Articolo metodologico

Misurazione altamente sensibile della permeabilità glomerare nei topi con Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

DOI:

10.3791/59064

⸱

9 agosto 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Medical Faculty, Heinrich-Heine-University

In questo articolo

Sommario

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Qui, presentiamo un protocollo per testare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando un tracciante altamente sensibile e non radioattivo. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina.

Abstract

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La perdita di albumina nelle urine (albuminuria) predice l'esito cardiovascolare. In condizioni fisiologiche, piccole quantità di albumina vengono filtrate dal glomerulus e riassorbite nel sistema tubolare fino al raggiungimento del limite di assorbimento. I primi aumenti nella filtrazione dell'albumina patologica possono, quindi, essere persi analizzando l'albuminuria. Pertanto, l'uso di traccianti per testare la permselettività glomerare appare vantaggioso. Fluorescentemente etichettato tracer fluoresceinisociocionanato (FITC)-polisucrosi (cioè FITC-Ficoll), può essere utilizzato per studiare la permselettività glomerare. Le molecole di fitC-polisucrosi vengono liberamente filtrate dal glomerulus ma non riassorbite nel sistema tubolare. Nei topi e nei ratti, la polisucrosi FITC è stata studiata in modelli di permeabilità glomerare utilizzando procedure tecnicamente complesse (ad esempio, misurazioni radioattive, cromatografia liquida ad alte prestazioni [HPLC], filtrazione del gel). Abbiamo modificato e facilitato un protocollo basato su tracciante FITC-polysucrosi per testare precoce e piccoli aumenti della permeabilità glomerare al polidiagnosi DI FITC 70 (dimensioni dell'albumina) nei topi. Questo metodo consente analisi ripetitive delle urine con piccoli volumi di urina (5 o L). Questo protocollo contiene informazioni su come il tracciante FITC-polysucrose 70 viene applicato per via endovenosa e l'urina viene raccolta attraverso un semplice catetere urinario. L'urina viene analizzata tramite un lettore di piastra di fluorescenza e normalizzata in un marcatore di concentrazione delle urine (creatinina), evitando così procedure tecnicamente complesse.

Introduzione

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I difetti funzionali o strutturali all'interno della barriera di filtrazione glomeulare aumentano la permeabilità glomerare all'albumina, con conseguente individuazione dell'albumina nelle urine (albuminuria). Albuminuria predice l'esito cardiovascolare ed è un marcatore importante per lesioni glomeriule1. Anche bassi livelli di albuminuria, che si trovano all'interno della gamma normale, sono associati ad un aumento del rischio cardiovascolare1.

In condizioni fisiologiche, l'albumina viene filtrata attraverso il glomerulus ed è quasi completamente riassorbita nel sistema tubolare2,3. Nei topi, il rilevamento dell'albumina nelle urine è di solito eseguita da un saggio immunosorbent legato agli enzimi (ELISA) da 24 h di raccolta delle urine. Se si usa l'urina di una raccolta di urina di 24 ore o di un'urina spot, piccole differenze nelle concentrazioni di albumine possono essere perse a causa di problemi di sensibilità all'analisi. La maggior parte dei ricercatori, quindi, utilizza modelli animali in cui l'albuminuria è indotta da robuste lesioni renali a causa di tossine, farmaci e chirurgia renale.

Pertanto, la scoperta di un metodo sensibile per rilevare piccoli e transitori cambiamenti nella permeabilità glomerare è molto importante per il campo. Rippe et al. hanno presentato un modello di ratto per testare la permeabilità glomerare applicando un tracciante fluorescente, vale a dire FITC-polysucrose 70 (cioè FITC-Ficoll 70), con le dimensioni dell'albumina4. L'applicazione tracer consente di testare le modifiche a breve termine nella permeabilità glomerare (in pochi minuti) ed è molto sensibile4. Due studi hanno utilizzato il metodo del tracciante nei topi5,6. Nonostante i suoi benefici, questo metodo, purtroppo, ha svantaggi: è tecnicamente molto complesso, radioattivo e invasivo. Ulteriori analisi delle urine viene effettuata solo utilizzando la filtrazione in gel o l'esclusione delle dimensioni HPLC5,6.

