Articolo metodologico

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

DOI:

10.3791/59055

⸱

19 febbraio 2019

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Georgetown University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

Abstract

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Geni di virulenza batterica sono spesso regolati a livello trascrizionale da diversi fattori, che rispondono a differenti segnali ambientali. Alcuni fattori agiscono direttamente sui geni di virulenza; altri controllano patogenesi regolando l'espressione di regolatori a valle o l'accumulo di segnali che influiscono sull'attività del regolatore. Mentre il regolamento è stato studiato estesamente durante la crescita in vitro , relativamente piccolo è conosciuto circa come espressione genica è regolata durante l'infezione. Tali informazioni sono importanti quando il prodotto di un particolare gene è un candidato per l'intervento terapeutico. Trascrizionali approcci come RT-PCR quantitativa, in tempo reale e RNA-Seq sono potenti modi per esaminare l'espressione genica a livello globale, ma soffrono di molte sfide tecniche, tra cui scarsa abbondanza di RNA batterico rispetto al host RNA e campione degradazione di RNAsi. Valutazione regolamento utilizzando reporter fluorescenti è relativamente facile ed è canalizzabile con proteine fluorescenti con proprietà spettrali uniche. Il metodo consente analisi unicellulare, spazio-temporale dell'espressione genica in tessuti che presentano complessi gradienti di architettura e chimico-fisico tridimensionale che influiscono sulle reti di regolazione batteriche. Tali informazioni vengono perse quando i dati sono una media sopra la popolazione di massa. Qui, descriviamo un metodo per quantificare l'espressione genica in batteri patogeni in situ. Il metodo si basa sull'elaborazione di tessuto semplice e diretta osservazione della fluorescenza da proteine reporter. Dimostriamo l'utilità di questo sistema esaminando l'espressione di Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), prodotto del gene di cui è necessario per evasione immune e virulenza completo ex vivo e in vivo. Vi mostriamo quello nuc-gfp è fortemente espresso in Ascessi renali e rivelare espressione genica eterogenei dovuti in parte al regolamento apparente spaziale dell'attività del promotore nuc in ascessi pienamente impegnata con la risposta immunitaria. Il metodo può essere applicato a qualsiasi batterio con un sistema genetico manipolabile e qualsiasi modello di infezione, fornendo informazioni preziose per gli studi preclinici e lo sviluppo di farmaci.

Introduzione

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Batteri di rispondere alle mutevoli condizioni fisiologiche e alterazioni dello stato nutrizionale del loro ambiente esprimendo differenzialmente geni richiesti per la sopravvivenza e di adattamento. Per esempio, agenti patogeni opportunistici colonizzano corpo superfici a relativamente basso densità e spesso sono innocui. Tuttavia, una volta che il batterio ha penetrato le barriere fisiche e chimiche, esso deve vedersela con contro-difese ospite delle cellule immuni e limitata disponibilità nutriente1. Ad esempio, lo Staphylococcus aureus colonizza circa un terzo della popolazione senza sintomi ma è anche la causa della devastante della pelle e infezioni dei tessuti molli, osteomielite, endocardite e bacteremia2. Il successo di S. aureus come agente patogeno è spesso attribuito a sua flessibilità metabolica, nonché un arsenale di fattori di virulenza secrete e superficie-collegati che permettono il batterio sfuggire il flusso sanguigno e replicare nei tessuti periferici 3,4,5. Perché la morte di host a causa di malattia stafilococcica è un vicolo cieco dell'evoluzione e la trasmissione di limiti al nuovo host6, l'impegno per la produzione di fattore di virulenza deve essere controllato attentamente.

Una rete complessa regolamentazione di proteine e non-codificazione RNAs risponde ad una varietà di stimoli ambientali, tra cui cellulare densità, fase di crescita, fattori neutrofilo-collegati e disponibilità di nutrienti, per garantire che i geni di virulenza sono espresse alla tempo preciso e la posizione all'interno di host tessuti7,8,9,10,11,12,13. Per esempio, il sistema a due componenti SaeR/S (TCS) regola l'espressione di numerosi fattori di virulenza attraverso la chinasi di sensore (SaeS) e la risposta regolatore (SaeR)14. SaeS è autophosphorylated su un residuo di istidina conservata in risposta a host segnali (ad es., umana del neutrofilo peptidi [HNPs], calprotectina)8,15,16. Il gruppo fosforile viene poi trasferito ad un residuo di aspartato su SaeR, attivarlo come una proteina legante il DNA (SaeR ~ P)17. Il TCS SaeR/S regola oltre 20 geni che contribuiscono alla patogenesi tra cui proteine leganti di fibronectina (FnBPs), leukocidins e coagulasi14,18,19,20. Gli obiettivi possono essere classificati in ad alta affinità e bassa affinità geni bersaglio, che sono probabilmente indotta come il livello di SaeR ~ P aumenta quando esposti a suoi spunti21. L'attività di SaeR/S è controllata da altri regolatori dell'espressione genica, come ad esempio il sistema di rilevamento del quorum di Agr, repressore della proteina di tossine (Rot) e il fattore sigma alternativo B (SigB)22,23,24.

