato di visualizzazione del tessuto. La capacità di distinguere diversi tipi di cellule per la cattura, per creare la popolazione più pura delle cellule possibili, è essenziale per la comprensione di diversi profili molecolari in tessuti ...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori desidera ringraziare la New York Brain Bank, Dr. Jean Paul Vonsattel e Dr. Etty Cortés, per la loro assistenza in taglio e conservare i campioni di tessuto di cervello umano congelato per questi esperimenti. Gli autori desidera ringraziare gli individui che hanno generosamente donato il loro cervello per la continua ricerca nel tremore essenziale. Dr. Faust e Dr. Martuscello desidera ringraziare Columbia University Dipartimento di patologia e biologia delle cellule per il loro continuo supporto e spazio di ricerca di base. Gli autori desidera ringraziare NIH R01 NS088257 Louis/Faust) finanziamenti per la ricerca per questo progetto. Immagini di LCM sono stati effettuati nel confocale e specializzata di microscopia Shared Resource di Herbert Irving Comprehensive Cancer Center presso la Columbia University, supportato da NIH concedere #P30 CA013696 (National Cancer Institute). Gli autori desidera ringraziare Theresa Swayne e Laura Munteanu per la loro assistenza continuata con microscopia specializzata.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
MembraneSlide NF 1.0 PENZeiss415190-9081-000Vetrini a membrana per tessuti. Si sconsiglia l'uso di vetrini.
AdhesiveCap 500 OpaqueZeiss415190-9201-000I cappucci opachi sono utilizzati per migliorare la visualizzazione solo su endoscopi invertiti
RNase AwayMolecular BioProducts7005-11Sono adatti anche altri prodotti per la decontaminazione con RNasi. Utilizzare per pulire tutte le superfici prima del lavoro.
200 Proof EthanolDecon Laboratories2701Se si utilizza etanolo alternativo, garantire un'alta qualità. Essenziale per la fissazione dei tessuti.
Xileni (certificato ACS)Fisher ScientificX5P-1GALSe si utilizza xilene alternativo, garantire un'alta qualità. Essenziale per la visualizzazione dei tessuti.
Acqua distillata ultrapuraInvitrogen10977-015anche ad altre acque prive di RNA/DNA/nucleasi. Utilizzato solo nella diluizione dell'etanolo.
Barattoli per vetrini Slide-FixEvergreen240-5440-G8KÈ adatto anche qualsiasi supporto per vetrini/barattolo. Deve essere pulito prima dell'uso. Utilizzato per il fissaggio dopo il sezionamento.
Piastra antirollio, 70 mm 100 μ mLeica Biosystems14041933980Il tipo di piastra antirollio è determinato dal tipo di criostato e dalla posizione di attacco sul tavolino. Tutti i criostati hanno requisiti diversi.
Dietil pirocarbonato (DEPC)Sigma AldrichD5758-50mLDEPC da qualsiasi fornitore andrà bene. Seguire le indicazioni per il trattamento dell'acqua.
KimwipesFisher Scientific06-666ALe salviette Kimwipes possono essere ordinate da qualsiasi fornitore e utilizzate in qualsiasi dimensione. Le salviette Kimwipe devono essere utilizzate per pulire il microscopio e il criostato.
Tissue-Plus O.C.T. CompoundFisher Scientific23-730-571Qualsiasi marca di OCT è accettabile. Nessun tessuto sarà incorporato nell'OCT, è sufficiente attaccare il tessuto al 'chuck'.
Lame per microtomo a basso profilo Edge-RiteThermo Scientific4280Lè determinato dal tipo di criostato. Tutti i criostati hanno requisiti diversi.
Leica Microsystems 3P  25 + 30 MM MANDRINI CRIOSTATICIFisher ScientificNC0558768tipo di mandrino è determinato dal tipo di criostato. Tutti i criostati hanno requisiti diversi. Entrambe le dimensioni sono adatte.
RNeasy Micro Kit (50)Qiagen74004Necessario per l'estrazione dell'RNA post LCM. Tampone di lisi RLT essenziale per raccogliere le cellule catturate dal tappo opaco.
RNeasy Mini Kit (50)Qiagen74104Necessario per l'estrazione dell'RNA delle preparazioni delle sezioni, che vengono eseguite prima della LCM per testare l'integrità dell'RNA dei tessuti di partenza.
Il set di DNasi senza RNasiQiagen79254Dnase rimuoverà qualsiasi DNA per consentire una popolazione di RNA pura. Assicurati che Dnase sia fatto fresco.
2-MercaptoetanoloSigma AldrichM6250-100MLVolume acquistato a discrezione dell'utente. Necessario per l'aggiunta al tampone RLT per la lisi cellulare. Previene l'attività della RNasi.
Globo scientifico  Lotto Provetta per microcentrifuga graduata certificata (2 mL)Fisher Scientific22-010-092Qualsiasi provetta da 2 mL priva di RNasi, DNasi, DNA umano e pirogeni andrà bene.
Adatto Il tipo di lama

Riferimenti

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