Articolo metodologico

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

DOI:

10.3791/59071

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4 agosto 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, 2Department CIBIO, University of Trento, 3LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Abstract

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La scoperta che la nota proteina P53 mammifera può fungere da fattore di trascrizione (TF) nel lievito S. cerevisiae ha permesso lo sviluppo di diversi saggi funzionali per studiare l'impatto del sito di legame [cioè, elemento di risposta (RE)] varianti di sequenza sulla specificità di trasattivazione P53 o 2) mutazioni di TP53, co-espressi co-espressi co-espressi o piccole molecole sull'attività di trasattivazione P53. Sono state sviluppate diverse applicazioni di ricerca di base e traslazionali. Sperimentalmente, questi approcci sfruttano due grandi vantaggi del modello di lievito. Da un lato, la facilità di editing del genoma consente una rapida costruzione di sistemi qualitativi o quantitativi di reporter sfruttando ceppi isogenici che differiscono solo a livello di uno specifico P53-RE per studiare la specificità della sequenza dipendente da P53 trasattivazione. D'altra parte, la disponibilità di sistemi regolamentati per l'espressione ectopica P53 consente la valutazione della trasattivazione in una vasta gamma di espressioni proteiche. Rivisti in questa relazione sono ampiamente utilizzati sistemi che si basano sui geni dei reporter di colore, luciferase, e la crescita del lievito per illustrare i loro principali passi metodologici e per valutare criticamente il loro potere predittivo. Inoltre, l'estrema versatilità di questi approcci può essere facilmente sfruttata per studiare diversi TF tra cui P63 e P73, che sono altri membri della famiglia genica TP53.

Introduzione

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La trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione dinamica, spaziale e temporale dei fattori di trascrizione (TF) e dei cofattori per il reclutamento e la modulazione delle polimerasi dell'RNA sulle regioni della cromatina in risposta a stimoli specifici1 . La maggior parte dei TF, incluso il soppressore umano del tumore P53, riconosce specifici elementi cis-agire sotto forma di sequenze di DNA chiamate elementi di risposta (RE), che consistono in singoli (o multipli) motivi unici lunghi 6-10 nucleotidi. All'interno di questi motivi, singole posizioni possono mostrare vari gradi di variabilità2, di solito riassunti da matrici di peso posizione (PWM) o loghi3,4.

Il lievito S. cerevisiae è un sistema modello adatto per studiare diversi aspetti delle proteine umane attraverso saggi di complemento, espressione ectopica e saggi funzionali, anche quando non è presente un gene di lievito ortologo5, 6 È possibile: , 7. A causa della conservazione evolutiva dei componenti basali del sistema trascrizionale8, molti TF umani (espressi ectopicamente in cellule di lievito) possono modulare l'espressione di un gene reporter agendo attraverso promotori progettati per contengono RE appropriate. Il sistema del modello di trascrizione qui presentato per l'uomo P53 è caratterizzato da tre variabili principali i cui effetti possono essere modulati: 1) la modalità di espressione e il tipo di P53, 2) la sequenza RE che controlla la trascrizione dipendente da P53 e 3) il tipo di gene reporter (Figura 1A).

Per quanto riguarda la modalità di espressione P53, S. cerevisiae permette la scelta di promotori inducibili, repressivi o imtenziari9,10,11. In particolare, il promotore inducibile GAL1 consente basale (utilizzando raffinose come fonte di carbonio) o variabile (cambiando la quantità di galactose nei media) espressione di un TF in lievito. Infatti, l'espressione finemente regolabile rappresenta uno sviluppo critico per lo studio non solo della P53 stessa, ma anche di altre proteine familiari P5312,13.

Per quanto riguarda il tipo di RE che controlla noto all'espressione dipendente da P53, S. cerevisiae consente la costruzione di diversi ceppi di reporter in possesso di differenze uniche nella RE di interesse in un contesto altrimenti isogenico. Questo obiettivo è raggiunto utilizzando l'adattamento di un approccio di editing del genoma particolarmente versatile sviluppato in S. cerevisiae, chiamato delitto12,14,15,16.