NUC è un gene di virulenza Sae-dipendente in stafilococco aureo e codifica thermonuclease (Nuc), che è essenziale per fuggire da neutrophilic einases traps (reti) e per diffusione durante il corso di infezione25,26. L'espressione di nuc è anche fortemente indirettamente repressa da CodY in presenza di aminoacidi a catena ramificata e GTP27e direttamente represso dalla proteina stafilococcica accessorio regolatore SarA28,29 , cui l'attività è influenzata da ossigeno (stato redox) e pH30. Dato che sae e nuc mutanti vengono attenuati in modelli murini di infezione, c'è interesse a sviluppare interventi chimici che inibiscono la loro corrispondente attività26,31. Nonostante questo, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda la loro regolazione durante l'infezione.

Reporter fluorescenti sono stati utilizzati per monitorare e quantificare l'espressione genica a livello di singola cellula. Qui, presentiamo un metodo per quantificare S. espressione genica aureus durante l'infezione che, quando accoppiato con l'analisi del trascrittoma in vitro e potenti tecniche di imaging come la risonanza magnetica (MRI) e la spettroscopia a risonanza magnetica (MRS), può rivelare come batterica fisiologia è regolata in vivo e l'abbondanza relativa delle sostanze nutrienti in alcune nicchie. Il metodo può essere applicato a qualsiasi agente patogeno batterico con un sistema genetico trattabile.

Panoramica del vettore integrativo del genoma.

PRB4 di vettore integrativo il genoma contiene 500 accoppiamenti bassi dalle regioni a Monte e a valle del pseudogene di S. aureus USA300 SAUSA300_0087 per facilitare la ricombinazione omologa. pRB4 è derivato dalla spina dorsale di vettore termosensibile pMAD contenente la cassetta di resistenza all'eritromicina (ermC) e beta-galattosidasi termostabile gene bgaB per lo screening blu/bianco di ricombinanti32. La costruzione del reporter ingegnerizzati contiene anche un indicatore di resistenza di cloramfenicolo (cat) per la selezione dopo l'integrazione del genoma ed eliminazione di plasmide, nonché siti EcoRI e SmaI di fondere la regione regolatrice di interesse al verde superfolder proteina fluorescente (sGFP) (Figura 1). È noto che la scelta del sito di legame del ribosoma (RBS) influenza l'attività del reporter e spesso richiede ottimizzazione empirica33. Così, un RBS non è fornito. Qui, il sito di legame del ribosoma nativo viene utilizzato per fornire per un modello più naturale di espressione genica, ma altri siti possono essere utilizzati.

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Protocollo

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Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università di Georgetown.

