Questo protocollo delinea le procedure sperimentali per caratterizzare il genoma cambiamenti nei livelli di modifiche post-traduzionali degli istoni (PTM) che si verificano in relazione la sovraespressione di proteine associate con ALS e malattia del Parkinson in Modelli di Saccharomyces cerevisiae . Dopo la separazione di SDS-PAGE, vengono rilevati livelli PTM istone individuali con gli anticorpi specifici di modifiche tramite Western blotting.
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Articolo metodologico
Alterazioni di modificazione post-traduzionale istone caratterizzante nel lievito Neurodegenerative Proteinopathy modelli
In questo articolo
Sommario
Abstract
Malattie neurodegenerative quali la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP), causano la perdita di centinaia di migliaia di vite ogni anno. Mancano opzioni di trattamento efficace in grado di fermare la progressione di malattia. Nonostante gli sforzi di sequenziamento estesa in grandi popolazioni di pazienti, la maggior parte dei casi di SLA e PD rimanga inspiegabile mutazioni genetiche da solo. Meccanismi di Epigenetics, quali la modificazione post-traduzionale delle proteine istoniche, possono essere coinvolti nella progressione e nella eziologia di malattia neurodegenerative e portano a nuovi bersagli per l'intervento farmaceutico. Modelli di mammiferi in vivo e in vitro di ALS e PD sono costosi e richiedono spesso prolungati e laboriosi protocolli sperimentali. Qui, descriviamo un approccio pratico, veloce e conveniente per determinare alterazioni del genoma nei livelli di modifiche dell'istone usando Saccharomyces cerevisiae come sistema modello. Questo protocollo permette di complete indagini cambiamenti epigenetici collegati al proteinopathies neurodegenerative che confermano i risultati precedenti in sistemi diversi modello allargando significativamente la nostra conoscenza della neurodegenerative malattia epigenoma.
Introduzione
Le malattie neurodegenerative sono malattie devastanti con poco o nessun opzioni di trattamento disponibili. Tra questi, la sclerosi laterale amiotrofica (ALS) e malattia di Parkinson (MDP) sono particolarmente terribile. Circa il 90% dei casi di SLA e PD sono considerati sporadici, che si verificano senza storia di famiglia della malattia, mentre i restanti casi funzionare in famiglie e sono generalmente collegati a un gene specifico mutazione1,2. Interessante, entrambe queste malattie sono associate con la proteina mislocalization e aggregazione3,4
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Protocollo
1. trasformare S. cerevisiae con costrutti di proteina associata proteinopathy neurodegenerative
- Crescere il lievito 303 wild type (WT) in brodo di lievito estratto peptone destrosio (YPD) pernottamento con agitazione (200 giri/min) a 30 ° C.
- Dopo 12−16 h di crescita, diluire il lievito a densità ottica a 600 nm (OD600) di 0,25 con YPD. Come 10 mL di coltura liquida lievito saranno necessari per ogni trasformazione, preparare 50 mL di coltura liquida lievito per cinque trasformazioni corrispondente al FUS, TDP-43, a-sinucleina e vettore unico (ccdB) costrutti, come pure una trasformazione di controllo negativo senza DNA. <....
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Risultati
Per illustrare questo metodo, ci si avvarrà dei risultati recentemente pubblicati30. WT umano FUS e TDP-43 overexpressed per 5 h, mentre WT α-synuclein overexpressed per 8 h. Un costrutto ccdB è stato usato come controllo negativo vettoriale. La figura 2 Mostra la soppressione della crescita nelle culture di solide e liquide. Lievito è stato raccolto come descritto e Western blotting con anticorpi specifici per modifica è stata effettu.......