Inoltre, diversi geni reporter (ad esempio URA3, HIS3 e ADE2) possono essere utilizzati per valutare qualitativamente e quantitativamente le attività trascrizionali dei TF umani in S. cerevisiae, ciascuno con caratteristiche specifiche che possono essere su misura per le esigenze sperimentali17,18,19,20,21. L'espressione di questi geni reporter conferisce uracil, istidina e prototrofia adenina, rispettivamente. Il reporter URA3 non consente la crescita delle cellule in presenza di 5-FOA pure, e quindi può essere controselezionato. Il sistema di reporter ADE2 ha il vantaggio che, oltre alla selezione nutrizionale, consente l'identificazione di cellule di lievito che esprimono di tipo selvaggio (cioè, funzionale su espressione ADE2) o mutanti (cioè,non funzionali su ADE2 ) P53 dal colore della colonia.

Ad esempio, le cellule di lievito che esprimono il gene ADE2 generano colonie bianche di dimensioni normali su lastre contenenti quantità limitanti di adenina (2,5-5,0 mg/L), mentre quelle che non si trascrivono male o non la trascrivono appaiono sulla stessa piastra del rosso più piccolo (o rosa) Colonie. Ciò è dovuto all'accumulo di un intermedio nel percorso biosintetico adenino (ad esempio, P-ribosylamino-imidazole, precedentemente chiamato ribotide amino-imidazole o AIR), che viene convertito per formare un pigmento rosso. Da allora il gene qualitativo del reporter ADE2 basato sul colore è stato sostituito dal quantitativo Firefly Photinus pyralis (LUC1)12,22. Più di recente, il reporter di ADE2 è stato combinato con il reporter lacz in un'analisi del doppio reporter facile da segnare, semi-quantitativa, che può essere sfruttata per sottoclassificare i mutanti P53 in base al loro livello residuo di funzionalità 23.

Reporter fluorescenti come EGFP (proteina fluorescente verde avanzata) o DsRed (Discosoma sp. proteina fluorescente rossa) sono stati utilizzati anche per la valutazione quantitativa dell'attività di trasattivazione associata a tutte le possibili mutazioni di Sequenza di codifica TP5324. Infine, la possibilità di combinare promotori regolabili per l'espressione allele P53 con ceppi di lievito isogenici diversi per il gene RE e/o reporter ha portato allo sviluppo di una matrice di dati che genera una classificazione raffinata di lieviti associati al cancro e germinale mutante P53 alleli25,26,27.

Gli approcci sopra descritti sono utilizzati per misurare l'attività trascrizionale della proteina P53. Tuttavia, l'espressione di P53 di tipo selvaggio nel lievito S. cerevisiae28 e Schizosaccharomyces pombe29 può causare ritardo della crescita, che è stato associato con l'arresto del ciclo cellulare28,30 o morte cellulare31. In entrambi i casi, l'inibizione della crescita del lievito è innescata da un'elevata espressione P53 ed è stata correlata con la potenziale modulazione trascrizionale dei geni del lievito endogeno coinvolti nella crescita cellulare. A sostegno di questa ipotesi, il mutante P53 R273H della perdita di funzione non ha interferito con la crescita delle cellule di lievito quando espresso a livelli simili a P5332di tipo selvaggio. Al contrario, l'espressione nel lievito del mutante tossico P53 V122A (noto per una maggiore attività trascrizionale rispetto al selvaggio P53) ha causato un effetto inibitorio della crescita più forte rispetto al tipo selvaggio P5332.

Inoltre, è stato dimostrato che l'MDM2 umano è stato in grado di inibire l'attività trascrizionale umana P53 nel lievito, promuovendone l'ubiquitinazione e la conseguente degradazione33. Di conseguenza, la capacità dell'uomo MDM2 e MDMX di inibire l'inibizione della crescita del lievito indotta da P53 è stata dimostrata32,34. In uno studio aggiuntivo, è stata stabilita una correlazione tra l'attività trascrizionale P53 e i livelli di espressione dell'actina, con l'identificazione di un putativo P53 RE a monte sul gene ACT1 nel lievito32. Coerentemente, l'espressione di actin è stata potenziata da P53 wild-tipo e ancora di più da P53 V122A, ma non dal mutante P53 R273H. Al contrario, l'espressione di actina da P53 è diminuita nella co-presenza di inibitori P53 MDM2, MDMX, o pifithrin- s (un inibitore di piccole molecole dell'attività trascrizionale P53), coerente con i risultati basati sul saggio di crescita del lievito. È importante sottolineare che questi risultati hanno stabilito una correlazione tra l'inibizione della crescita indotta da P53 e il grado della sua attività nel lievito, che è stato sfruttato anche per identificare e studiare piccole molecole che modulano le funzioni P5328,34 , 35.