1. generazione del ceppo Reporter fluorescente

  1. Digerire il vettore di pRB4 integrativa del genoma in sequenza con enzimi di restrizione EcoRI e SmaI. Seguendo il protocollo del produttore, impostare una digestione durante la notte con SmaI utilizzando 1 µ g di pRB4 a 25 ° C e quindi procedere con la seconda digestione per 1h a 37 ° C con l'aggiunta di EcoRI alla miscela di reazione. Inattivare gli enzimi incubando a 65 ° C per 20 min.
  2. PCR amplificano la regione regolatrice di interesse dal DNA genomico (in questo caso, un coppia di basi ~ 350 frammento di DNA contenente la regione del promotore thermonuclease [nuc]), che incorpora un sito di restrizione EcoRI 5' e un sito di restrizione SmaI 3'. La sequenza di riconoscimento SmaI deve essere in-frame con il codone di inizio traslazionale. In questo studio, la PCR è stata effettuata utilizzando una polimerasi del DNA ad alta fedeltà secondo le raccomandazioni del produttore con forward primer oRB015 (5'-atcattgaattctccaaagtaaattataagttatac-3') e reverse primer oRB016 ( 5'-gggcataactaacacctctttctttttag-3'). La temperatura di annealing era 53 ° C. Purificare il frammento risultante utilizzando un kit di pulizia PCR seguendo le istruzioni del produttore.
  3. Digerire il prodotto PCR risultante con EcoRI e SmaI interpretato nel passaggio 1.1 e legare il frammento di DNA digerito agli stessi siti di pRB4 utilizzando la ligasi del DNA T4 come consigliato dal produttore per generare il costrutto integrativo. Introdurre la miscela di legatura in Escherichia coli e confermare la sequenza di costrutto.
  4. Electroporate il costrutto in ceppo S. aureus RN4220 come descritto in precedenza34. In breve, utilizzare 1 µ g del plasmide con 70 µ l di cellule electro-competenti (Ω 100, 25 µF e 2,3 kV) in brodo di B2 (1% [p/v] idrolizzato di caseina, Estratto di lievito 2,5% [p/v], 2,5% [p/v] NaCl, 0,1% [p/v] K2PO4, 0,5% [p/v] glucosio). Selezionare per resistenza all'eritromicina (Emr) alla temperatura permissiva (30 ° C) su agar soia triptico (TSA) completati con eritromicina (5 µ g mL-1) e 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside (X-Gal; 80 µ g mL-1). La risultante trasformanti sono blu a causa di attività della β-galattosidasi plasmide-codificati.
    Nota: Trasferimento di DNA in isolati clinici è estremamente difficile a causa di una forte restrizione-modificazione barriera35. Così, RN4220 di S. aureus è stato utilizzato come un destinatario intermedio del costrutto fusione perché è restrizione carenti e altamente trasformabile.
  5. Trasferimento del plasmide in S. aureus USA300 ceppo di interesse usando elettroporazione o trasduzione dei fagi-mediata36 alla temperatura permissiva. In breve, propagare batteriofago di11 Φ particelle sul ceppo donatore utilizzando piastre TSA contenenti 5 mM CaCl2 pernottamento a 30 ° C e quindi sterilizzare mediante filtrazione attraverso un filtro di siringa di 0,45 µM di acetato di cellulosa. Utilizzare lisati di trasdurre S. aureus ceppo LAC a Emr.
    Nota: LAC è un ampiamente usato isolato clinico è stato effettuato in precedenza Em sensibili dal passaggio seriale nel mezzo di TSB per curare il ceppo del pUSA03 di nativo plasmide che conferisce Emr 37,38.
  6. Consente di integrare il cromosoma come descritto in precedenza32il costrutto da due, eventi di ricombinazione omologa successivi. I ricombinanti sono cloramfenicolo-resistenti (Cmr) sulle piastre TSA contenente 5 μg mL-1 di cloramfenicolo, eritromicina-sensibili (Erms) e non più blu.
    Nota: Quando possibile, reintrodurre la fusione contrassegnata in USA300 tramite trasduzione mediata dei fagi per evitare l'accumulo di mutazioni associate a ceppo in vitro passaggio39 e temperatura turni.

2. animale infezione: Preparazione del inoculo, infezione sistemica e processazione dei tessuti

