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Articolo metodologico

Modello preclinico di ischemia degli arti posteriori nei conigli diabetici

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DOI:

10.3791/58964

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2 giugno 2019

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1Department of Biomedical Engineering, University of Texas at Austin, 2Division of Cardiology, University of Texas McGovern Medical School, 3Center for Laboratory Animal Medicine and Care, UT Health Science Center at Houston, 4Memorial Herman Heart and Vascular Center, Texas Medical Center, 5Institute for Cellular and Molecular Biology, University of Texas at Austin, 6The Institute for Computational Engineering and Sciences, University of Texas at Austin, 7Institute for Biomaterials, Drug Delivery and Regenerative Medicine, University of Texas at Austin

In questo articolo

Sommario

Descriviamo una procedura chirurgica utilizzata per indurre l'ischemia periferica nei conigli con iperlipidemia e diabete. Questo intervento chirurgico agisce come un modello preclinico per le condizioni sperimentate nella malattia dell'arteria periferica nei pazienti. L'angiografia è anche descritta come un mezzo per misurare l'entità dell'ischemia introdotta e il recupero della perfusione.

Abstract

La malattia vascolare periferica è un problema clinico diffuso che colpisce milioni di pazienti in tutto il mondo. Una delle principali conseguenze della malattia vascolare periferica è lo sviluppo di ischemia. Nei casi più gravi, i pazienti possono sviluppare ischemia critica degli arti in cui sperimentano dolore costante e un aumento del rischio di amputazione degli arti. Le attuali terapie per l'ischemia periferica includono la chirurgia di bypass o interventi percutanei come angioplastica con stenting o aterectomia per ripristinare il flusso sanguigno. Tuttavia, questi trattamenti spesso non riescono a progressione continua della malattia vascolare o ristenosi o sono controindicati a causa della scarsa salute generale del paziente. Un promettente approccio potenziale per il trattamento dell'ischemia periferica comporta l'induzione della neovascolarizzazione terapeutica per consentire al paziente di sviluppare vascolarizzazione collaterale. Questa rete appena formata allevia l'ischemia periferica ripristinando la perfusione all'area interessata. Il modello preclinico più frequentemente impiegato per l'ischemia periferica utilizza la creazione di ischemia degli arti posteriori nei conigli sani attraverso la legazione dell'arteria femorale. In passato, tuttavia, c'è stata una forte disconnessione tra il successo degli studi preclinici e il fallimento di sperimentazioni cliniche riguardanti trattamenti per l'ischemia periferica. Gli animali sani in genere hanno una solida rigenerazione vascolare in risposta a ischemia indotta chirurgicamente, in contrasto con la ridotta vascolarizzazione e rigenerazione in pazienti con ischemia periferica cronica. Qui, descriviamo un modello animale ottimizzato per l'ischemia periferica nei conigli che include iperlipidemia e diabete. Questo modello ha ridotto la formazione collaterale e il recupero della pressione sanguigna in confronto ad un modello con una dieta di colesterolo superiore. Così, il modello può fornire una migliore correlazione con i pazienti umani con angiogenesi compromessa dalle commorbilità comuni che accompagnano la malattia vascolare periferica.

Introduzione

La malattia arteriosa periferica (PAD) è un disturbo circolatorio comune in cui la progressione della formazione di placca aterosclerotica porta ad un restringimento dei vasi sanguigni negli arti del corpo. Il recente aumento dei fattori di rischio per l'aterosclerosi, compreso il diabete, l'obesità e l'inattività, ha portato ad aumentare la prevalenza della malattia vascolare1. Attualmente, si stima che il 12% – 20% della popolazione generale oltre 60 anni ha una malattia arteriosa periferica2. Una delle principali conseguenze della malattia arteriosa periferica è lo sviluppo dell'ischemia periferica, più comunemente trovata negli arti inferiori. Nei casi più gravi, i pazienti possono sviluppare ischemia critica degli arti, uno stato in cui c'è dolore costante a causa di una mancanza di flusso sanguigno. I pazienti con ischemia critica degli arti hanno una probabilità 50% di avere un arto amputato entro un anno dalla diagnosi. Inoltre, i pazienti con diabete hanno una maggiore incidenza di arteriopatia periferica e risultati più poveri dopo interventi per la rivascolarizzazione3,4. Le attuali terapie per l'ischemia periferica includono interventi percutanei come aterectomia e stenting o bypass chirurgico. Tuttavia, per molti pazienti questi trattamenti forniscono solo benefici a breve termine e molti non sono abbastanza sani per le principali procedure chirurgiche. In questo lavoro, descriviamo un modello animale preclinico per testare nuovi trattamenti mirati alla malattia vascolare periferica che incorpora la generazione di ischemia periferica nei conigli attraverso la legazione chirurgica nel contesto dello stato di malattia diabetica.