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Protocollo

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1. Costruzione di ceppi di lievito reporter ADE2 o LUC1 contenenti un RE specifico (yAFM-RE o yLFM-RE)

  1. Streak un ceppo yAFM-ICORE o yLFM-ICORE12,14 (ICORE - ICORE - ISce-I endonuclease sotto promotore di GAL1; CO - contatore selezionabile URA3; RE - reporter KanMX4 conferendo la resistenza alla kanamycin; Tabella 1) da un 15% di brodo di glicerolo immagazzinato a -80 gradi centigradi su una piastra di agar YPDA (Tabella 2). Lasciarlo crescere per 2-3 giorni a 30 gradi centigradi.
  2. Prendere una colonia di lievito dal piatto fresco (non più di 3 settimane) e metterlo in una piccola fiaschetta contenente 5 mL di YPDA (Tabella 2). Incubare a 30 gradi durante la notte, agitando a 150-200 giri/min.
  3. Il giorno successivo, per rimuovere tutte le tracce di destrosio, pellet le cellule per 2 min a 3.000 x g e scartare il supernatante per inversione del tubo.
    NOTA: Eseguire tutte le centrifughe in questo protocollo a temperatura ambiente (RT).
  4. Risospendere il pellet cellulare in 30-50 mL di CM preriscaldato (media completo) contenente galactose (Tabella 2) e incubare per 4 h a 30 gradi centigradi, agitando a 150-200 rpm (necessario per l'induzione di I-SceI).
  5. Centrifugare le cellule per 2 min a 3.000 x g e scartare il supernatante per inversione del tubo.
  6. Risospendere il pellet cellulare in 30-50 mL di acqua sterile. Ripetere il passaggio 1.5.
  7. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di acqua sterile. Ripetere il passaggio 1.5.
  8. Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di LiAcTE sterile (Tabella 3), una soluzione ionica che favorisce l'assorbimento del DNA. Ripetere il passaggio 1.5.
  9. Risospendere il pellet cellulare a 250 gradi di LiAcTE sterile e trasferire le cellule in un tubo da 1,5 mL. Ripetere il passaggio 1.5 e risospendere il pellet cellulare a 300-500 - L di sterile LiAcTE.
  10. Durante i lavamenti, denaturare una soluzione da 10 mg/mL di portaTENdi di DNA spermatozoi di salmone per 10 min a 100 gradi centigradi e raffreddare immediatamente sul ghiaccio per mantenerlo come DNA a filamento singolo.
  11. In un tubo separato da 1,5 mL aggiungere 500 picomoli dell'oligonucleotide desiderato (Tabella 3), 5 -L del DNA del portamalo del salmone bollito, 300 l di PEG LiAcTE sterile (Tabella 3) e 50 -L della sospensione della cella di lievito (dal punto 1.9).
  12. Vorticare i tubi per 10 s per mescolare e incubare per 30 min a 30 gradi centigradi, agitando a 150-200 rpm. Posizionare i tubi da 1,5 mL sul lato per favorire lo scuotimento.
  13. Il calore scuote le cellule di lievito per 15 minuti a 42 gradi centigradi in un blocco di riscaldamento, quindi centrifichezzano le cellule per 20 s a 10.000 x g. Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di acqua sterile.
  14. Stendere 100 l della sospensione cellulare sulla piastra di agar YPDA e incubare (a testa in giù) per 1 giorno a 30 gradi centigradi. Per garantire che si ottengano colonie ben separate, spalmare anche 100 - L di una diluizione 1:10.
  15. Il giorno successivo, piastra replica utilizzando velluti sterili su CM agar piatto contenente dextrose e 5-FOA (Tabella 2). Si consideri una seconda piastra di replica su una nuova piastra se vengono trasferite molte cellule (ad esempio, una certa crescita delle cellule URA3).
  16. Tre giorni dopo, piastra di replica su piastre di agar non selettive YPDA e YPDA contenentiG418 (un antibiotico aminoglycoside simile alla kanamicicina) piastre di agar (tabella 2), marcatura di ciascuna piastra per facilitare il loro successivo confronto. Incubare le piastre durante la notte a 30 .
  17. Il giorno successivo, identificare i ceppi di reporter candidati da colonie che sono G418-sensibile ma crescono su piastre YPDA (ad esempio, colonie yLFM- o yAFM-RE). Streak le colonie identificate (3-6 colonie) su una nuova piastra YPDA per ottenere isolati singola colonia e lasciarli crescere per 2 giorni a 30 gradi centigradi.
  18. Patch singole colonie di lieviti su una piastra YPDA per isolare le colonie per ulteriori analisi. Dopo 24 h a 30 , testarli mediante la placcatura replica su una piastra di agar YPGA (Tabella 2) che impediscono la crescita di mutanti piccoli (cioè mutanti respiratori carenti). Allo stesso tempo, piastra di replica su un nuovo YPDA agar piastra.
  19. Testare le patch corrette (cioè la crescita sulle piastre di agar YPDA e YPGA; 1-3 colonie) dal punto 1.18 per la presenza di una corretta integrazione oligonucleotide da parte della colonia PCR. Assemblare una miscela di reazione aggiungendo 5 ll l una di 10m di buffer PCR (1,5 mM MGCl2), 2 -L di 10 picomole/l primer (tabella 3), 4 lun di 2,5 m dNTP, 0,25 L di 5 Polymerase U/L L e acqua a un volume finale di 50 . Moltiplicare il mix di reazione per il numero di colonie di lieviti che devono essere sottoposte a screening e 50 - L in ogni tubo PCR. Utilizzando una pipetta, aggiungere una piccola quantità di cellule di lievito dalla piastra di agar YPDA in un singolo mix di reazione PCR.
  20. Eseguire la reazione PCR con il seguente programma: 94 s per 8 min seguito da 35 cicli di denaturazione per 1 min a 94 gradi centigradi, primer che fissano per 1 min a 55 gradi centigradi, ed estensione per 2 min a 72 .
  21. Una volta completata la reazione, caricare una della reazione PCR (circa un decimo del volume) su un gel di agarose per verificare la dimensione corretta (500 bp) .
  22. Sequenziare il prodotto PCR dopo la purificazione con un kit commerciale per confermare l'integrazione della sequenza RE desiderata utilizzando gli stessi primer del passaggio 1.19.
  23. Dopo la convalida della sequenza corretta, fare uno stock di glicerolo del 15% di cultura di deformazione yAFM-RE o yLFM-RE (in YPDA) e conservarlo a -80 gradi centigradi.