  1. Preparazione dell'inoculo batterico
    1. Striscia di ceppi di Staphylococcus aureus di interesse per l'isolamento su piastre di agar sangue da uno stock di glicerolo congelati. Incubare a 37 ° C per 16 – 24 ore confermare emolitici fenotipi basati sulla loro capacità di lisare cellule di anima rosse (RBCs) e forma trasparente zone libere.
    2. Avviare una notte culture inoculando singole colonie di ogni ceppo a 4 mL di brodo di soia triptico (TSB) in tubi di vetro sterile. Ruotare le provette a 37 ° C per 16 – 24 h in un tubo rullo fissato a circa un angolo di 70° e 70 giri al minuto [RPM].
    3. Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) delle culture dal punto 2.1.2. Utilizzare mezzo sterile come un riferimento ottico (vuoto). Diluire queste cellule a un OD600 di 0.05 in 25 mL di sterile Tryptic Soy brodo (TSB) in separato, 125 mL DeLong boccette (5:1 boccetta in rapporto al volume) e incubare le colture in un bagno d'acqua (per trasferimento di calore adeguata alle culture), agitazione a 280 giri/min e impostare a 37 ° C.
      Nota: La crescita dell'inoculo può essere eseguita in vari modi; viene presentato un metodo per la coltivazione di cellule in fase esponenziale. Indipendentemente da ciò, è importante utilizzare sempre lo stesso metodo per preparare le celle per inoculazione.
    4. A un OD600 ~ 1, ri-diluire le cellule in mezzo fresco per una partenza OD600 di 0.05 affinché le cellule raggiungere fase esponenziale e che i fattori che si accumulano durante l'incubazione overnight sono state ridotte a livelli di fase esponenziale.
    5. Raccogliere le cellule durante la fase esponenziale (OD600 ~0.6–0.8) mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min a temperatura ambiente.
    6. Lavare il pellet due volte in volume equivalente di sterile 1x tampone fosfato salino (PBS; pH 7.4).
    7. Sospendere le cellule in 1X PBS (pH 7.4) ad una concentrazione di 1 x 108 Colonia formando unità (CFUs) mL-1 o più appropriata per il desiderato sperimentare.
      Nota: è importante determinare la relazione tra OD600 e CFU mL-1 per ogni ceppo di interesse perché ceppo-dipendente alterazioni di forma e dimensioni delle cellule possono influire sulle proprietà di dispersione della luce e, in definitiva, il dose di infezione.
  2. Preparazione degli animali e delle infezioni batteriche
    1. Acclimatare topi per 7 giorni dieta purificata AIN-93. La dieta è formulata per fornire una nutrizione adeguata, riducendo tessuto auto-fluorescenza associato al consumo di ingredienti vegetali utilizzati in mouse standard chow40.
      Nota: I topi C57/BL6 femminili (6-8 settimane) sono usati qui, ma il topo e il sesso dipenderà lo studio.
    2. Prima dell'infezione, si dilatano le vene di coda di topo con acqua tiepida.
    3. Infettare animali iniettare 100 µ l dell'inoculo batterico tramite coda-vene per produrre un'infezione sistemica. Salvare un'aliquota dell'inoculo iniziale se eseguendo la citometria a flusso (Vedi sezione 4).
    4. Monitorare gli animali ogni giorno e valutare il loro stato di salute utilizzando un sistema di monitoraggio ha esaminato e approvato dai propri istituzionali Animal Care e Comitato di uso.
    5. Permettere che l'infezione al progresso per la durata desiderata. Qui, gli esperimenti sono terminati 3 giorni dopo l'infezione.
      Nota: In queste condizioni, gli ascessi consistono di una comunità di ascesso stafilococcico di batteri, racchiuso da depositi di fibrina e circondato da strati concentrici di cellule immuni5,41.
  3. Raccolta dei organi e processazione dei tessuti
    1. Gli animali da inalazione di CO2 e dislocazione cervicale come metodo secondario di eutanasia ed eseguire l'autopsia.
    2. Raccolta rene (a destra) e altri organi vitali (cuore, fegato, polmoni, milza) e trasferire in provette di polipropilene di 15 mL contenente formalina al 10% [v/v] tamponata. Procedere con questi organi a passo 2.3.4 qui sotto.
    3. Trasferire il rene di sinistra ad un tubo resistente agli urti sterile 2 mL contenente ~ 500 µ l di 2 mm silice perline e sterile 1 x di 1 mL di PBS (pH 7.4). Procedere con questo organo al punto 4.2.
    4. Consentire gli organi dal punto 2.3.2 per fissare al buio a temperatura ambiente con agitazione delicata o rotazione per almeno 24 ore ma non più di 48 ore.
    5. Incorporare gli organi in tessuto chiaro medio di congelamento e memorizzare i tessuti a-80 ° C.
    6. Utilizzando un criostato, sezione tessuto in fette dello spessore di 10 µm.
    7. Asciugare le sezioni su una lastra di vetro pre-pulito, carica per 20 min nel buio, applicare liquido di montaggio rigido con 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) macchia e coprire con vetrino coprioggetto. Curare le diapositive montate a temperatura ambiente durante la notte e trasferimento a 4 ° C per la conservazione a lungo termine.