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Discussione
Il protocollo descritto qui fornisce un modo semplice, conveniente e redditizio di categorizzare i cambiamenti PTM istone genoma correlati con proteinopathies neurodegenerative. Mentre ci sono altri modelli di ALS e PD, come in vitro murino e linee cellulari umane modelli32, S. cerevisiae rimane attraente per la sua facilità d'uso. Per esempio, modelli di lievito non richiedono l'uso di una cappa sterile, né richiedono l'allenamento che intensivo va con il lavoro della coltura de.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo Royena Tanaz, Huda Yousuf e Sadiqa Taasen per assistenza tecnica. Siamo molto grati al Prof James Shorter per la generosa fornitura di reagenti e intellettuale assistenza nella progettazione di esperimenti di ottimizzazione di saccarosio. Plasmidi di lievito sono stati un dono generoso da Prof. ssa Aaron Gitler (tra cui 303Gal-FUS; Plasmide Addgene # 29614). Brooklyn College e il centro di ricerca scienza avanzata (CUNY), nonché un NIH NINDS Postdoctoral transizione premio Advanced (K22NS09131401) supportato M.P.T.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| -Il suo integratore DO | Clontech | 630415 | |
| 10x Running Buffer | Mix: 141,65 g di glicina (ThermoFisher BP381-1), 30,3 g di base Tizma (Sigma-Aldrich T6066), 10 g di sodio dodecil solfato (Sigma-Aldrich L3771) e 1 L di acqua deionizzata, pH 8,8. | ||
| Gel di poliacrilammide al 12% | BIO-RAD | 456-1041 | |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Anti-acetil-istone H3 (Lys14) Anticorpo primario | MilliporeSigma | 07-353 (Lotto n. 2762291) | Diluizione: 1/1000 |
| Anti-acetil-istone H4 (Lys 16) Anticorpo primario | Abcam | ab109463 (Lotto n. GR187780) | Diluizione: 1/2000 |
| Anticorpo primario anti-acetil-istone H4 (Lys12) | Abcam | ab46983 (lotto n. GR71882) | Diluizione: 1/5000 |
| Anticorpo primario anti-dimetil-istone H3 (Lys36) | Abcam | ab9049 (lotto n. GR266894, GR3236147) | Diluizione: 1/1000 |
| Anticorpo primario H3 anti-istone | Abcam | ab24834 (Lotto n. GR236539, GR174196, GR3194335) | Controllo del carico nucleare; Diluizione: 1/2000 |
| Anticorpo primario anti-fosfo-istone H2B (Thr129) | Abcam | ab188292 (Lotto n. GR211874) | Diluizione: 1/1000 |
| Anticorpo primario anti-fosfo-istone H3 (Ser10) | Abcam | ab5176 (Lotto n. GR264582, GR192662, GR3217296) | Diluizione: 1/1000 |
| Biofotometro D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| Piastra per colture cellulari (100 x 20 mm) | Eppendorf | 30702118 | |
| Piastra per colture cellulari, 96 pozzetti | Eppendorf | 30730011 | |
| Centrifuge 5804/5804 R/5810/5810 R | Eppendorf | 22625501 | |
| Donkey Anti-Mouse IRDye 800 CW | LI-COR | 926-32212 (Lotto n. C60301-05, C61116-02, C80108-05) | Diluizione: 1/5000 |
| Donkey Anti-Rabbit IRDye 860 RD | LI-COR | 926-68073 (Lotto n. C60217-06, C70323-06, C70601-05, C80116-07) | Diluizione: 1/2500 |
| Etanolo | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Carta per macchie extra spessa (carta da filtro) | BIO-RAD | 1703968 | |
| Galattosio | Sigma-Aldrich | G0750 | Preparare una soluzione madre al 20% p/v. |
| Glucosio | Sigma-Aldrich | G8270 | Preparare una soluzione madre al 20% p/v. |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Preparare una soluzione al 50% p/v. |
| Membrane di trasferimento Immobilon-FL | MilliporeSigma | IPFL00010 | |
| Acetato di litio diidrato (LiAc) | Sigma-Aldrich | L4158 | Preparare una soluzione 1 M. |