All'interno di questo documento, presentiamo un metodo alternativo, sensibile, non radioattivo e veloce per misurare la permeabilità glomerare nei topi utilizzando fluorescentmente etichettato FITC-polysucrose 70. Con l'introduzione di un catetere transuretrale, la raccolta delle urine è meno invasiva della puntura della vescica, dell'uretrotomia e dell'applicazione del catetere soprapubico e consente la raccolta delle urine almeno ogni 30 min. lettore di piastre fluorescenti. Le concentrazioni di traccianti nelle urine sono normalizzate alle concentrazioni di creatinina nelle urine utilizzando un saggio di creatinina enzimatico.

Pertanto, questo nuovo metodo offre uno strumento sensibile per studiare le lesioni più precoci glomerari con una maggiore permeabilità glomerare.

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Protocollo

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Le indagini sono state condotte secondo le linee guida delineate nella Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio (US National Institutes of Health Publication No. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati effettuati in conformità con le pertinenti approvazioni istituzionali (governo statale Landesamt f'r Natur, Umwelt und Verbraucherschutz [LANUV] numero di riferimento 84-02.04.2012.A397).

1. Preparazione di strumenti, soluzioni e attrezzature

  1. Ricostituire il cloruro di sodio sterile (NaCl) allo 0,9% di cloruro di sodio sterile (NaCl) a una concentrazione finale di 10 mg/mL (cioè 100 mg in 10 mL di NaCl).
  2. Diallyze soluzione FITC-polysucrosi 70 per rimuovere le molecole FITC gratuite durante la notte a 4 gradi centigradi (taglio del peso molecolare [MWCO] a 10.000). Utilizzare 1 L dello 0,9% di NaCl sterile per 10 mL di FITC-polysucrose 70 in costante agitazione. Proteggere dalla luce. Aliquota la dialisce FITC-polysucrose 70 e conservarla a -20 gradi centigradi.
  3. Per il FITC-polisucrose 70 bolus, aggiungere la soluzione 4 -L L di 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 a 996 - L dello 0,9% NaCl (la concentrazione finale di FITC-polisucrosi 70: 40 g/mL).
  4. Per la soluzione di infusione equilibrata, aggiungere 20 -L di una soluzione da 10 mg/mL FITC-polysucrose 70 a 9,98 mL dello 0,9% sterile NaCl, con una concentrazione finale di 20g/mL.
  5. Per la soluzione sperimentale, aggiungere farmaci o sostanze alla soluzione di infusione (ad esempio, per l'angiotensina II [Ang II] [100 ng/kg/min] per un topo da 25 g, aggiungere 3 L di Ang II di una soluzione da 1 mM).
  6. Per l'intervento, preparare un rasoio, due morsetti chirurgici, un paio di forbici chirurgiche, due pinzette, due pinzette sottili, un paio di forbici fini e tamponi. Preparare due fili di seta da 10 cm (da 4-0 a 6-0) per le procedure di ligazione.
  7. Per il posizionamento di un catetere venoso centrale, preparare una siringa da 10 mL con un ago da 21 G. Posizionare la punta dell'ago in un catetere lungo 30 cm (con un diametro interno [ID] di 0,58 mm). Collegare il catetere da 0,58 mm a un catetere di 10 cm (con ID di 0,28 mm). Tagliare la punta del catetere più piccolo obliquo per creare una punta affilata che viene introdotta nella vena giugulare.
  8. Preparare l'anestesia (ad esempio, anestesia intraperitoneale ketamina, 100 mg/kg di peso corporeo e xilazina, 5 mg/kg di peso corporeo).
  9. Preparare un angiocate da 22 G scartando l'ago e segnando il catetere di 1 cm dalla punta. Preriscaldare la piastra di riscaldamento a 37 gradi centigradi.
  10. Preparare un dispositivo di pressione sanguigna e cambiare la membrana di misurazione della pressione sanguigna, se necessario.

