Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

Kyle  M. Loh; Amrita Palaria; Lay Teng Ang

doi:10.3791/58975

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Articolo metodologico

Differenziazione efficiente delle cellule staminali pluripotenti umane nelle cellule del fegato

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DOI:

10.3791/58975

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11 giugno 2019

Kyle M. Loh¹^,² , Amrita Palaria¹ , Lay Teng Ang¹

¹Institute for Stem Cell Biology & Regenerative Medicine, Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute, Stanford University School of Medicine, ²Department of Developmental Biology, Stanford University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo monostrato e privo di siero-per generare in modo efficiente cellule simili a epatociti da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in 18 giorni. Ciò comporta sei passaggi in quanto gli hPSC si differenziano in sequenza in tipi di cellule intermedie come la striscia primitiva, l'endoderma definitivo, il foregut posteriore e i progenitori del germoglio epatico prima di formare cellule simili a epatociti.

Abstract

Il fegato disintossica le sostanze nocive, secerne proteine vitali ed esegue attività metaboliche chiave, sostenendo così la vita. Di conseguenza, l'insufficienza epatica, che può essere causata dall'assunzione cronica di alcol, dall'epatite, dall'avvelenamento acuto o da altri insulti, è una condizione grave che può culminare nel sanguinamento, nell'itterizia, nel coma e infine nella morte. Tuttavia, approcci per trattare l'insufficienza epatica, così come gli studi di funzione epatica e malattia, sono stati ostacolati in parte dalla mancanza di un abbondante apporto di cellule epatiche umane. A tal fine, questo protocollo descrive in dettaglio l'efficiente differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule simili agli eatociti, guidate da una roadmap di sviluppo che descrive come il destino del fegato è specificato attraverso sei fasi di differenziazione consecutive. Manipolando i percorsi di segnalazione dello sviluppo per promuovere la differenziazione del fegato e per sopprimere esplicitamente la formazione di destini cellulari indesiderati, questo metodo genera in modo efficiente popolazioni di progenitori di germogli di fegato umani e cellule simili a epatociti entro i giorni 6 e 18 della differenziazione PSC, rispettivamente. Ciò si ottiene attraverso il controllo temporale preciso dei percorsi di segnalazione dello sviluppo, esercitati da piccole molecole e fattori di crescita in un mezzo di coltura senza siero. La differenziazione in questo sistema si verifica nei monostrati e produce cellule simili a epatociti che esprimono enzimi epaticiti caratteristici e hanno la capacità di innestare un modello murino di insufficienza epatica cronica. La capacità di generare in modo efficiente un gran numero di cellule epatiche umane in vitro ha ramificazioni per il trattamento dell'insufficienza epatica, per lo screening farmacologico e per gli studi meccanicistici delle malattie epatiche.

Introduzione

Lo scopo di questo protocollo è quello di differenziare in modo efficiente le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in popolazioni arricchite di progenitori di gemme del fegato e cellule simili a epatociti². L'accesso a una fornitura pronta di progenitori epatici umani e cellule simili a epatociti accelererà gli sforzi per indagare sulla funzione epatica e sulla malattia e potrebbe consentire nuove terapie di trapianto di cellule per l'insufficienza epatica³^,⁴^, ⁵. Ciò si è dimostrato impegnativo in passato poiché gli hPSC (che includono cellule....