3. microscopia confocale a scansione ed elaborazione di immagini del laser

  1. Esaminare diapositive montate per individuare lesioni mediante laser appropriato per il reporter fluorescente utilizzato. In questo caso, il verde (GFP), rosso (tdTomato) e fluorescenza blu (DAPI) segnali vengono utilizzati.
  2. Acquisire l'immagine utilizzando l'obiettivo appropriato per la visualizzazione di singole celle (ad esempio, in genere x 20 o 40 x obiettivi vengono utilizzati).
  3. Misurare l'intensità di fluorescenza nelle immagini confocale.
    1. Aprire l'immagine confocale in immagine J e regolare la luminosità/contrasto per visualizzare correttamente il segnale di fluorescenza della lesione.
    2. Definire l'area di interesse e utilizzando l'opzione soglia , impostare i limiti inferiori e superiori di fluorescenza come necessario.
    3. Definire il centroide selezionando Area → valore grigio medio → centroide → limitare alla soglia sotto la scheda analizza di J. immagine
    4. Estrarre il valore di intensità di fluorescenza centroide o misurare l'intensità media di fluorescenza in una lesione determinata per unità di superficie (intensità media di fluorescenza, MFI) per GFP e tdTomato. Qui, le zone di one µm2 sono state usate.
      Nota: Una seconda analisi accecata minimizza bias quando è nota l'identità del campione.
    5. Tracciare i dati ed eseguire analisi statistiche appropriate per ogni confronto.

4. analisi di citometria a flusso di

  1. (Opzionale) Determinare l'attività di fusione dell'inoculo il giorno dell'infezione (dalla sezione 2.2.3)
    1. A 899 µ l di 1X PBS sterile (pH 7.4) aggiungere 100 µ l di ciascun inoculo e 1 µ l di acido nucleico permeante membrana macchia (Vedi Tabella materiali). Come controllo, assicurarsi di includere un campione privo di acido nucleico macchia.
    2. Eseguire citometria a flusso su tutti i campioni.
      Nota: Per il primo esperimento, è utile includere un controllo unico vettore per la fusione di interesse per determinare la tensione corretta da utilizzare. Una netta separazione tra i campioni positivi e negativi è essenziale per l'analisi dei dati, che indica il reporter è ben di sopra di segnale di fondo.
    3. Per identificare la popolazione batterica, tracciare gli eventi usando acido nucleico macchia (asse y) e forward scatter (asse x).
    4. Disegnare un cancello di inclusione nei dintorni di eventi che sono entrambi acido nucleico macchia positiva e la dimensione corretta del batterio basato sul forward scatter (tra 0,5 a 2,0 µm per S. aureus).
      Nota: Essere rigorosi nell'identificazione di questa popolazione come è fondamentale per includere gli eventi che sono chiaramente all'interno di questi parametri. Essere sicuri di che questo cancello esclude tutti gli eventi per i controlli negativi in altre condizioni. In questo studio, circa il 70% la popolazione delle cellule ha incontrato questi requisiti nell'analisi.
  2. Analisi dei campioni di tessuto dopo sacrificio:
    1. Eutanasia degli animali, raccogliere i reni di sinistro (Vedi punto 2.3) e trasferimento nel tallone-pestaggio tubi contenenti 1 mL di 1X PBS sterile (pH 7,4) e 250 µ l di perle di borosilicato di 2 mm.
    2. Interferire con tessuti per rilasciare cellule batteriche. Per i reni, è necessario utilizzare un omogeneizzatore per distruggere le cellule. Qui, tre 30 s scoppia a 6800 giri con 1 min periodi su ghiaccio bagnato tra i cicli di raffreddamento sono stati utilizzati per ridurre al minimo il riscaldamento campioni.
    3. Pellet i detriti più grandi di tessuto mediante centrifugazione a 250 x g per 3 min in una microcentrifuga da tavolo raffreddato a 4 ° C.
      Nota: In genere, c'è un pellet cellulare nella parte inferiore del tubo e uno strato di detriti galleggianti in alto a sinistra. Lo strato acquoso centrale contiene le cellule batteriche.
    4. Trasferire 10 µ l dello strato acquoso in una microcentrifuga pulito 1,5 mL contenente 1 µ l di acido nucleico macchia nel 989 µ l di PBS (volume totale 1 mL).
    5. Eseguire la citometria di flusso utilizzando gli stessi parametri di acquisizione dati e gating per quanto riguarda l'inoculo iniziale.
      Nota: I conteggi delle cellule batteriche sarà molto bassi perché il campione contiene principalmente i detriti del tessuto. L'opzione "Live gate" è utilizzabile anche se le cellule sono acido nucleico macchia positiva e dimensione-gated quando i dati vengono caricati nell'applicazione. Questo aiuterà anche per analizzare più degli eventi desiderati e ridurre la dimensione del file. Eventi quasi 1 milione per campione sono contati, ma ulteriori conteggi di evento possono essere necessari a seconda della gravità dell'infezione e la dimensione del tessuto analizzato.
    6. Analisi dei dati: Determinare media intensità di fluorescenza (MFI) per ogni fluoroforo in un dato campione utilizzando le porte di inclusione determinate al punto 4.1.4. Normalizzare i campioni nel software di analisi di flusso per i conteggi di evento. 10.000 conteggi sono solitamente sufficienti nell'analisi.
      Nota: Non è raro trovare esempi che contengono meno di questo numero di eventi, poiché questo dipende dalla gravità di infezione e di formazione di ascesso. Utilizzando questo approccio, 500-40.000 eventi si trovano tipicamente in tessuto infetto.