2. Fase di preparazione

  1. Catetere urinario
    NOTA: La sezione 2.1 segue il protocollo descritto da Reis etal. Figura 1 e Figura supplementare 1 Mostra il posizionamento di un catetere urinario nei topi femminili.
    1. Anestesizzare il topo con ketamina/xylazina (vedere il punto 1.8). Utilizzare il test del pizzico di dita dei immi per confermare l'anestesia corretta. Per mantenere l'anestesia, ripetere l'anestesia (ad esempio, con la metà del dosaggio) dopo 60 min. L'anestesia corretta è confermata se il test del pizzico della dita non si traducono in ritiro riflesso.
      NOTA: in questo protocollo vengono utilizzati mouse FVB femminili.
    2. Posizionare il mouse in recumbency dorsale su un pad di riscaldamento a 37 gradi centigradi. Stringere l'addome inferiore e trovare l'ostium uretrale (ad esempio, al microscopio).
    3. Utilizzare la parte plastica del catetere di un angiocater da 22 G e lubrificarla con gel xilocaina. Introdurlo con attenzione 3 mm nell'ostio uretrale parallelamente all'asse uretrale distale (Figura 1A).
    4. Ruotare la parte superiore dell'angiocatere di 180 gradi mantenendo la punta all'interno dell'ostio uretrale e mantenendo l'asse dell'uretra (Figura 1B).
    5. Introdurre il catetere 7 mm più avanti nel mouse in modo che sia posizionato all'interno della vescica (Figura 1C). Non forzare il catetere oltre la resistenza. Correggere la posizione del catetere fin dall'inizio se si avverte resistenza. Prendere nota che se la posizione del catetere urinario è corretta, l'urina potrebbe già apparire all'interno del catetere.
    6. Posizionare un tubo marrone di 1,5 ml sopra la parte superiore dell'angiocater per raccogliere l'urina. Applicare 1 mL di 0,9% NaCl sottocutaneamente per migliorare la produzione di urina.
  2. Catetere venoso centrale
    1. Rasare il collo del mouse e posizionarlo in recumbency con la testa verso il chirurgo. Hyperestendere la testa del mouse con un nastro.
    2. Disinfettare il collo con il 70% di isopropanolo. Fare una piccola incisione cutanea (5 mm) sotto la mascella, utilizzando una pinzetta e un paio di forbici. Tagliare la pelle di circa 1 cm nella direzione dello sterno fino a raggiungere il centro dello sterno.
    3. Sezionare attentamente la pelle sul lato destro del collo, utilizzando un paio di forbici. Fare un'incisione rettangolare della pelle sul lato destro del mouse per esporre il tessuto molle del collo. Usa un paio di forbici e una pinzetta. Fissare i lembi della pelle con due morsetti.
      NOTA: La vena giugulare corre lungo il lato sinistro della ghiandola tiroidea o è leggermente coperta dal lobo destro della ghiandola tiroidea. Dopo questo passaggio, utilizzare un microscopio per l'intervento chirurgico.
    4. Esporre con attenzione la vena giugulare mediante preparazione smussata, utilizzando la punta della pinzetta fine. Evitare lesioni arami di vena.
      NOTA: Potrebbe essere necessario rimuovere i tessuti con forbici fini. Fare attenzione quando si utilizzano le forbici per rimuovere il tessuto in quanto aumenta il rischio di sanguinamento.
    5. Posizionare e chiudere una legatura con un filo di seta (da 4-0 a 6-0) nella parte distale della vena giugulare visibile (verso la testa del topo). Mettere la tensione sulla legatura fissando il filo di seta con un nastro adesivo per garantire una leggera tensione sulla vena giugulare. Preparare una legatura intorno alla parte prossimale della vena giugulare.
    6. Riempire il catetere con la soluzione di infusione di conquistimento (vedere il punto 1.4) e fissare il catetere con un nastro in modo che il catetere sia allineante la vena giugulare. Controllo delle bolle per evitare l'embolia dell'aria.
    7. Sollevare la vena giugulare con pinzette sottili sul sito di inserimento (il sito di inserimento è 1–2 mm proximal della legatura). Allineare il tubo parallelo alla vena giugulare. Forare la vena giugulare, puntando al lume, e inserire per circa 2-4 mm, parallelamente all'asse della vena giugulare. Evitare movimenti vivaci.
    8. Chiudere la legatura per fissare il catetere. Controllo della tenuta della legatura esaminando attentamente il microscopio. Mettere un tampb umido sul sito di chirurgia.
  3. Misurazione della pressione sanguigna
    1. Posizionare il polsino di coda nella parte inferiore della coda del mouse mentre il mouse giace in recumbency dorsale. Avviare le misurazioni e ripeterle 10 volte per punto temporale. Costruire una media dalle misurazioni.
    2. Regolare la posizione del polsino della coda se le misurazioni della pressione sanguigna non sembrano corrette e vengono prodotti dati falsi.

