Modifica di genoma in linee cellulari di mammifero usando CRISPR-Cas

Sommario

CRISPR-Cas è una potente tecnologia per progettare i complessi genomi delle piante e degli animali. Qui, dettagliamo un protocollo efficiente modificare il genoma umano usando diverse endonucleasi di Cas. Evidenziamo considerazioni importanti e parametri di progettazione per ottimizzare l'efficienza di editing.

Abstract

Il sistema regolarmente interspaziati breve palindromi ripetizioni (CRISPR) cluster funziona naturalmente nell'immunità adattiva batterica, ma è stato reimpiegato con successo per l'ingegneria del genoma in molti organismi differenti. Più comunemente, il wildtype CRISPR associato 9 (Cas9) o dell'endonucleasi Cas12a sono usato per fendere siti specifici nel genoma, dopo che la rottura del doppio filamento di DNA è riparata tramite l'estremità non-omologo adesione via (NHEJ) o la riparazione di omologia-diretto ( Via di HDR) a seconda che sia un modello di donatore assenti o presenti rispettivamente. Ad oggi, sistemi CRISPR da diverse specie batteriche sono stati indicati per essere in grado di eseguire l'editing genomico in cellule di mammifero. Tuttavia, nonostante l'apparente semplicità della tecnologia, più parametri di progettazione devono essere considerati, che spesso lasciano gli utenti perplessi su come meglio per svolgere il loro genoma esperimenti di editing. Qui, descriviamo un flusso di lavoro completo dal disegno sperimentale identificazione di cloni di cellule che trasportano desiderati modificazioni del DNA, con l'obiettivo di facilitare la corretta esecuzione di esperimenti in linee cellulari di mammifero di editing genomico. Evidenziamo le considerazioni chiave per gli utenti di prendere nota, tra cui la scelta del sistema CRISPR, la lunghezza del distanziale e la progettazione di un modello di donatore singolo filamento oligodeoxynucleotide (ssODN). Immaginiamo che questo flusso di lavoro sarà utile per gli studi di gene knockout, modellazione di sforzi, la malattia o la generazione di reporter linee cellulari.

Introduzione

La capacità di progettare il genoma di ogni organismo vivente ha molte applicazioni biomediche e biotecnologiche, come la correzione di malattia-causare mutazioni, costruzione di accurati modelli cellulari per lo studio di malattia, o la generazione di agricolo colture con caratteristiche desiderabili. Poiché la girata del secolo, diverse tecnologie sono state sviluppate per l'ingegneria del genoma in cellule di mammiferi, tra cui meganucleases^1,2,3, zinco dito nucleasi^4,5, o trascrizione dell'effettore attivatore-com....

Protocollo

1. design di sgRNAs

1. Selezionare un appropriato sistema di CRISPR-Cas.
   1. In primo luogo, esaminare la regione di destinazione per le sequenze di PAM di tutte le nucleasi Cas9 e Cas12a che sono state indicate per essere funzionali in cellule di mammifero^16,21-32. Cinque enzimi utilizzati di frequente sono riportati nella tabella 1 , insieme ai loro rispettive PAMs.
      Nota: oltre l'endonucleasi elencati nella tabella 1, ci sono altri enzimi Cas meno comunemente usati che sono stati distribuiti con successo in cellule di mammifero, ad esempio una nucleasi Cas9 da Streptococcus thermophilus (St1Cas9) ch....

Risultati

Per eseguire un esperimento, un plasmide CRISPR esprimendo un sgRNA con destinazione che il locus di interesse deve essere clonato di editing di genoma. In primo luogo, il plasmide si digerisce con un enzima di limitazione (in genere un tipo di enzima di IIs) per linearizzare esso. Si consiglia di risolvere il prodotto digerito su gel di agarosio 1% a fianco di un plasmide non digerito per distinguere tra una digestione completa e parziale. Come non digeriti plasmidi sono supercoiled, tendono a correre più velocemente ri.......

Discussione

Il sistema CRISPR-Cas è una potente, rivoluzionaria tecnologia per progettare i genomi e trascrittomi delle piante e degli animali. Numerose specie batteriche sono state trovate per contenere sistemi CRISPR-Cas, che potenzialmente possono essere adattati per genoma e del trascrittoma fini⁴⁴di ingegneria. Anche se l'endonucleasi Cas9 da Streptococcus pyogenes (SpCas9) era il primo enzima per essere distribuito con successo in cellule umane^21,