2. Valutazione della capacità di trasattivazione della proteina P53 utilizzando il saggio qualitativo di lievito ADE2 basato sul colore

  1. Ripetere i passaggi 1.1 e 1.2 utilizzando la deformazione yAFM-RE (Tabella 1).
  2. Il giorno dopo, diluire la coltura cellulare (1:10) in 30-50 mL di YPDA preriscaldato e continuare a incubare a 30 gradi centigradi agitando fino a quando l'OD600nm raggiunge 0,8-1,0 .
  3. Ripetere i passaggi da 1.5 a 1.10.
  4. In un tubo separato da 1,5 mL, aggiungere 300-500 ng di lievito P53 (o controllo) vettore di espressione (tabella 4), 5 l del supporto di DNA dello sperma di salmone bollito, 300 l of sterile LiAcTE PEG e 50 .L di sospensione delle cellule di lievito.
  5. Ripetere i passaggi 1.12 e 1.13, ma sospendere nuovamente il pellet cellulare in 300 - L di acqua sterile.
  6. Stendere 100 l delle sospensioni cellulari su piastre sintetiche selettive (per l'espressione P53 o il vettore di controllo) contenenti dexrose come fonte di carbonio e un'elevata quantità di adenina (Tabella 2), quindi incubare (capovolto) a 30 gradi centigradi per 2-3 giorni.
  7. Streak colonie trasformanti di lievito singolo (2-6 strisce per piastra) su una nuova piastra selettiva e lasciarli crescere durante la notte a 30 gradi centigradi.
  8. Il giorno dopo, utilizzando velluti sterili replica piastra su nuove piastre selettive che consentono la valutazione del fenotipo di colore (cioè, piastre contenenti dextrose come fonte di carbonio, ma limitando la quantità di adenina ; Tabella 2). Incubare le piastre a testa in giù a 30 gradi centigradi per 3 giorni. Facoltativamente, per valutare la sensibilità alla temperatura della proteina P53, incubare a tre temperature diverse per 3 giorni: 24 , 30 gradi centigradi e 37 gradi centigradi.
    NOTA: la stessa striscia può essere replicata più volte.
  9. Per valutare la capacità di trasattivazione della proteina P53, controllare il fenotipo a base di colore delle colonie di lieviti e confrontare il fenotipo della proteina P53 rispetto ai fenotipi vettoriali vuoti e di tipo selvatico P53.

