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Articolo metodologico

Un protocollo per la terapia di fotobiomodulazione Transcranial in topi

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DOI:

10.3791/59076

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18 novembre 2018

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1Neurosciences Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, 2ProNeuroLIGHT LLC, 3LiteCure LLC, 4Department of Psychiatry, Harvard Medical School, 5Depression Clinical and Research Program, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 6Center for Anxiety and Traumatic Stress Disorders, Department of Psychiatry, Massachusetts General Hospital, 7Research Institute for Applied Physics and Astronomy, University of Tabriz, 8Department of Medical Physics, Tabriz University of Medical Sciences, 9Department of Medical Bioengineering, Tabriz University of Medical Sciences, 10School of Medical Sciences, University of Aberdeen

In questo articolo

Sommario

Terapia di fotobiomodulazione è un'innovativa modalità non invasiva per il trattamento di una vasta gamma di disturbi neurologici e psichiatrici e può anche migliorare la funzione cerebrale sano. Questo protocollo include una guida dettagliata all'esecuzione fotobiomodulazione cervello nei topi di transcranial luce consegna, che può essere adattato per l'uso in altri roditori di laboratorio.

Abstract

Fotobiomodulazione transcranial è un potenziale approccio terapeutico non invasivo innovativo per migliorare la bioenergetica cerebrale, funzione del cervello in una vasta gamma di disturbi neurologici e psichiatrici e potenziamento di memoria nel declino conoscitivo relativo all'età e malattie neurodegenerative. Descriviamo un protocollo di laboratorio per la terapia di fotobiomodulazione transcranial (PBMT) in topi. Topi BALB/c invecchiati (18 mesi) sono trattati con un 660 nm laser transcranially, una volta al giorno per 2 settimane. Trasmissione dati mostrano che circa l'1% della luce incidente rosso sul cuoio capelluto raggiunge una profondità di 1 mm dalla superficie corticale, penetrando l'ippocampo dorsale del laser. I risultati del trattamento sono valutati con due metodi: un Barnes labirinto test, che è una valutazione di attività ippocampo-dipendente apprendimento e memoria spaziale, e misura hippocampal livelli di ATP, che è usato come un indice di bioenergetica. I risultati dell'attività di Barnes mostrano un miglioramento della memoria spaziale in topi invecchiati laser-trattati rispetto ai controlli di pari età. Analisi biochimica dopo trattamento laser indica ha aumentato i livelli di ATP hippocampal. Postuliamo che il miglioramento delle prestazioni di memoria è potenzialmente a causa di un miglioramento nel metabolismo energetico hippocampal indotta dal trattamento laser rosso. Le osservazioni nei topi potrebbero essere esteso ad altri modelli animali poiché questo protocollo potrebbe potenzialmente essere adattato ad altre specie frequentemente utilizzato in neuroscienze traslazionali, come coniglio, gatto, cane o scimmia. Fotobiomodulazione transcranial è una modalità sicura e conveniente che può essere un promettente approccio terapeutico nel danno conoscitivo relativo all'età.

Introduzione

PBMT, o terapia della luce laser a basso livello (LLLT), è un termine generale che si riferisce ai metodi terapeutici basati sulla stimolazione dei tessuti biologici di energia luminosa da laser o diodi emettitori di luce (LED). Quasi tutti i PBMT trattamenti sono applicati con rosso alla luce vicino-infrarosso (NIR) alle lunghezze d'onda da 600 a 1100 nm, una potenza di uscita che vanno da 1 a 500 mW e una fluenza che vanno da < 1 a > 20 J/cm2 (Vedi Chung et al.1).

Transcranial PBMT è un metodo di consegna luce non invadente che è condotto da irradiazione della testa usando una fonte di luce esterna (laser o LED)2. Per le applicazioni degli animali, questo metodo include il contatto o senza contatto posizionamento della sonda laser o LED sulla testa dell'animale. A seconda dell'area terapeutica di interesse, una sonda luce posizionabile sia sopra l'intera testa (per coprire tutte le aree del cervello) o su una parte specifica della testa, come la regione prefrontale, frontale o parietale. La trasmissione parziale della luce rossa/NIR attraverso il cuoio capelluto, il cranio e il mater di dura può raggiungere il livello della superficie corticale e fornire una quantità di fotoni di energia sufficiente a produrre benefici terapeutici. Successivamente, la fluenza luce trasportata a livello corticale sarebbe essere propagata nella materia grigia e bianca del cervello fino a raggiungere le strutture più profonde del cervello3.