Il modello di ischemia degli arti posteriori nei conigli è stato utilizzato come modello fisiologico per la malattia vascolare ostruttiva e precursore preclinico di studi umani per oltre mezzo secolo5,6. I conigli sono spesso una specie preferita per gli studi sull'ischemia periferica a causa della muscolatura sviluppata del muscolo della caviglia e del vitello, in contrasto con i comuni modelli animali di grandi dimensioni che sono ungulati (animali con zoccoli). Diverse recensioni recenti hanno affrontato l'uso di questo modello e altri nella modellazione della malattia vascolare periferica in esseri umani7,8. Modelli simili che utilizzano l'ischemia degli arti posteriori nei conigli sono stati usati negli studi preclinici sui fattori di crescita9,10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19,20, terapia genica21,22,23, 24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34,35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44e cellule staminali45,46,47,48,49,50 ,51per la neovascolarizzazione terapeutica negli arti. Sfortunatamente, le sperimentazioni cliniche che hanno seguito questi studi animali di successo non hanno mostrato benefici significativi per i pazienti52.

Una spiegazione suggerita della ragione di questo fallimento traslazionale è che la condizione dell'ischemia periferica nei pazienti umani è quella che include la resistenza ai segnali angiogenici53,54,55, 56 a , 57 a , 58 a , 59. diversi studi hanno evidenziato difetti nelle vie di segnalazione angiogenica nel diabete e nell'iperglicemia. Il diabete e l'iperlipidemia portano ad una perdita di proteoglicani eparan solfato e un aumento degli enzimi che tagliano il solfato di eparan, presentando un potenziale meccanismo per la resistenza all'angiogenesi terapeutica/arteriogenesi con fattori di crescita60 , 61. Pertanto, una caratteristica fondamentale di un modello per l'ischemia periferica dovrebbe includere un aspetto della resistenza terapeutica in modo che le terapie possano essere valutate nel contesto dello stato di malattia presente nei pazienti umani.

In questo lavoro, descriviamo un modello di coniglio di ischemia periferica attraverso la legazione chirurgica delle arterie femorali. Un periodo di piombo con l'induzione del diabete e dell'iperlipidemia è incorporato nel modello. Abbiamo confrontato questo modello con un altro modello che incorpora una dieta grassa più alta senza diabete e ha scoperto che il modello con diabete e basso livello di iperlipidemia era più efficace nel ridurre la crescita dei vasi sanguigni. Il nostro modello combina i progressi che sono stati utilizzati da gruppi separati, con l'obiettivo di fornire un metodo pratico e standardizzato per ottenere risultati coerenti nella ricerca sulle malattie vascolari periferiche.

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Protocollo

Gli studi che coinvolgono gli animali sono stati condotti con l'approvazione dell'Università del Texas ad Austin e il centro scientifico Utheivita presso il Comitato istituzionale di cura e uso degli animali di Houston (IACUC), l'ufficio di revisione degli animali e dell'uso (ACURO) dell'esercito degli Stati Uniti Ricerca medica e Materiel comando ufficio di protezioni di ricerca, e in conformità con le linee guida NIH per la cura degli animali.

