Descriviamo gli approcci per la manipolazione dei geni nel sistema modello evolutivo Astyanax mexicanus. Sono descritti tre diverse tecniche: transgenesi Tol2-mediata, mirata manipolazione del genoma utilizzando CRISPR/Cas9 e atterramento di espressione utilizzando morpholinos. Questi strumenti dovrebbero facilitare l'indagine diretta di geni alla base della variazione tra forme di superficie e caverne.
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Articolo metodologico
Manipolazione di funzione del Gene in caverna messicano
In questo articolo
Sommario
Abstract
Grotta di animali forniscono un sistema convincente per indagare i meccanismi evolutivi e le basi genetiche alla base di cambiamenti in numerosi tratti complessi, tra cui la degenerazione degli occhi, albinismo, perdita di sonno, iperfagia ed elaborazione sensoriale. Specie di caverna da tutto il mondo visualizzare un'evoluzione convergente dei tratti morfologici e comportamentali a causa di pressioni ambientali condivisi tra sistemi differenti della caverna. Grotta diverse specie sono state studiate nell'impostazione del laboratorio. Il tetra messicano, Astyanax mexicanus, con forme di ipovedenti e non vedenti, ha fornito le comprensioni uniche nei processi biologici e molecolari che sono alla base dell'evoluzione dei tratti complessi ed è ben studiato come sistema modello emergenti. Mentre in a. mexicanus, sono stati identificati geni che regolano l'evoluzione di diversi processi biologici, la possibilità di convalidare un ruolo per singoli geni è stata limitata. L'applicazione della transgenesi e modifica del gene tecnologia ha il potenziale per superare questo ostacolo significativo e per studiare i meccanismi alla base dell'evoluzione dei tratti complessi. Qui, descriviamo una metodologia diversa per la manipolazione di espressione genica in a. mexicanus. Approcci includono l'uso di morpholinos, Tol2 transgenesi, e modelli di sistemi gene-editing, comunemente utilizzati in zebrafish e altri pesci di funzione del gene in a. mexicanusdi manipolare. Questi protocolli includono le descrizioni dettagliate delle procedure di allevamento temporizzata, la raccolta di uova fecondate, iniezioni e la selezione di animali geneticamente modificati. Questi approcci metodologici permetterà per l'indagine dei meccanismi genetici e neurali che l'evoluzione dei diversi tratti in a. mexicanus.
Introduzione
Da allora di Origine delle speciedi Darwin1, gli scienziati hanno acquisito profonde intuizioni come tratti sono modellati evolutivamente in risposta a pressioni ambientali ed ecologiche definite, grazie alla grotta organismi2. Il tetra messicano, a. mexicanus, consiste di eyed popolazioni 'superficie' ancestrale che popolano fiumi tutto il Messico e il Texas del sud e di almeno 29 popolazioni geograficamente isolate di morph grotta derivata che abitano la Sierra del Abra e altre zone del Messico nord-orientale3. Un numero di tratti di grotta-collegati è stato identificato in
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Protocollo
1. Morpholino oligo design
Nota: Sequenze per a. mexicanus sono disponibili attraverso National Center di Biotechnology Information (NCBI) Gene e NCBI SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), nonché dal browser genoma Ensembl (https://www.ensembl.org). Quando si progetta un morpholino per l'uso in entrambe le forme caverna-dimora e di superficie, è fondamentale per identificare qualsiasi variazione genetica tra il morphing in questa fase, quindi queste regioni genetiche possono essere evitate come bersagli per morpholinos. Qualsiasi variazione polimorfica all'interno di un sito di destinazione di morpholino può condurre all'associazione i....
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Risultati
Popolazioni più della caverna-dimora a. mexicanus mostrano ridotta sonno e veglia/attività aumentata rispetto al loro conspecifici di superficie-abitazione14. Ipocretina/orexina (HCRT) è un neuropeptide altamente conservato, che agisce per aumentare lo stato di Veglia, e aberrazioni nella via HCRT causano narcolessia in esseri umani ed altri mammiferi47,48. Precedentemente abbiamo dimostrato quella grotta a. mexicanus han.......
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Discussione
Qui, abbiamo fornito una metodologia per la manipolazione di funzione del gene usando morpholinos, CRISPR/Cas9 gene editing e metodologia di transgenesi. La ricchezza della tecnologia genetica e l'ottimizzazione di questi sistemi in zebrafish consentirà probabilmente per il trasferimento di questi strumenti a. mexicanus con facilità52. Recenti scoperte hanno utilizzato questi approcci in a. mexicanus, ma rimangono sottoutilizzate nell'indagine su diversi tratti morfologici, dello.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano Sunishka Thakur per la sua assistenza in genotipizzazione e imaging il pesce mutante oca2 rappresentato nella Figura 2. Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) award 1656574 a A.C.K, NSF award 1754321 J.K. e A.C.K e premio National Institutes of Health (NIH) R21NS105071 a A.C.K ed E.R.D.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Allevamento di pesci e forniture per uova | |||
| Rete per pesci a maglia fine | Penn Plax | BN4 | |
| Riscaldatore per acquario | Aqueon | 100106108 | |
| Trappole per uova NA | su misura | Progetta e crea una griglia di plastica da posizionare sul fondo della vasca per proteggere le uova | |
| Pipette di vetro | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Pipette di bulbi | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Agarosio | Fisher Scientific | BP160-500 | |
| Stampi per uova | Adaptive Science Tools | TU-1 | |
| Morpholino supplies | |||
| Control Morpholino | Gene Tools, LLC | Olio | |
| standard Custom Morpholino | Gene Tools, LLC | NA | |
| Fenolo Rosso | Sigma Aldrich | P0290-100ML | |
| em>CRISPR forniture | |||
| Cas9 Plasmide | AddGene | 46757 | |
| GoTaq DNA polimerasi | Promega | M3001 | |
| KOD Hot Start Taq | EMD Millipore | 71-842-3 | |
| Primer | Tecnologie DNA integrate Kit | personalizzato | |
| T7 Megascript Ambion | /Thermofisher | AM1333 | |
| miRNeasy Kit | Qiagen | 217004 | |
| mMessage mMachine T3 kit | Ambion/Thermofisher | AM1348 | |
| MinElute Kit | Qiagen | 28204 | |
| Tol2 transgenesis supplies | |||
| pCS-zT2TP plasmide | Kawakami et al., 2004 | Richiesta dell'autore | |
| CutSmart Buffer | New England Biolabs | B7204 | |
| NotI-HF Restriction Enzyme New | England Biolabs | R3189 | |
| PCR purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| SP6 mMessenger Kit | Ambion/Thermofisher | AM1340 | |
| Microinjection forniture | |||
| Tubi capillari in vetro | Sutter Instruments | BF100-58-10 | |
| Estrattore per pipette | Sutter Instruments | P-97 | |
| Picoinjector | Warner Instruments | PLI-100A | |
| Micromanipolatore | World Precision Instruments | M3301R | |
| per micromanipolatore | World Precision Instruments | M10 | |
| Micmanipulator Base | World Precision Instruments | Base in lamiera d'acciaio World Precision Instruments, 10 libbre |
Riferimenti
- Darwin, C. On the Origin of Species by Means of Natural Selection. , D. Appleton and Company. (1859).
- Culver, D. C., Pipan, T. The Biology of Caves and Other Subterranean Habitats. , Oxford University Press. New York, NY. (2009).
- Mitchell, R. W., Russell, W. H., Elliott, W. R.
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Ristampe e permessi