Luce nelle bande spettrali al red da' regione (600-680 nm) e primi NIR regione (800-870 nm) corrisponde allo spettro di assorbimento di citocromo c ossidasi, l'enzima terminale della catena respiratoria mitocondriale4. È supposto che PBMT nello spettro rosso/NIR provoca la fotolisi dell'ossido nitrico (NO) dal citocromo c ossidasi, un conseguente aumento nel trasporto mitocondriale dell'elettrone e, in definitiva, aumentato ATP generazione5. Per quanto riguarda le applicazioni di un neurone, i potenziali benefici di neurostimulatory di cervello PBMT mediante irradiazione transcranial metodi sono stati segnalati in una varietà di studi preclinici, tra cui modelli del roditore di cervello traumatica (TBI) la ferita6, con il colpo acuto7, morbo di Alzheimer (annuncio)8, morbo di Parkinson (PD)9, depressione10e invecchiamento11.

Invecchiamento del cervello è considerata una condizione neuropsicologica che lede alcune funzioni cognitive, come apprendimento e memoria12. I mitocondri sono gli organelli primari responsabili per la produzione di ATP e bioenergetica neuronale. La disfunzione mitocondriale è conosciuta per essere associato con i deficit relativi all'età nelle aree del cervello che sono legati alla memoria di navigazione spaziale, come l' ippocampo13. Perché il trattamento craniale con rosso/NIR luce soprattutto atti di modulazione della bioenergetica mitocondriale, dosaggio sufficiente di luce trasportata all'ippocampo può provocare il miglioramento della memoria spaziale i risultati14.

L'obiettivo del protocollo attuale è quello di illustrare la procedura PBMT di transcranial in topi, facendo uso di bassi livelli di luce rossa. Vengono descritte le misure di trasmissione della luce di laser richiesto attraverso i tessuti testa dei topi invecchiati. Inoltre, labirinto di Barnes, come un apprendimento spaziale ippocampo-dipendente e compito di memoria e i livelli di ATP hippocampal, come un indice di bioenergetica, sono utilizzati per una valutazione dell'impatto di trattamento negli animali.

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Protocollo

Tutte le procedure sono state effettuate in conformità con la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health (NIH; Pubblicazione n. 85-23, rivisto nel 1985) e approvato dal comitato etico regionale di Tabriz University of Medical Sciences.

Attenzione: Questo protocollo include l'applicazione di strumenti laser di classe 3B e richiederà una formazione adeguata e aderenza alle linee guida di sicurezza. I laser di classe 3B possono danneggiare gravemente gli occhi e la pelle in grado di riscaldare. I laser di classe 3B non sono considerati un pericolo di ustione. Occhiali di protezione devono essere indossati in ogni momento durante il funzionamento il dispositivo laser.

1. gli esperimenti di trasmissione della luce di laser

Nota: Usato qui tre topi BALB/c maschili a 18 mesi sono stati ottenuti dall'animale facility di Tabriz University of Medical Sciences. Un laser a 60 mW (660 nm) con un fascio circolare forma di 2,5 mm di diametro è utilizzato come fonte di luce. La sorgente laser produce una luce polarizzata circolarmente con un profilo di intensità gaussiana ed è gestita in modalità onda continua. Un misuratore di potenza commerciale fotodiodo con una risoluzione di nW 10, un'area attiva di 1cm quadrato2 fotodiodo e un intervallo di risposta spettrale da 400 a 1100 nm è utilizzato per misurare la potenza di luce trasmessa attraverso i campioni.