1. induzione del diabete e iperlipidemia

  1. Transizione i conigli neozelandesi (4 – 6 mesi) da una tazza di erba medica standard a 0,1% di colesterolo Chow nel corso di quattro giorni. Per i giorni 1 – 5, utilizzare il Chow standard a rapporto di colesterolo Chow di 1:0, 3:1, 1:1, 1:3, e 0:1, rispettivamente. Dopo due settimane sul 0,1% di colesterolo Chow, indurre i conigli ad avere il diabete usando l'iniezione di allossana come descritto nei seguenti passaggi
  2. Sedate i conigli con 35 – 75 mg/mL di chetamina e 1 – 2 mg/mL di acepromazina per iniezione sottocutanea e preparate un'iniezione endovenosa introducendo un catetere nella vena marginale sinistra con un catetere da 22 g.
  3. Raccogliere una goccia di sangue dai conigli attraverso il mozzo del catetere della vena dell'orecchio per la misurazione del livello basale di glucosio nel sangue (BGL). È possibile utilizzare qualsiasi glucometro standard. I livelli normali di glucosio per un coniglio sono tipicamente nell'intervallo di 80 a 150 mg/dL.
  4. Iniettare allossana a 100 mg/kg ricostituito in soluzione salina ad un volume di 8 ml attraverso il catetere auricolare lentamente per un periodo di 8 minuti utilizzando una pompa a siringa.
  5. Controllare il BGL ogni ora per le prossime 12 h utilizzando un glucometro standard per monitorare per l'ipoglicemia.
    1. Mettere il coniglio in un trattenitore.
    2. Anestetizzare l'orecchio con 2,5% lidocaina/2.5% crema di prilocaina.
    3. Prenda il sangue dalla vena dell'orecchio laterale utilizzando un ago da 27 G e misuri BGL utilizzando un misuratore standard.
  6. Misurare il BGL due volte al giorno per i primi 7 giorni. Dare ai conigli un'iniezione di insulina se il BGL raggiunge o supera 350 mg/dL.
  7. Preparare una sfera in acciaio inossidabile di 3 mm per l'impianto come marcatore di dimensioni durante gli angiogrammi prima del giorno dell'intervento chirurgico.
    1. Tagliare un pezzo circolare di 10 mm di pellicola silastica da un foglio più grande utilizzando un pugno biopsia.
    2. Montare la sfera al centro del foglio utilizzando un sigillante in silicone trasparente.
    3. Coprire completamente la palla con il sigillante. Lasciar curare il sigillante per un minimo di 24 ore.
    4. Posizionare la palla in un sacchetto di polietilene a bassa densità da 2 pollici x 3 pollici aperto e posizionarlo in una sacca di sterilizzazione da sterilizzare con gas di ossido di etilene.

2. preparazione del coniglio per la chirurgia

  1. Anestetizzare il coniglio con 20 – 40 mg/kg di chetamina e 2 mg/kg di midazolam tramite iniezione sottocutanea. Posizionare il coniglio sull'1,5% – 3% isoflurano (tipicamente 2%) durante la sedazione iniziale utilizzando una maschera. Somministrare un'iniezione di Alfaxalone per mantenere l'anestesia attraverso un'iniezione intramuscolare di 3 mg/kg.
  2. Una volta anestetizzato, rimuovere la maschera e inserire un tubo endotracheale ammanicato, nelle vie respiratorie e collegare ad un ventilatore. Continuare a somministrare isoflurano all'1,5% – 3%.
  3. Raccogli il sangue dall'arteria centrale da entrambe le orecchie per un pannello chimico di base.
  4. Posizionare un catetere per la vena dell'orecchio di 22 G nella vena laterale per la soluzione di Ringer lattato in tutta la procedura chirurgica. In alternativa, è possibile utilizzare una soluzione salina normale (0,9% cloruro di sodio).
  5. Utilizzando la vena laterale nell'orecchio opposto, posizionare un catetere nella vena e consegnare Alfaxalone a 6 mg/kg/h. aumentare gradualmente l'Alfaxalone a 8 mg/kg/h diminuendo l'isoflurano a 0,6% durante il periodo di preparazione.
  6. Per limitare il dolore e il rischio di infezione, somministrare buprenorfina (0,01 mg/kg) e enrofloxacina (5 mg/kg) utilizzando un'iniezione sottocutanea con un ago da 25 G.
  7. Tagliare i capelli sul collo, le cosce interne destra e sinistra, e indietro utilizzando Clippers (#40 lama). I capelli vengono rimossi dal retro per mantenere il contatto con il tampone di messa a terra.
  8. Posizionare un polsino della pressione sanguigna su ciascuno degli arti posteriori e misurare la pressione sanguigna iniziale. Posizionare il polsino appena sotto il ginocchio con la sonda appena sopra il Hock sulla superficie laterale.
  9. Posizionare il coniglio sul tavolo di chirurgia sulla schiena e strofinare e drappe i siti di chirurgia. Questo include il collo per l'accesso all'arteria carotide e la coscia destra interna per l'accesso all'arteria femorale. Eseguire lo scrub di sterilizzazione con scrub alternati al 2% di clorexidina e 70% di alcol etilico. Ripetere questo tre volte, quindi applicare uno spray finale con 2% soluzione di clorexidina.
  10. Posizionare una sfera in acciaio inossidabile di 3 mm che è stata sterilizzata all'interno di un sacchetto di polietilene a bassa densità sulla parte superiore della gamba destra (strofinato) vicino alla parte superiore della coscia per servire come riferimento di dimensione durante le misurazioni angiogramma. Posizionare un drappo sterile sulla gamba fino al momento dell'intervento chirurgico. Lasciare la palla all'interno del sacchetto di plastica sterile durante il primo angiogramma.

