Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

Paola Monti; Bartolomeo Bosco; Sara Gomes; Lucilia Saraiva; Gilberto Fronza; Alberto Inga

doi:10.3791/59071

È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

Articolo metodologico

Il lievito come telaio per lo sviluppo di saggi funzionali per studiare l'Uomo P53

9K visualizzazioni

⸱

DOI:

10.3791/59071

⸱

4 agosto 2019

Paola Monti¹ , Bartolomeo Bosco² , Sara Gomes³ , Lucilia Saraiva^*³ , Gilberto Fronza^*¹ , Alberto Inga^*²

¹Mutagenesis and Cancer Prevention Unit, Ospedale Policlinico San Martino, ²Department CIBIO, University of Trento, ³LAQV/REQUIMTE, Laboratory of Microbiology, Faculty of Pharmacy, University of Porto

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Sono presentati quattro protocolli per costruire e sfruttare i ceppi di reporter del lievito Saccharomyces cerevisiae per studiare il potenziale di trassessione umano P53, gli impatti delle sue varie mutazioni associate al cancro, le proteine interagenti co-espresse e gli effetti di piccole molecole specifiche.

Abstract

La scoperta che la nota proteina P53 mammifera può fungere da fattore di trascrizione (TF) nel lievito S. cerevisiae ha permesso lo sviluppo di diversi saggi funzionali per studiare l'impatto del sito di legame [cioè, elemento di risposta (RE)] varianti di sequenza sulla specificità di trasattivazione P53 o 2) mutazioni di TP53, co-espressi co-espressi co-espressi o piccole molecole sull'attività di trasattivazione P53. Sono state sviluppate diverse applicazioni di ricerca di base e traslazionali. Sperimentalmente, questi approcci sfruttano due grandi vantaggi del modello di lievito. Da un lato, la facilità di editing del genoma consente una rapida costruzione di sistemi qualitativi o quantitativi di reporter sfruttando ceppi isogenici che differiscono solo a livello di uno specifico P53-RE per studiare la specificità della sequenza dipendente da P53 trasattivazione. D'altra parte, la disponibilità di sistemi regolamentati per l'espressione ectopica P53 consente la valutazione della trasattivazione in una vasta gamma di espressioni proteiche. Rivisti in questa relazione sono ampiamente utilizzati sistemi che si basano sui geni dei reporter di colore, luciferase, e la crescita del lievito per illustrare i loro principali passi metodologici e per valutare criticamente il loro potere predittivo. Inoltre, l'estrema versatilità di questi approcci può essere facilmente sfruttata per studiare diversi TF tra cui P63 e P73, che sono altri membri della famiglia genica TP53.

Introduzione

La trascrizione è un processo estremamente complesso che coinvolge l'organizzazione dinamica, spaziale e temporale dei fattori di trascrizione (TF) e dei cofattori per il reclutamento e la modulazione delle polimerasi dell'RNA sulle regioni della cromatina in risposta a stimoli specifici¹. La maggior parte dei TF, incluso il soppressore umano del tumore P53, riconosce specifici elementi cis-agire sotto forma di sequenze di DNA chiamate elementi di risposta (RE), che consistono in singoli (o multipli) motivi unici lunghi 6-10 nucleotidi. All'interno di questi motivi, singole posizioni possono mostrare vari gradi di variabilità^....