Fagocitosi del macrofago alveolare e la Clearance di batteri nei topi

Sommario

Qui segnaliamo i metodi comuni per analizzare la funzione fagocitica dei macrofagi alveolari murini e lo spazio batterico dal polmone. Questi metodi di studio in vitro fagocitosi dei branelli di isotiocianato di fluorescina e fagocitosi in vivo di Pseudomonas aeruginosa Green Fluorescent Protein. Inoltre descriviamo un metodo per l'eliminazione di p. aeruginosa nei topi.

Abstract

I macrofagi alveolari (ma) guardia spazio alveolare del polmone. Fagocitosi di AMs svolge un ruolo critico nella difesa contro l'invasione di agenti patogeni, la rimozione delle cellule morte o particelle estranee e nella risoluzione della risposta infiammatoria e rimodellamento del tessuto, i processi che sono mediati dai vari recettori di superficie di L'AMs. Qui, segnaliamo i metodi per l'analisi della funzione fagocitica di AMs utilizzando saggi in vitro e in vivo e strategie sperimentali per differenziare il modello riconoscimento del recettore - complemento recettore- e Fc gamma ricevitore-mediata fagocitosi. Infine, si discute un metodo per stabilire e caratterizzare un modello di polmonite di p. aeruginosa nei topi per valutare la clearance batterica in vivo. Questi saggi rappresentano i metodi più comuni per valutare le funzioni AM e possono anche essere utilizzati per studiare la funzione del macrofago e lo spazio batterico in altri organi.

Introduzione

AMs sono i fagociti residenti principali negli alveoli in fase di riposa e uno dei principali attori della risposta immunitaria innata attraverso il riconoscimento e interiorizzazione degli agenti patogeni per via inalatoria e particelle estranee^1,2. È stato segnalato che AMs sono essenziali per la rapida clearance di molti agenti patogeni polmonari come p. aeruginosa e Klebsiella polmonite^3,4, quindi una carenza nella fagocitosi AM si traduce spesso in respiratoria infezioni, come la polmonite acuta, che causano più alti tassi di mor....

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida della cura degli animali istituzionali e uso Committee (IACUC) della Eastern Virginia Medical School.

1. fluorescente perline fagocitosi

1. Eutanasia il mouse (C57BL/6J, vecchio 6 settimane, femmina) di CO₂ asfissia secondo protocolli IACUC per l'eutanasia etico degli animali.
2. Appoggiare il mouse pancia-up su una tavola di dissezione coperta con carta da cucina. Fissare le zampe con le sue membra spread-eagle e gancio una stringa sotto i suoi denti anteriori per tirare la testa indietro in modo che la trachea è ben diritta e livello.
3. Bagnato il mouse gola, petto e ....

Risultati

Abbiamo effettuato prima l'esperimento per analizzare fagocitosi da mouse primario AMs. Nel corso di tutte le analisi, abbiamo confrontato AMs isolati da topi WT e TRIM72^KO . Come illustrato nella Figura 1A, microscopia di fluorescenza ha rivelato che fagocitosi di FITC-vetro perline da mouse AMs primario si verifica dopo 1 h di incubazione. Figura 1 B Mostra l'analisi della fagocitosi.......

Discussione

Durante l'esecuzione di una funzione di scambio di gas, il polmone si confronta con insistenza allergeni, agenti patogeni e particelle estranee. AMs rappresentano la prima linea di difesa in virtù della loro funzione principale, vale a dire la fagocitosi. AMs anche coordinare con altre cellule immuni a distruggere gli agenti patogeni e nella risoluzione di infiammazione. Qui, abbiamo descritto metodi per valutare specificamente la fagocitosi di AMs isolato dal polmone del topo. Il protocollo presentato in questo manoscri.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Ago 18-G	Nipro Medical	CI+1832-2C	Biologia molecolare grado
2,7-diamminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Biologia molecolare grado
70% etanolo	Decon Labs Inc.	18C27B	Piastra a
96 pozzetti	Corning	3603	Tampone
lisi ACK	Life Technologies	A10492	Grado di biologia molecolare
Alexa fluor-488 Zymosan-A-bioparticle	Thermofisher Scientific	Z23373	di grado
C5	Sigma-Aldrich	C1163	Reagente biochimico
Centrifuga	Labnet International	C0160-R
Citocentrifuga Cytospin 4	Thermofisher Scientific	A78300101 Numero 11
DMEM Terreni di coltura cellulare	Gibco	11995-065	Grado di biologia cellulare
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grado di biologia cellulare
Flusso Citometro	BD Biosciences	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinze	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adatto per la dissezione di animali da laboratorio
Perle di lattice carbossilato FITC	Sigma-Aldrich	L4530	Grado di biologia cellulare
GFP-P. aeruginosa	ATCC	101045GFP	Adatto per  saggi di infezione cellulare
Piatto con fondo in vetro	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C
Siringa ad alta pressione	Penn-Century	FMJ-250	Adatto per l'uso su animali da laboratorio
Omogeneizzatore	Omni International	TH-01
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009	Microscopio a
fluorescenza invertita	Olympus	IX73
Ketamina Cloridrato	Hospira	CA-2904	Grado farmaceutico
Shandon Kwik-Diff Macchie	Thermofisher Scientific	9990700	Biologia cellulare
grado LB Agar	Fisher Scientific	BP1425	Biologia molecolare grado
LB Brodo	Fisher Scientific	BP1427	Biologia molecolare grado
MicroSprayer Aerosolizer	Penn-Century	IA-1C	Adatto per l'uso su animali da laboratorio
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Reagente grado
PBS	Gibco	20012-027	Biologia cellulare grado
coniglio anti-SRBC-IgG	MP Biomedicals	55806	Adatto per immuno-saggi
coniglio anti-SRBC-IgM	Cedarline Laboratories	CL9000-M	Adatto per immuno-saggi
Forbici	Miltex	5-2	Adatto per la dissezione di
animali da laboratorio Laringoscopio per piccoli animali	Penn-Century	LS-2	Adatto per uso su animali da laboratorio
Dodecil solfato di sodio (SDS)	BioRad	1610301	Forbici a molla di grado analitico
(Med)	Strumenti per la scienza fine	15012-12	Adatto per la dissezione di animali da laboratorio
Forbici a molla (piccole)	Strumenti per la scienza fine	91500-09	Adatto per la dissezione di animali da laboratorio
globuli rossi di pecora (SRBC)	MP Biomedicals	55876	SRBC lavati e conservati
Urea	Sigma-Aldrich	U5378	Xilazina di grado di biologia molecolare
	Akorn Animal Health	59399-110-20	Grado farmaceutico

di grado analitico di di grado di biologia cellulare Siero carente di biologia molecolare per biologia cellulare per grado analitico