  1. Preparazione del campione
    1. Al fine di ottenere campioni freschi, profondamente anestetizzare il mouse con una miscela di ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
    2. Sezionare la testa del mouse con le forbici normali, a partire dal punto situato appena sopra le spalle.
    3. Ruotare la testa in modo che il lato ventrale della mascella rivolta verso l'alto. Far scorrere angolato dissezione Forbici senza intoppi attraverso la cavità orale fino a quando la resistenza della giunzione mandibular è notata. Tagliare tutti i grandi muscoli che collegano l'osso della mandibola al cranio e gettarli.
    4. Togliere le ossa palatine, usando le forbici angolate dissezione.
    5. Eliminare tutta la carne che circonda il cranio, usando il forcipe curvo.
    6. Sezionare la parte inferiore del cranio e poi prendere attentamente il cervello fuori il restante osso del cranio, con una spatola curva.
    7. Difficoltà il tessuto di cervello intatto in un gel di agarosio al 2%, quindi il tessuto sarà adatto per affettare.
      Nota: Al fine di ottenere un cranio intatto plus del cuoio capelluto del campione, il tessuto cerebrale dovrebbe essere rimosso dal lato ventrale della testa dell'animale senza alcun danno alla parte dorsale della testa.
  2. Procedura per affettare del cervello
    1. Applicare una goccia di colla a presa rapida (~0.05 mL) sulla superficie del blocco di montaggio vibratome.
    2. Attentamente fissare il blocco di agarosio vibratome blocco di montaggio in modo che la superficie ventrale del cervello sia rivolto verso il basso e regolare la sua posizione.
    3. Leggermente corrispondere la lama del vibratome alla superficie superiore del blocco dell'agarosi e registrare il valore di taglio dal livello elementare.
    4. Riempire il serbatoio del vibratome con soluzione salina normale ghiacciata.
    5. Regolare i parametri del vibratome (ad es., lo spessore fetta [1 mm] velocità [5 di 5 unità periferica] e frequenza di vibrazione [5 di 5 unità periferica]) per ottenere affettare soddisfacente.
    6. Tagliare trasversalmente il cervello in una fetta con uno spessore di 1.000 µm.
      Nota: La sezione è la parte del tessuto cerebrale delimitata da superficie corticale e un aereo posizionato 1.000 µm inferiore alla superficie corticale (ippocampo dorsale).
    7. Aggiungere una goccia d'acqua (~0.05 mL) sulla superficie del vetro ottico e mettere la fetta di cervello su di esso. Quindi, aggiungere una goccia di acqua nel cervello fetta e posizionare con attenzione il secondo vetro ottico su di esso.
      Nota: Una goccia d'acqua deve essere aggiunto per i limiti di vetro del campione al fine di prevenire tessuto asciugatura e luce scattering da superfici ruvide.
  3. Misurazione della trasmissione della luce attraverso i tessuti testa
    1. Impostare l'apparecchiatura ottica, incluso il dispositivo laser, che riflettono specchi e unità di misuratore di potenza.
      Attenzione: Indossare occhiali di protezione occhio prima di accendere il laser.
    2. In assenza di un campione sul misuratore di alimentazione, accendere il dispositivo laser e di focalizzare il fascio laser sullo specchio che si trova a debita distanza per guidare il fascio perpendicolare alla superficie attiva del fotodiodo.
      Nota: Misure di trasmissione della luce devono essere eseguite in una camera oscura a temperatura ambiente (23-25 ° C), entro 30 min dopo aver estratto i tessuti testa.
    3. Eseguire misurazioni sul tessuto cerebrale a fette.
      1. Posizionare due vetri ottici in bianco sulla superficie del misuratore di potenza.
      2. Leggere la potenza di luce trasmessa (ho0) dal misuratore di potenza schermo e registrare il valore.
      3. Delicatamente il campione di cervello, che è compreso da due vetri ottici, viene posto sulla superficie del misuratore di potenza, di focalizzare il fascio su zona rispettiva del tessuto, leggere la potenza trasmessa e registrare il valore.
    4. Eseguire misurazioni sul cranio e del cuoio capelluto.
      1. Posto un vetro ottico vuoto sulla superficie dello strumento.
      2. Leggere la potenza di luce trasmessa (ho0) dal misuratore di potenza schermo e registrare il valore.
      3. Leggermente posto un vetro ottico con il cranio fresco plus del cuoio capelluto tessuto sulla superficie del misuratore di potenza, corrisponde il fascio di luce sulla zona di bregma, leggere la potenza trasmessa e registrare il valore.
      4. Al fine di massimizzare il rapporto segnale-rumore, ripetere la misurazione di trasmissione della luce almeno 3 x per tutti i campioni.
        Nota: La zona di bregma è posizionata un circa 3 mm rostrale a una linea tracciata attraverso la base anteriore delle orecchie. Lo spessore del tessuto del cranio e del cuoio capelluto è misurato da una pinza standard.