3. l'angiografia

  1. Esporre la giusta arteria carotide comune
    1. Fare un'incisione di 4 – 5 cm di lunghezza solo laterale alla trachea utilizzando un bisturi con una lama #15.
    2. Utilizzare la dissezione smussata per esporre l'arteria carotide e aprire l'incisione utilizzando piccoli retrattori Weitlaner. Isolare accuratamente l'arteria carotidea dalla vena giugulare e dal nervo vago. Tipicamente, una curva Metzenbaum forbici e un emostatico di zanzara curvo sono utilizzati per la dissezione smussata. Assicuratevi di ottenere la piena separazione dell'arteria carotide dal nervo e dalla vena giugulare per rendere le legature solo legare l'arteria.
  2. Posizionare una legatura utilizzando una sutura di seta 4-0 alle estremità prossimali e distali dell'arteria esposta. Legare l'estremità distale della carotide con il nodo di un chirurgo seguito da quattro nodi quadrati. Sull'estremità prossimale, utilizzare un ligaloop per consentirgli di essere serrato o allentato secondo necessità. L'uso di un ligaloop posto all'estremità prossimale dell'arteria esposta può aiutare a fissare l'introduttore e il catetere.
  3. Somministrare 500 UI di eparina attraverso la IV. Utilizzare circa 0,5 mL di lidocaina 1% applicato lungo la carotide esposta per dilatare la nave. Un trattamento è di solito sufficiente, ma può essere ripetuto se necessario. Tagliare approssimativamente a metà strada attraverso l'arteria carotide utilizzando un bisturi o iris forbici, quindi posizionare lo strumento di inserimento filo 4-inch nell'arteria.
  4. Alimentare un filo guida da 0,014 pollici x 185 cm attraverso lo strumento di inserimento alla biforcazione aortica sulla cresta iliaca nell'aorta discendente. Rimuovere lo strumento di inserimento e inserire un catetere angiografico a codino 3F sul filo.
  5. Avanzare il catetere codino per essere 2 cm prossimale alla biforcazione aortica sulla cresta iliaca nell'aorta discendente.
  6. Posizionare la punta del catetere tra la settima vertebra lombare e la prima vertebrale sacrale. Testare la posizione del catetere iniettando manualmente un 2 – 4 mL di agente di contrasto.
  7. Somministrare un'iniezione intra-arteriosa di 100 μg di nitroglicerina attraverso il catetere per aumentare la vasodilatazione.
  8. Somministrare 0,8 mL di lidocaina 1% al coniglio attraverso il catetere per aiutare con vasodilatazione durante l'angiogramma. Fissare il tubo per l'iniettore al catetere e rimuovere eventuali bolle d'aria nella linea. Iniettare 8-9 mL di mezzo di contrasto utilizzando un iniettore angiografico automatizzato attraverso il catetere.
  9. Registrare le immagini seriali degli arti posteriori usando l'angiografia.
    1. Impostare l'iniettore di potenza per iniettare il contrasto a 3 mL/sec per un totale di 8-9 mL. Eseguire l'angiografia digitale a sottrazione a 6 fotogrammi al secondo.
    2. Selezionare le immagini seriali create e modificare una foto di ogni angiogramma utilizzando circa-40% impostazione per minimizzare l'aspetto dell'osso e catturare un quadro completo della perfusione vaso con contrasto. Un esempio angiogramma del flusso vascolare dopo la legazione/escissione dell'arteria femorale è mostrato in Figura 1.