3. Valutazione della capacità di trasattivazione della proteina P53 utilizzando il saggio di lievito LUC1 basato sulla luminescenza quantitativa

  1. Trasformare le celle di lievito con vettori di espressione P53 (o controllo) (Tabella 4) utilizzando il metodo basato su LiAc descritto nel protocollo 2. Utilizzare la deformazione yLFM-RE (Tabella 1).
  2. Applicare patch a singoli trasformatori su una nuova piastra selettiva con l'elevata quantità di adenina contenente glucosio come fonte di carbonio e lasciarli crescere a 30 gradi durante la notte. Per ogni tipo di trasformazione, effettuare 5-7 patch diverse.
  3. Dopo una crescita durante la notte, risospendere una piccola quantità di cellule di lievito utilizzando uno stuzzicadenti sterile o una punta di pipetta dalla piastra in un mezzo selettivo sintetico contenente dextrose o raffinose come fonte di carbonio (200 l volume finale in una piastra trasparente 96, con un o fondo piatto). Se l'esperimento richiede un'espressione P53 inducibile, aggiungere la galactose al mezzo raffinose per modulare il livello di induzione (Tabella 2).
    NOTA: Queste sospensioni cellulari devono avere un OD600nm di circa 0,4 e non superiore a 1.
  4. Misurare l'assorbimento di ogni pozzo a OD600nm dopo espressione P53 inducibile (4-8 h a 30oC con 150-200 rpm agitazione) utilizzando un lettore di piastre multi-label. Assicurarsi che le sospensioni cellulari siano omogenee mescolando ogni pozzo con una pipetta multicanale.
  5. Trasferire 10-20 L di sospensione cellulare dalla piastra trasparente 96 ben in una piastra bianca 384 (o 96) bene e mescolare con un volume uguale (10-20 L) di tampone di lisi. Incubare per 10-15 min a RT su uno shaker (150-200 rpm) per ottenere la permeabilizzazione della cellula al substrato luciferale.
  6. Aggiungere 10-20 l'l di substrato lucidferase di lucciola e misurare le unità di luce (LU) da un lettore di lamiere multi-label.
  7. Per determinare la capacità di trasattivazione della proteina P53, normalizzare i LU di ogni pozzo al corrispondente OD600nm (unità di luce relativa, RLU). Calcola RLU media e deviazione standard da 3-4 patch di colonie trasformatiri di lievito.
  8. Confrontare i dati di trasattivazione della proteina P53 rispetto al tipo selvatico P53 e al vettore vuoto, sottraendo i valori ottenuti con il vettore vuoto o dividendo per i valori ottenuti con il vettore vuoto (cioè, calcolando la piega dell'induzione).
    NOTA: l'attività di trasattivazione P53 può essere valutata anche utilizzando lo stesso set-up sperimentale in presenza di proteine interagenti P53 (ad esempio, MDM2 e MDMX) e/o incluso il trattamento farmacologico.