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Risultati

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Abbiamo sviluppato un plasmide derivato da pMAD32 in grado di fornire qualsiasi giornalista fusione costrutto nel cromosoma di ricombinazione omologa doppio crossover (Figura 1). Questo costrutto consente analisi quantitativa di qualsiasi regione regolatrice che sostiene la produzione di proteina GFP e segnale fluorescente sopra priorità bassa. Il plasmide conferisce resistenza all'ampicillina (Apr) per la manutenzione e la ...

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Discussione

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Malattie infettive batteriche sono un crescente problema di salute in tutto il mondo grazie all'acquisizione di determinanti di resistenza agli antibiotici46. Perché adattamento ad ambienti host è essenziale per la crescita e la sopravvivenza durante l'infezione, strategie basati su programmi di espressione genica che aumentano la forma fisica agente patogeno possono risultare utile terapeuticamente. Uno di questi programmi è l'insieme dei geni controllati dal sistema bicomponente SaeR/S (TCS), mo...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

Ringraziamenti

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Ringraziamo Alexander Horswill per il dono della fusione di PsarAP1- tdTomato e Karen Creswell per aiuto con l'analisi di citometria a flusso. Ringraziamo anche Alyssa King per consigli sull'analisi statistica. Questo lavoro è stato finanziato in parte da un premio di ricerca esplorativi/Developmental NIH (grant AI123708) e fondi di avvio facoltà di SRB. I finanziatori non avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, raccolta dei dati e interpretazione o la decisione di presentare il lavoro per la pubblicazione.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
5% sangue di pecoraHardy Diagnostics (Santa Maria, CA)A10
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galattopiranoside (X-Gal)ThermoScientificR0402
AmpicillinaFisher ScientificBP1760-25
C57Bl/6 TopiCharles RiverNA
CloramfenicoloSigma-AldrichC-0378
microscopio a scansione laser confocaleZeissNA
criostato microtomoThermo ScientificNA
Culture, CapVWR International2005-02512
D+2:25NA OligoIntegrated DNA Technologies (Coralville, Iowa)NA
DNA LigasiNew England BiolabsM0202S
EritromicinaSigma-AldrichE5389
Analizzatore di flussoBecton DickinsonNA
perle di vetroSigmaZ273627
Miniprep, plasmidePromegaA1220
agitazione orbitale bagno d'acquaBrunswick InnovaNA
Purificazione PCRQIagen28106
Soluzione salina tampone fosfato (PBS)Cellgrow46-013-CM
Lettore di piastreTecanNA
Precellys 24 omogeneizzatoreBertin LaboratoriesNA
pUC57-KanGenScript (Piscataway, NJ)NA
Q5 Taq DNA polimerasiNew England Biolabs (Ipswich, MA)M0491S
Enzimi di restrizioneNuovo Inghilterra Biolabs (Ipswich, MA)R0150S (PvuI), R3136S (BamHI), R0144S (BglII), R3131S (NheI), R0101S (EcoRI), R0141S (SmaI).
Trascrittasi inversaNew England BioLabsE6300L
Sanger SequencingGenewiz (Germantown, MD)NA
Sub Xero terreno di congelamento dei tessuti trasparentiMercedes MedicalMER5000
Superfrost Plus vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
superloopGE Lifesciences18111382
Siringa, filtroVWR International28145-481
Syto 40Thermo Fisher ScientificS11351Colorazione di acido nucleico permeabile
a membrana TetraciclinaSigma-AldrichT7660
Brodo di soia tripticoVWR90000-376
Spettrofotometro UV-visibileBeckman Coulter-DU350NA
Mezzo di montaggio Vectashield Antifade con DAPIVector LaboratoriesH-1500
New

Riferimenti

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