3. Fase di equilibratore

  1. Cambiare il tubo di raccolta urinaria prima dell'inizio della fase di equilibratura e posizionarlo sul ghiaccio.
  2. Introdurre una siringa da 10 mL riempita con soluzione di fase di equilibraton FITC (vedi punto 1.4) con un ago da 21 G e il catetere più grande (con un ID di 0,58 mm) e posizionarlo nella pompa della siringa.
  3. Piegare un tampone e metterlo intorno al catetere della piccola nave (con id di 0,28 mm) che viene introdotto nella vena giugulare. Posare il catetere all'interno del tampone. Mettere un morsetto sopra il tampone per abolire il flusso sanguigno retrogrado o l'embolia dell'aria. Collegare un ago da 27 G con una siringa da 1 mL riempita con il bolo FITC fino alla fine del catetere a piccola nave.
  4. Aprire il morsetto e applicare il bolus FITC (100 l). Chiudere nuovamente il morsetto e collegare il catetere più grande con il catetere più piccolo. Avviare la pompa della siringa con 0,008 mL/min (0,480 mL/h). Continuare l'infusione per 60 min.

4. Fase sperimentale

NOTA: In questa fase, l'effetto dei farmaci sulla permselettività glomerare può essere studiato.

  1. Cambiare il tubo urinario (punto temporale 0 min) ad un altro tubo marrone da 1,5 ml. Mettere un tampone intorno al catetere della piccola nave e chiudere un morsetto come indicato al punto 3.3.
  2. Scollegare il catetere grande dal catetere della piccola nave. Modificare le siringhe per le soluzioni di fase sperimentale (vedere il passaggio 1.5). Lasciare correre la pompa di infusione in modo che il grande catetere sia riempito con la soluzione equilibration.
  3. Ricollegare i cateteri evitando l'embolia dell'aria e riaprire il morsetto. Avviare la pompa della siringa a 0,008 mL/min.
  4. Continuare a far funzionare la pompa della siringa per 60 min e raccogliere l'urina all'interno del tubo urinario in seguito (urina 60 min). Posizionare il tubo delle urine sul ghiaccio.
  5. Sacrificare il topo dalla lussazione cervicale durante l'anestesia. Prima dello smaltimento il topo viene osservato per 5 minuti per assicurarsi che sia morto.

5. Analisi dell'urina

  1. Misurazione della fluorescenza
    1. Scongelare la piscina urinaria e diluirla 1:10 con salina tampone fosfato (PBS).
      NOTA: La piscina urinaria è una pozza di urina che è stata raccolta da topi sani in una raccolta di urina 12-24 h in una gabbia metabolica.
    2. Preparare gli standard per la misurazione della fluorescenza. Prendete 10 tubi marroni da 1,5 mL ed etichettateli per il vuoto (1:10 diluito pool di urina) e le seguenti 70 concentrazioni DI FITC-polysucrose (0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20, 40, 80 e 160 g/mL).
    3. Pipet 246 - L di pozza di urina diluita in un tubo marrone da 1,5 ml e aggiungete 4 -L della concentrazione di scorte FITC-polysucrose 70 (vedi passo 1.1) per ottenere una concentrazione finale di 160 g/mL FITC-polysucrose 70. Pipet 100 L della pozza di urina diluita in tutti gli altri tubi.
    4. Diluire 1:2 con la pipa 100 l del tubo FITC-polysucrose 70 da 160 g/mL nel tubo 80 g/mL e continuare con le altre concentrazioni. Assicurare una corretta miscela delle concentrazioni diluite (ad esempio, vorticendo il tubo prima di continuare).
    5. Diluire i campioni di urina di topo (0 min, 60 min) 1:10 con piscina urinaria diluita.
    6. Pipetta 5 - L di ogni concentrazione standard di FITC-polysucrose 70 e dei campioni di urina di topo come triplicati in una piastra nera di 384 pozze. Centrifugare la piastra a 1.000 x g per 15 s per evitare bolle.
    7. Analizzare la piastra 384-po in un lettore di lamiere. Eseguire l'eccitazione a 496 nm e misurare la fluorescenza a 525 nm.
  2. Misurazione della creatinina
    1. Seguire le istruzioni del produttore. In breve, preparate gli standard di creatinina diluindo 10 L della soluzione standard di 100 m di creatinina con 990 tamponi di assaggio creatinina per preparare una soluzione standard da 1 mM.
    2. Aggiungere 0, 2, 4, 6, 8 e 10 L della soluzione standard di 1 mM creatinina in una piastra di 96 pozze per generare rispettivamente gli standard 0, 2, 4, 6, 8 e 10 nmol/well. Aggiungere il tampone di assaggio creatinina in ogni pozzo per portare il volume a 50.L.
    3. Preparare le miscele di reazione aggiungendo un buffer di 42-44 gradi di assaggio di creatinina, 2 l di creatina, 2 anni di creatinina, 2 -L di miscela di enzimi creatinina e 2 -L di sonda creatinina. Per il vuoto, utilizzare 44 l di buffer di asina creatinina, 2 litri di creatina, 2 l di miscela di enzimi creatinina e 1-2 di sonda di creatinina.
    4. Aggiungere 50 l del mix di reazione appropriato ad ogni pozzo nella piastra 96-well e incubarlo per 60 min su uno shaker orizzontale a 37 gradi centigradi. Proteggere la piastra dalla luce durante l'incubazione. Misurare l'assorbimento a 570 nm su un lettore di lamiere.
    5. Calcolare le concentrazioni di creatinina sottraendo il valore vuoto da tutte le letture. Il risultato avrà l'unità nanomole/microlitro. Moltiplicare la concentrazione di creatinina per il peso molecolare della creatinina (113.12 ng/nmol) per ricevere l'unità nanogrammi/microlitro.