2. fotobiomodulazione terapia (PBMT)

Nota: Sono stati utilizzati topi BALB/c maschi quarantacinque assegnati a tre gruppi di 15 topi ogni. I gruppi erano composti da giovani-controllo topi (2 mesi) che hanno ricevuto sham-PBMT, invecchiato-controllo topi (18 mesi di età) che hanno ricevuto sham-PBMT e topi di età-PBMT (18 mesi di età) che hanno ricevuto PBMT. Il trattamento di sham-PBMT ha consistito del trattamento identico per il PBMT gruppo ma con il laser inattivo. I topi sono stati ottenuti dall'animale facility di Tabriz University of Medical Sciences e sono stati alloggiati nell'animale tenendo unità di neuroscienze Research Center (NSRC) a 24-25 ° C e 55% di umidità relativa, con una luce di 12 h e fotoperiodo scuro h 12. Cibo e acqua sono stati forniti ad libitum. Tutti i topi sono stati acclimatati per almeno 1 settimana prima del trattamento.

  1. Procedura di trattamento laser
    Nota: Un diodo laser GaAlAs con modalità onda continua a 660 nm è stato utilizzato per il trattamento di PBMT di transcranial. Il dispositivo laser è stato operato presso una potenza di 200 mW ± 2 e un'irradiazione di 6,66 W/cm2, con un formato di punto di 0,03 cm2. Un fluence medio di 99,9 J/cm2 per ogni sessione è stato consegnato alla superficie del cuoio capelluto per 15 s di irradiazione. L'irradiazione è stata amministrata 1 x al giorno per 2 settimane consecutive.
    1. Portare i topi nelle loro gabbie casa nella stanza di terapia, circa 20 min prima di iniziare il trattamento.
    2. Collegare un dispositivo di protezione elettrico alla presa a muro.
    3. Inserire la spina dell'apparecchio laser in un dispositivo di protezione elettrico.
    4. Coprire la punta della sonda laser con una pellicola di nylon trasparente al fine di evitare eventuali graffi alla superficie.
    5. Collegare delicatamente la sonda al canale del dispositivo laser.
    6. Accendere il dispositivo laser e attendere alcuni secondi per esso per riscaldarsi.
    7. Regolare i parametri del laser per trattamenti e massaggi, tra cui la modalità di tempo e il funzionamento di irradiazione.
    8. In assenza di eventuali campioni, è necessario determinare la potenza media del laser contattando la punta della sonda e l'area attiva del misuratore di potenza del dispositivo laser. Registrare il valore.
    9. Ripetere il processo di calibrazione (passo 2.1.8) almeno 5x, leggere i poteri degli incidenti dal misuratore di potenza schermo e registrare i valori.
    10. Delicatamente tenere un mouse per la pelle dorsale del collo dell'animale nel palmo di una mano e immobilizzare la testa.
      Nota: Nel protocollo attuale, la sonda laser è posta sulla zona di bregma, che è ~ 3 mm rostrale a una linea tracciata tra la base interna delle orecchie.
    11. Leggermente e posizionare la punta della sonda direttamente sul cuoio capelluto al midline, circa 3 mm rostrale a una linea tracciata attraverso la base anteriore delle orecchie.
      Nota: Tenere la sonda in un angolo di circa 45° al piano dell'addome.
    12. Al fine di evitare l'irradiazione diretta agli occhi dell'animale, primo contatto la punta della sonda sulla testa e, quindi, accendere il dispositivo laser.
    13. Accendere il laser e tenere stabile la sonda fino al completamento dell'irradiazione.
    14. Dopo la fine della terapia, ritirare la sonda laser dalla testa e delicatamente tornare il mouse alla sua gabbia.
    15. Spegnere il dispositivo laser e staccare la sonda dal dispositivo.
    16. Pulire la sonda laser con un detergente appropriato ottico.
    17. Trasferire i topi all'alloggio degli animali.