4. isolamento dell'arteria femorale

  1. Fare un'incisione longitudinale nella pelle sopra l'arteria femorale destra utilizzando un bisturi (#15 lama). Assicurarsi che l'incisione si estenda inferiormente dal legamento inguinale che termina nella zona appena prossimale alla rotula (circa 6 cm).
  2. Utilizzare la dissezione smussata con le forbici curve Metzenbaum o un emostatico di zanzara curvo per esporre l'arteria femorale.
  3. Usare i retrattori Weitlaner per tenere aperta l'incisione.
  4. Aggiungere 0,5 mL di lidocaina 1% localmente per ridurre l'irritazione del nervo e promuovere la vasodilatazione.
  5. Continuare la dissezione smussata dei tessuti per liberare l'intera lunghezza dell'arteria femorale insieme a tutti i rami dell'arteria femorale, tra cui l'epigastrica inferiore, femorale profonda, circumflessione laterale, e le arterie epigastriche superficiali (Figura 2a) .
  6. Dissezionare ulteriormente lungo le arterie poplitee e safene così come l'arteria iliaca esterna (Figura 2a). Inumidire periodicamente l'area con soluzione salina per proteggere dal danno tissutale. Se la dissezione smussata viene eseguita lungo la scanalatura femorale (tra i muscoli) non c'è bisogno di tagliare il muscolo.
  7. Separare accuratamente l'arteria dalla vena e dal nervo come mostrato nella Figura 2B, C. Ligare le arterie indicate dal diagramma con 4,0 suture di seta mettendo due legami con abbastanza spazio tra di loro per tagliare l'arteria. Questi legami vengono eseguiti con un nodo del chirurgo seguito da quattro nodi quadrati.
  8. Tagliare tra i due legami sulle arterie ligate utilizzando le piccole forbici Metzenbaum. Accisa l'arteria femorale dalla sua origine prossimale come un ramo dell'arteria iliaca esterna al punto distalmente dove si biforcazione per formare le arterie safena e poplitea.

5. Ripeti angiografia

  1. Utilizzare 4-0 sutura di seta per attaccare il foglio silastico, con sfera in acciaio inossidabile di 3 mm alla parte superiore del muscolo quadricipite. Tirare la pelle sopra la palla dopo che è in posizione.
  2. Somministrare un'iniezione intra-arteriosa di 100 μg di nitroglicerina attraverso il catetere per aumentare la vasodilatazione.
  3. Se necessario, somministrare un altro 0,8 mL di lidocaina 1% al coniglio attraverso il catetere per assistere con vasodilatazione durante l'angiogramma.
  4. Iniettare 8-9 mL di mezzo di contrasto utilizzando un iniettore angiografico automatizzato.
  5. Eseguire l'angiografia come descritto nel passaggio 3,9.

6. chiusura e recupero delle ferite

  1. Rimuovere il catetere dall'arteria destra. Legare l'arteria utilizzando la sutura di seta 4-0 che è già in atto intorno all'arteria.
  2. Suture entrambe le ferite chiuse. Chiudere gli strati muscolari e subcuticolari utilizzando 4-0 polidiossanone o 3-0 poliglactina 910 su un ago conico (vedere tabella dei materiali) in un modello di sutura continua. Chiudere la pelle utilizzando 4-0 polidiossanone o 4-0 poliglactina 910 su un ago da taglio inverso (vedere tabella dei materiali) in un modello di sutura subcuticolare continua sepolta.
    Nota: se disponibile, polidiossanone è preferibile per entrambi.
  3. Somministrare iniezioni intradermiche di 0,25% di bupivacaina vicino alle incisioni utilizzando una siringa con un ago da 25 G. Inserire l'ago e iniettare 0,5 mL mentre l'ago viene tirato indietro. Dare una iniezione per lato della ferita per l'incisione sul collo (due iniezioni sul collo) e due iniezioni per lato della ferita per l'incisione sulla gamba (quattro iniezioni sulla gamba; sei iniezioni in totale). Il volume totale iniettato è di 3 mL (0,5 mL x 6 iniezioni).
  4. Somministrare iniezioni sottocutanee di 0,5 mg/kg di meloxicam e di buprenorfina a rilascio prolungato a 0,12 mg/kg.
  5. Monitorare il coniglio come si recupera dall'anestesia. Il coniglio inizierà automaticamente a deglutire come si sveglia dall'anestesia. Una volta che la risposta deglutizione si verifica, rimuovere il tubo endotracheale. Fornire un attento monitoraggio e supporto termico fino a quando il coniglio è in grado di mantenere la funzione cardiovascolare e la temperatura corporea. Riportare il coniglio nel suo recinto una volta che è in grado di ambulare.
  6. Impiegare verdure fresche e/o l'alimentazione della siringa di una dieta di cura critica insieme a iniezioni saline sottocutanee se il coniglio non tollera il Chow dopo l'intervento chirurgico. Cavolo, broccoli, cavolfiore, carote, o altro in verdure di stagione possono essere utilizzati. Shred le verdure e mescolare insieme per aiutare nel coniglio di ritorno a mangiare.