| Caricamento della miscela di coloranti | : 1,2 g di sodio dodecil solfato, 6 mg di blu di bromofenolo (Sigma-Aldrich B8026), 4,7 ml di glicerolo, 1,2 ml di Trizma base 0,5M pH 6,8, 0,93 g di DL-ditiotreitolo (Sigma-Aldrich D0632) e 2,1 ml di acqua deionizzata. | ||
| Metanolo | ThermoFisher | A412-4 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoeresis Cell | BIO-RAD | 1658004 | |
| Pipetta multicanale | Eppendorf | 2231300045 | |
| NEB Restriction Enzyme Buffer 2.1, 10x | New England Bio Labs | 102855-152 | |
| Nhe I Restriction Enzyme | New England Bio Labs | 101228-710 | |
| Acqua priva di nucleasi | Qiagen | 129114 | |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biosciences | 2800-03 | |
| OmniTray Coltura cellulare trattata con coperchio sterile, PS (86 x 128 mm) | ThermoFisher | 165218 | |
| pAG303GAL-a-sinucleina-GFP | Dono di A. Gitler | ||
| pAG303GAL-ccdB | Addgene | 14133 | |
| pAG303Gal-FUS | Addgene | 29614 | |
| pAG303GAL-TDP-43 | Regalo da A. Gitler | ||
| Poli(glicole etilenico) (PEG) | Sigma-Aldrich | P4338 | Preparare una soluzione al 50% p/v. |
| Ponceau S Stain | Sigma-Aldrich | P3504 | Mix: 0,5 g 0,1% p/p di colorante Ponceau S, 5 mL di acido acetico 1% v/v (Sigma-Aldrich 320099) e 500 mL di acqua deionizzata. |
| Alimentatore di base PowerPac | BIO-RAD | 164-5050 | |
| Raffinosio pentaidrato | Sigma-Aldrich | R7630 | Preparare una soluzione madre al 10% p/v. |
| Salmon Sperm DNA | Agilent Tech | 201190 | |
| SD-His piastre | Mix: 20 g di Agar (Sigma-Aldrich A1296), 0,77 g di integratore di DO -His, 6,7 g di lievito base azotata senza aminoacidi (ThermoFisher 291920) e 900 ml di acqua deionizzata. | ||
| di piastre | : 20 g di Agar, 0,77 g di integratore di DO -His, 6,7 g di base azotata di lievito senza aminoacidi, 100 ml di soluzione di galattosio e 900 ml di acqua deionizzata. | ||
| caricamento del dodecil solfato di sodio | Conservare a -20 oC. 6X, Miscelare: 1,2 g di sodio dodecil solfato, 6 mg di blu di bromofenolo, 0,93 g di DL-ditiotreitolo, 2,1 ml di acqua deionizzata, 4,7 ml di glicerolo e 1,2 ml di 0,5 ml di base Trizma, pH 6,8. | ||
| Idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | Preparare una soluzione 0,2 M. |
| Saccarosio | Sigma-Aldrich | 84097 | Preparare una soluzione madre al 20% p/v. |
| TBS + 0,1% Tween 20 (TBST) | Miscelare: 100 mL 10X TBS, 1 mL Tween 20 (Sigma-Aldrich P7949) e 900 mL di acqua deionizzata. | ||
| Tampone di blocco TBS | LI-COR | 927-5000 | |
| Trans-Blot SD Cella di trasferimento elettroforetica semi-secca | BIO-RAD | 170-3940 | |
| di tamponi | di trasferimento: 22,5 g di glicina, 4,84 g di base Tizma, 400 ml di metanolo, 1 g di sodio dodecil solfato e 1,6 l di acqua deionizzata. | ||
| Soluzione salina tamponata con tris (TBS) | 10X, 7,6 pH, soluzione: miscelare 24 g di base Trizma e 88 g di cloruro di sodio (Sigma-Aldrich S7653). Riempire fino a 1 L con acqua deionizzata. | ||
| WT 303 S. cerevisiae lievito | Regalo da J. Estratto di lievito più corto | ||
| Peptone Destrosio (YPD) | Sigma-Aldrich | Y1375 |
Riferimenti
- Landgrave-Gómez, J., Mercado-Gómez, O., Guevara-Guzmán, R. Epigenetic mechanisms in neurological and neurodegenerative diseases. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 58(2015).
- Paez-Colasante, X., Figueroa-Romero, C., Sakowski, S. A., Goutman, S. A., Feldman, E. L.
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Ristampe e permessi