6. Analisi dei dati

  1. Calcolare la concentrazione di urina FITC-polysucrose 70 dalla curva standard.
  2. Fare riferimento al FITC-polysucrose 70 concentrazioni di urina alle concentrazioni di creatinina nel campione di urina rappresentativo.
  3. Fare riferimento ai campioni di urina 60 min per urina 0 min campioni di controlli e topi trattati.

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Risultati

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Come illustrato nella Figura 2, il metodo per testare la permeabilità glomerare nei topi è costruito in tre fasi. La prima fase è chiamata fase di preparazione, in cui sono posizionati un catetere urinario e un catetere venoso centrale. La seconda fase è chiamata fase di equilibratione, a partire da un'iniezione di bolus endovenosa di FITC-polysucrose 70 e seguita dalla continua infusione di FITC-polysucrose 70 per 60 min. L'ultima fase è chiamata fase sperim...

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Discussione

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Il metodo presentato consente allo sperimentatore di testare la permeabilità glomerare nei topi in modo molto sensibile utilizzando un tracciante. Con questo metodo, aumenti a breve termine nella permeabilità glomerare possono essere diagnosticati utilizzando solo piccole quantità di urina. I passaggi più critici per padroneggiare con successo questa tecnica sono 1) lo sviluppo di competenze manuali nella chirurgia del mouse, soprattutto nella concanulazione di una vena centrale, 2) ponendo il catetere urinario senza dan...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano Christina Schwandt, Blanka Duvnjak e Nicola Kuhr per l'eccezionale assistenza tecnica e il dottor Dennis Sohn per il suo aiuto nella scansione della fluorescenza. Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) SFB 612 TP B18 a L.C.R. e L.S. Il funder non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicazione o nella preparazione del manoscritto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Motic SMZ168 BLMoticmicroscopio SMZ168BLper chirurgia del topo
KL1500LCDPulch e Lorenz microscopia150500luce per chirurgia del topo
MicrofederschereBraun, AesculapFD100Rforbici fini
Durotip Feine ScherenBraun, AesculapBC210Rper taglio collo
Anatomische PinzetteBraun, AesculapBD215Rper chirurgia 
Prä parierklemmeAesculapBJ008Rper chirurgia 
SeraflexSerag WiessnerIC108000filo di seta
Ketamina 10%AnestesiaMedistar
Rompun (Xylazin) 2%AnestesiaBayer
Tubo in polietilene a foro fine ID 0,28 mm OD 0,61 mmPortex800/100/100Catetere
Tubo in polietilene a foro fine ID 0,58 mm OD 0,96 mmCateterePortex800/100/200
Harvard apparatus 11 PlusHarvard Apparatus70-2209pompa a siringa
BD Insyte AutoguardBD381823  catetere urinario
Rivelatore multimodale DTX 880Beckman Coulterplate
384 pozzetti micropiastraNunc262260384 pozzetti platte
Kit per il dosaggio della creatininaSigma-AldrichMAK080per misurare la concentrazione di creatinina
96 pozzetti piastraNunc260836per il dosaggio della creatinina 
Polisuccroso marcato FITC 70TBD ConsulenzaFP70FITC-ficoll
Angiotensina IISigma-AldrichA9525utilizzato per testare la permeabilità glomerulare
BP-98ASoftronper la misurazione della pressione sanguigna
OTS 40.3040Medite01-4005-00piastra riscaldante per chirurgia del topo
Instillagel 6mLFarco-Pharma GmbHper catetere urinario
ExactaAesculapGT415shaver
reader

Riferimenti

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