7. monitoraggio delle

  1. Anestetizzare i conigli ogni due settimane per acquisire la pressione sanguigna su entrambe le gambe come descritto nel passaggio 2,8. Raccogliere il sangue dall'arteria centrale dell'orecchio per l'uso nei saggi di chimica del sangue. In alternativa, prendere il sangue dalla vena safena o dalla vena cefalica. Prendere approssimativamente 2 mL ad ogni punto temporale. Utilizzare un pannello di chimica del sangue standard per l'analisi. Se necessario, aggiungere test per lipoproteina a bassa densità (LDL), lipoproteina ad alta densità (HDL), o emoglobina Hba1c (HbA1c).
  2. Prendere una piccola quantità di sangue per le misurazioni BGL.

8. il trattamento

  1. Preparare dieci siringhe con trattamento, Carrier e CROSSLINKER. Riempire ogni siringa appena prima dell'uso con 100 μL di liquame di solfato di calcio e poi 100 μL di alginato di sodio al 2% con fattori di crescita o altri trattamenti in modo che l'alginato sia più vicino alla punta della siringa.
  2. Somministrare una iniezione preparata nel muscolo prima di preparare il successivo. Questo riduce il tempo che l'alginato interagisce con il solfato di calcio nella siringa. Lo spazio le iniezioni uniformemente lungo entrambi i lati dell'arteria femorale sulla coscia. Per ottenere iniezioni uniformi, creare un foglio di silicone con fori per guidare l'iniezione, come descritto in altri studi19. Questo può essere facilmente preparato utilizzando un punzone per biopsia per creare fori in fogli di silicone disponibili in commercio.

9. angiografia endpoint, eutanasia, fissazione della perfusione e raccolta dei tessuti

  1. Alla data dell'endpoint, eseguire l'angiografia come descritto nel passaggio 3, ma utilizzare l'arteria carotide sinistra per l'accesso.
  2. Dopo angiografia, spostare l'animale al tavolo necroscopia ed eseguire la fissazione di perfusione per preservare i tessuti degli arti posteriori:
    1. Aumentare l'isoflurano al 3% – 4% ed eseguire un pizzico di punta per confermare che l'anestesia è sufficientemente profonda.
    2. Somministrare 1000-2000 UI di eparina per via endovenosa.
    3. Crea un'incisione lungo la linea mediana della gabbia toracica e attraversa la lunghezza del diaframma usando un bisturi con una lama #20.
    4. Con la gabbia toracica esposta, tagliare le costole appena a sinistra della linea mediana con frese a costine. USA i retrattori Weitlaner per esporre il cuore.
    5. Impostare la pompa con tubo di uscita con un diametro interno di 1/8 pollici e un ago 18G alla fine. Precaricare la linea con soluzione salina e avere almeno 600 mL di soluzione salina e formalina preparata in contenitori separati per la perfusione.
    6. Inserire l'ago da 18 G collegato alla pompa nel ventricolo sinistro tramite l'apice del cuore. Inserisci un altro ago da 18 G (non attaccato a nulla) nell'atrio destro e Consenti al sangue di fluire nel downdraft della tabella del necroscopia.
    7. Utilizzare una pompa di perfusione per controllare il flusso di circa 500 mL di soluzione salina nel cuore. Utilizzare un settaggio pompa per flusso 110 mL/min.
    8. Una volta che il fluido proveniente dal cuore è limpido, spostare il tubo dal serbatoio salino a uno riempito con una soluzione di formalina al 10%. Il contrattacco avverrà in tutti e quattro gli arti se la perfusione funziona correttamente. Pompare circa 500 mL di soluzione di formalina nel ventricolo sinistro.
    9. Spegnere la pompa e togliere gli aghi dal cuore.
  3. Rimuovere entrambi gli arti posteriori all'anca tagliando intorno all'articolazione dell'anca con un bisturi con #20 lama. Utilizzare una piccola fresa a costine per rimuovere gli arti. Utilizzare l'arto non ischemico come controllo.
  4. Conservare gli arti in formalina per 24 h a 4 ° c e poi immagazzinato in 70% etanolo a 4 ° c.
  5. Per l'analisi istologica, prendere biopsie multiple dagli arti. Abbiamo usato otto biopsie da 6 mm prese nelle regioni della coscia e del vitello in entrambi gli arti.
    Nota: mentre la misurazione della pressione sanguigna della caviglia e l'angiografia sono i metodi più comunemente utilizzati per misurare il recupero del flusso sanguigno, altri metodi possono essere utilizzati per tenere traccia del recupero degli animali, tra cui ultrasuoni Doppler, Imaging doppler laser, infrarossi termografia62, microsfera determinata perfusione63,64, tomografia computerizzata (CT) Imaging, e risonanza magnetica Imaging (MRI)65.