3. comportamentale compiti

  1. Prova in campo aperto
    1. Valutare il locomotore attività di ogni mouse dalla distanza totale percorsa durante una prova di campo aperto, come descritto in precedenza15.
  2. Compito del labirinto di Barnes
    1. Apparato
      Nota: L'attività di apprendimento e la memoria spaziale è eseguita in un labirinto di Barnes16. L'apparecchio utilizzato per questa attività neurobehavioral è costituito da una piattaforma circolare in legno nero (95 cm di diametro) con 20 equidistante, 5 cm-diametro fori circolari che si trovano sulla piattaforma, 3cm dal perimetro. L'apparato è elevato 50 cm dal pavimento per impedire che l'animale arrampicata verso il basso. Una scatola di fuga di plastica nero mobile (cm 20 x 15 x 5 cm) è collocato sotto il foro di fuga. Un labirinto nero è utilizzato per il test topi bianchi, e un nero opaco deve essere posto sotto il labirinto quando viene utilizzato un software di sistema di tracciamento.
      1. Posizionare l'apparato di labirinto al centro di una camera tranquilla con brillante illuminazione ambientale.
      2. Inserire un segno di "Non entrare" all'esterno della porta della camera di attività.
      3. Allegare cues visivo-spaziale ai muri perimetrali.
      4. Posizionare una videocamera digitale sopra la piattaforma di labirinto.
      5. Pulire la superficie della piattaforma labirinto con etanolo al 70% per rimuovere indesiderati segnali olfattivi.
      6. Aggiungere una piccola quantità di biancheria da casa gabbia dell'animale all'interno della finestra di fuga per servire come un segnale olfattivo.
    2. Sessione di adattamento
      1. Portare ogni mouse al compito camera circa 30 min prima dell'inizio dell'esperimento, in modo che il mouse per diventare abituati.
      2. Rimuovere il mouse dalla sua gabbia e appoggiare delicatamente l'animale nella finestra di fuga per 1 min.
    3. Sessione di allenamento
      Nota: La sessione di allenamento viene ripetuta per ogni mouse su 4 giorni consecutivi.
      1. Rimuovere delicatamente il mouse dalla casella di fuga.
      2. Posizionare il mouse al centro dell'arena; quindi, posizionare la camera di inizio sopra il mouse.
      3. Rimuovere la camera inizio dopo 10 s e consentire il mouse per esplorare l'arena per 3 min.
      4. Spostare tranquillamente per l'area computer e mettere sulle cuffie con eliminazione del rumore.
      5. Innescare uno stimolo uditivo negativo costituito da un gran rumore bianco di circa 80 dB a livello di piattaforma e iniziare videoregistrando il mouse.
      6. Spegnere il rumore bianco e fermare videoregistrazione quando il mouse entra nella finestra di fuga. Permettere all'animale di rimanere indisturbato nella casella per 1 min.
      7. Rimuovere il mouse dalla casella di fuga e rimetterlo nella sua gabbia.
      8. Ripetere i passaggi da 3.4.2 attraverso 3.4.7 4 volte al giorno, con intervalli di 3 min tra prove ripetute.
        Nota: Tra tutte le prove, rimuovere qualsiasi urina o feci dalla superficie arena e pulire il labirinto con etanolo al 70%.
    4. Sessione di prova della sonda
      1. Dopo l'ultima prova di addestramento, 24 ore più tardi, rimuovere la casella di fuga dalla piattaforma labirinto e ripetere i passaggi da 3.4.2 attraverso 3.4.5.
      2. Dopo 3 minuti, spegnere il rumore bianco e fermare videoregistrazione. Rimuovere il mouse dall'arena labirinto e rimetterlo nella sua gabbia.
      3. Dopo che tutti gli animali sono stati testati, pulire la piattaforma labirinto e la camera di inizio. Spegnere le luci di sala e rimuovere il segno di "Non entrare" dalla porta.
      4. Conservare le registrazioni video dalle sessioni del test su un disco rigido esterno per ulteriori analisi.
      5. Impostare il video-monitoraggio programma ed estrarre i parametri di interesse dai video registrati, compreso il tempo di latenza per trovare il buco bersaglio durante 4 giorni di sessioni di allenamento e il tempo trascorso nel quadrante destinazione durante la sessione di prova di sonda.