4. Valutazione dell'inibizione della crescita proteica P53 utilizzando il saggio fenotipica del lievito

  1. Trasformare le celle di lievito con vettori di espressione P53/MDM2/MDMX (o controllo) (Tabella 4) utilizzando il metodo basato su LiAc descritto nella sezione 2. Utilizzare la deformazione CG379 (Tabella 1) e i trasformatori di lievito stendere su piastre selettive minime (Tabella 2).
  2. Far crescere le celle trasformate in un mezzo selettivo minimo (Tabella 2) a circa 1 OD600nm.
  3. Diluire le cellule di lievito a 0,05 OD600nm nel mezzo di induzione selettiva (Tabella 2), e, facoltativamente, aggiungere una piccola molecola scelta alla concentrazione appropriata (o solo al solvente) per testarne l'efficacia nel riattivare il Mutantp P53 o nell'inibire MDM2- Interazioni /MDMX-P53.
  4. Incubare le cellule a 30 gradi centigradi in continuo scuotimento orbitale (200 rpm) per circa 42 h (tempo richiesto dal lievito di controllo negativo per raggiungere la fase intermedia del log, circa 0,45 OD600nm).
  5. Individuare 100 aliquote di colture cellulari di lievito su piastre selettive minime (Tabella 2).
  6. Incubare per 2 giorni a 30 gradi centigradi.
  7. Misurare la crescita del lievito contando il numero di colonie ottenute nelle 100 gocce di coltura l.l (unità di formazione della colonia, conteggio CFU). Ad esempio, calcolare l'effetto mutante riattivando dei composti considerando la crescita del lievito selvaggeP53 che esprime come effetto massimo possibile (impostato al 100%), mentre la crescita di cellule che esprimono Il P53 mutante (ma esposte al controllo dei solventi) rappresenta il livello zero di riattivazione.

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Risultati

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Costruzione di ADE2 o o LUC1 ceppi di lievito reporter

Ildelitto perfettoapproach12,14,15,16 è stato adattato per consentire la costruzione di ceppi di lievito reporter P53 ( Figura

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Discussione

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I saggi basati sul lievito si sono dimostrati utili per studiare vari aspetti delle funzioni proteiche P53. Questi saggi sono particolarmente sensibili per valutare il potenziale di trasattivazione P53 verso varianti di siti target RE, compresa la valutazione dei polimorfismi funzionali. L'uso di giornalisti di colore e la miniaturizzazione del saggio luciferasi si traducono in analisi convenienti e relativamente scalabili. Inoltre, il test di inibizione della crescita è potenzialmente suscettibile di essere utilizzato n...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

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Ringraziamo l'Unione europea (fondi FEDER POCI/01/0145/FEDER/007728 attraverso Programa Operacional Factores de Competitividade - COMPETE) e i Fondi Nazionali (FCT/MEC, Fundao para a Ciància e Tecnologia e Ministério da Educaa Accordo di partenariato PT2020 UID/QUI/50006/2019 e i progetti (3599-PPCDT) PTDC/DTP-FTO/1981/2014 - POCI-01-0145-FEDER-016581. Borse di studio FCT: SFRH/BD/96189/2013 (S. Gomes). Questo lavoro è stato sostenuto dalla Compagnia S. Paolo, Torino, Italia (Progetto 2017.0526) e dal Ministero della Salute, (Progetto 5x1000, 2015 e 2016; ricerca in corso 2016). Ringraziamo profondamente la Dott.ssa Teresa Lopez-Arias Montenegro (Università di Trento, laboratori sperimentali di insegnamento delle scienze) per l'assistenza con la registrazione video.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
dell'acido L-asparticoSIGMA11189
QIAquick PCRQIAGEN28104
L-fenilalaninaSIGMA78019
PeptoneBD Bacto211677
Lievito ex+A2:C26tractBD Bacto212750
Difco Lievito base azotata senza aminoacidi e solfato di ammonioBDTM233520
Acetato di litio diidratoSIGMA517992
Agar batteriologico di tipo ABiokar DiagnosticsA1010 HA
G418 sale disolfatoSIGMAA1720
solfato di ammonioSIGMAA2939
L-arginina monocloridratoSIGMAA5131
Sale di adenina emisolfatoSIGMAA9126
Tampone di lisi passiva 5xPROMEGAE1941
Sistema di analisi della luciferasi Bright-Glo PROMEGAE2620
5-FOAZymo ResearchF9001
D-(+)-GalattosioSIGMAG0750
Acido L-glutammicoSIGMAG1251
Destrosio SIGMAG7021
L-IstidinaSIGMAH8125
L-IsoleucinaSIGMAI2752
L-LisinaSIGMAL1262
L-LeucinaSIGMAL8000
L-MetioninaSIGMAM2893
PEGSIGMAP3640
D-(+)-Raffinosio PentaidratoSIGMAR0250
L-SerinaSIGMAS4500
L-TriptofanoSIGMAT0271
L-TreoninaSIGMAT8625
UracilSIGMAU0750
L-ValinaSIGMAV0500
Kit di purificazione

Riferimenti

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