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Risultati

Dopo l'induzione del diabete e l'inizio della dieta di colesterolo 0,1%, il colesterolo totale per i conigli con diabete e dieta di colesterolo è stato 123,3 ± 35,1 mg/dL (n = 6 conigli maschi) media dei punti di tempo complessivi e conigli. Il livello BGL per questi conigli è stato di 248,3 ± 50,4 mg/dL (n = 6 conigli maschi). Un corso di tempo per le sostanze chimiche del sangue e i rapporti di pressione sanguigna delle gambe in un coniglio tipico è mostrato nella Figura 3

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Discussione

Abbiamo presentato un modello preclinico per indurre l'ischemia degli arti posteriori nei conigli con diabete e iperlipidemia. In molti studi, c'è ambiguità alla tecnica utilizzata per creare l'ischemia degli arti posteriori nei conigli. Nei topi, la gravità e il recupero dall'ischemia degli arti posteriori dipendono fortemente dalla posizione della legatura e della tecnica utilizzata per indurre l'ischemia. Il significato della tecnica presentata in questo lavoro è che permette l'induzione costante di ischemia che non s...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori riconoscono con gratitudine il finanziamento attraverso il dipartimento di difesa Congressionalmente diretto programma di ricerca (DOD CDMRP; W81XWH-16-1-0582) a ABB e RS. Gli autori riconoscono anche il finanziamento attraverso l'American Heart Association (17IRG33410888), il DOD CDMRP (W81XWH-16-1-0580) e gli istituti nazionali di sanità (1R21EB023551-01; 1R21EB024147-01A1; 1R01HL141761-01) ad ABB.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,9% Cloruro di sodioHenry Schein Medical1537468 / 1531434Sacca da 250 mL / 1000 mL di irrigazione btl
SiringaVWRda
Siringa da 10 mLVWRBD309695
10% FormalinaFisher-Scientific23-245684
Ago da 18 GVWR89219-294
Ago da 20 GVWR89219-340
Ago 25GVWR89219-290
Ago 27GVWR89219-288
Siringa da 5 mlVWRBD309646
5% DestrosioPatterson Veterinario07-800-9689
AcepromazinaPatterson VeterinarioVEDC207
AlfaxalonePatterson Veterinario07-891-6051
AlginatoSigma-AldrichPHR1471-1G
Alloxan monoidratoSigma-AldrichA7413
Apparecchiature per angiografiaToshibaInfinix-i
Iniettore per angiografiaMedrad
Anti-Mouse Ab Alexa 594Thermo Fisher ScientificA-11032Anticorpo secondario per IHC
Anti-Rabbit Ab Alexa 488Thermo Fisher ScientificA-11008Anticorpo secondario per IHC
a-SMA AnticorpoAbcamab5694Anticorpo primario per IHC
BaytrilBayer Animal Health724089904201Enrofloxacina
Pannello ematochimicoIDEXX2616Rabbit Panel
Bracciale per la pressione sanguignaWelchAllynFlexiport Bracciale BP monouso per neonati 7
Misuratore di pressione sanguignaTecnologia VmedVmed Vet-Dop2
BupivacainaHenry Schein Medical6023287
BuprenorfinaPatterson Veterinario42023017905
Buprenorfina SRZooPharm
Solfato di calcioCB MineraliScrub alla clorexidina USP e FCC per uso alimentare e farmaceutico
Patterson Veterinary07-888-4598
CloroformioFisher-ScientificC298-4
ColesteroloSigma-AldrichC8503
DAPIThermo Fisher Scientific62248
Catetere venoso auricolarePatterson VeterinarySR-OX165Surflo cateteri IV
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