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
T4 Polinucleotide chinasi (PNK)	NEB	M0201
Fosfatasi alcalina per gamberetti (rSAP)	NEB	M0371
Tris-acetato-EDTA (TAE) tampone, 50X	1a base	BUF-3000-50X4L	Diluire a 1X prima dell'uso. La soluzione 1X contiene 40 mM di Tris, 20 mM di acido acetico e 1 mM di EDTA.
Tampone Tris-EDTA (TE), 10X	1st Base	BUF-3020-10X4L	Diluire a 1X prima dell'uso. La soluzione 1X contiene 10 mM di Tris (pH 8,0) e 1 mM di EDTA.
BbsI	NEB	R0539
BsmBI	NEB	R0580
T4 DNA ligasi	NEB	M0202	400.000 unità/ml
Kit di legatura rapida	NEB	M2200	Un'alternativa alla DNA ligasi T4.
Kit di Legatura Rapida del DNA	Thermo Scientific	K1423	Un'alternativa alla DNA Ligasi T4.
Kit di clonazione TOPO PCR Zero Blunt	Thermo Scientific	451245	La soluzione salina viene fornita con il vettore TOPO nel kit.
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix	NEB	E2621L	Kit per montaggio Gibson.
One Shot Stbl3 Chimicamente Competente E.Coli	Thermo Scientific	C737303
Brodo LB (Lennox), polvere	Sigma Aldrich	L3022	Recostituire in ddH20 e autoclave prima dell'uso
Brodo con Agar (Lennox), polvere	Sigma Aldrich	L2897	Recostituire in ddH20 e autoclave prima dell'uso
SOC media	-	-	2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM di glucosio in 1 L di brodo LB
Ampicillina (sodio), oro di grado USP	Biotechnology	A-301
REDiant 2X PCR Mastermix	1a base	BIO-5185
Agarosio	1a base	BIO-1000
T7 Endonucleasi I	NEB	M0302
Kit Miniprep per l'estrazione del DNA plasmidico	Favorgen	FAPDE 300
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM),	iclone	SH30081,01	4,5 g/L di glucosio, senza L-glutammina, HEPES e L-glutammina piruvato di sodio
, 200mM	Gibco	25030
Penicillina-Streptomicina, 10.000U/mL	Gibco	15140
0,25% Tripsina-EDTA, 1X	Gibco	25200
Fetale Bovino Serum	Hyclone	SV30160	FBS viene inattivato a caldo prima dell'uso a 56 oC per 30 minuti
Soluzione salina tamponata con fosfato, 1X	Gibco	20012
jetPRIME	Polyplus Transfection	114-75
Soluzione di estrazione del DNA QuickExtract, 1.0	Epicentre	LUCG-QE09050
ISOLATE II Kit DNA genomico	Bioline	BIO-52067	Un'alternativa a QuickExtract
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà	NEB	M0491
Miscela di soluzioni di deossinucleotide (dNTP)	NEB	N0447
6X DNA Loading Dye	Thermo Scientific	R0611	10 mM Tris-HCl (pH 7,6) 0,03% blu bromofenolo, 0,03% xilene cianolo FF, 60% glicerolo, 60 mM EDTA
Proteasi Inhibitor Cocktail, Set3	Merck
Membrana in nitrocellulosa, 0,2µ m	Bio-Rad	1620112
tampone Tris-glicina-SDS, 10X	Bio-Rad	1610772	Diluire a 1X prima dell'uso. La soluzione 1x contiene 25 mM di Tris, 192 mM di glicina e 0,1% di SDS.
Tampone tris-glicina, 10X	1a base	BUF-2020	Diluire a 1X prima dell'uso. La soluzione 1x contiene 25 mM di Tris e 192 mM di glicina.
Ponceau S soluzione	Sigma Aldrich	P7170
TBS, 20X	1a base	BUF-3030	Diluire a 1X prima dell'uso. La soluzione 1x contiene 25 mM di Tris-HCl (pH 7,5) e 150 mM di NaCl.
Tween 20	Sigma Aldrich	P9416
Latte scremato per immunodosaggio	Nacalai Tesque	31149-75
WesternBright Sirius-femtogramma HRP	Advansta	K12043
Anticorpo per β-actina (C4)	Santa Cruz Biotechnology	sc-47778	Numero di lotto: C0916
Sistema MiSeq	Illumina	SY-410-1003
Spettrofotometro NanoDrop	Thermo Scientific	ND-2000
Fluorimetro Qubit	Thermo Scientific	Q33226
EVOS FL Cell Imaging System	Thermo Scientific	AMF4300
Plasmide CRISPR: pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	Sistema a vettore singolo: Il gRNA è espresso dallo stesso plasmide.
Plasmide CRISPR: pX601-AAV-CMV::NLS-SaCas9-NLS-3xHA-bGHpA	Addgene	61591	Sistema a vettore singolo: il gRNA è espresso dallo stesso plasmide.
Plasmide CRISPR: xCas9 3.7	Addgene	108379	Sistema a doppio vettore: il gRNA è espresso da un plasmide diverso.
Plasmide CRISPR: pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9	Addgene	42230	Sistema a vettore singolo: il gRNA è espresso dallo stesso plasmide.
Plasmide CRISPR: hCas9	Addgene	41815	Sistema a doppio vettore: il gRNA è espresso da un plasmide diverso.
Plasmide CRISPR: eSpCas9(1.1)	Addgene	71814	Sistema a vettore singolo: il gRNA è espresso dallo stesso plasmide.
Plasmide CRISPR: VP12 (SpCas9-HF1)	Addgene	72247	Sistema a doppio vettore: il gRNA è espresso da un plasmide diverso.

LB ad alto contenuto di glucosio reagente di trasfezione 539134