4. valutazione biochimica

  1. Livelli di ATP nell'ippocampo
    1. Profondamente anestetizzare ogni mouse con un'iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina (100 mg per grammo di peso corporeo) e xilazina (10 mg per grammo di peso corporeo).
    2. Decapitare l'animale e rimuovere rapidamente il tessuto di cervello dal cranio.
    3. Sezionare l'ippocampo e omogeneizzare il tessuto nel buffer di ghiacciata del campione (fornito dal kit) con un omogeneizzatore del tessuto.
    4. Centrifugare immediatamente l'omogeneizzato a 2.000 x g per 3 min a 4 ° C.
    5. Trasferire il surnatante in una provetta pulita.
    6. Valutare i livelli di ATP hippocampal, utilizzando la lettura spettrofotometrica metodo come descritto in precedenza11.

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Risultati

Analisi statistiche

L'analisi statistica dei dati ottenuti dalle sessioni di allenamento di Barnes è stato analizzato mediante ANOVA a due vie; le altre prove comportamentistiche e analisi dei livelli di ATP hippocampal tra gruppi sono state effettuate da One-way ANOVA, seguita da test post-hoc di Tukey. Tutti i dati sono espressi come mezzi ± errore standard della media (SEM), fatta eccezione per i dati di tras...

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Discussione

Descriviamo un protocollo per lo svolgimento di una procedura PBMT di transcranial in topi. Questo protocollo è specificamente rivolto ai laboratori di neuroscienze che eseguono fotobiomodulazione ricerca incentrata su roditori. Tuttavia, questo protocollo può essere adattato ad altri animali di laboratorio che vengono spesso utilizzati nel campo della neuroscienza, come coniglio, gatto, cane o scimmia.

Attualmente, non esiste un crescente interesse nello studio transcranial PBMT con laser ros...

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Dichiarazioni

Stipendio di P.C. è stato sostenuto da (Dupont-Warren Fellowship e Livingston Award), il dipartimento di psichiatria della Harvard dal cervello e comportamento Research Foundation (NARSAD Young Investigator Award) e della FotoTe Inc. unrestricted grant. La donazione di droga è venuto da TEVA. Rimborso è venuto da Pharmacia Upjohn. P.C. ha ricevuto consultazione onorari da Janssen ricerca e sviluppo. P.C. ha depositato numerosi brevetti relazionati all'uso di luce vicina all'infrarosso in psichiatria. PhotoMedex, Inc fornito quattro dispositivi per uno studio clinico. P.C. ha ricevuto fondi senza restrizioni da Litecure Inc di condurre uno studio su transcranial fotobiomodulazione per il trattamento del disturbo depressivo e di condurre uno studio su soggetti sani. P.C. ha co-fondato una società (Niraxx luce terapeutica) focalizzata sullo sviluppo di nuove modalità di trattamento basate sulla luce vicina all'infrarosso; è anche un consulente per la stessa società. P.C. ha ricevuto finanziamenti da scienze cerebrale di condurre uno studio su transcranial fotobiomodulazione per disturbo d'ansia generalizzato. Gli altri autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione dalla Tabriz University of Medical Sciences (concessione n. 61019) S.S.-e. e una sovvenzione di pubblicazione da LiteCure LLC, Newark, DE, USA per l.d.t. Gli autori vorrei ringraziare il dipartimento di immunologia ed Education Development Center (EDC) di Tabriz University of Medical Sciences per la loro assistenza gentile.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
KetaminaAlfasan#1608234-01
XilazinaAlfasan#1608238-01
AgarosioSigma#A4679
SupercollaQuickstar
VibratomeCampden Instruments#MA752-707
Vela in vetro otticoMarca#7102
Potenza metroThor labs#PM100D
Rivelatore di fotodiodiThor labs#S121C
CaliperPittsburgh
GaAlAs laserThor Photomedicine
Etho VisionNoldus
CentrifugaFroilabo#SW14R
CuffieBlue Eagle
Fotocamera digitaleVisionlite#VCS2-E742H
Amplificatore SterioSony
EthanolHamonteb#665.128321
Labirinto di Barnesda Costom
Sigma#MAK190
lettore ElisaConsapevolezza#Stat Fax 2100
Kit di analisi ATP prodotto

Riferimenti

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