Articolo metodologico

Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino

DOI:

10.3791/59112

⸱

21 giugno 2019

 ,  , 
1Department of Molecular Biology and Biochemistry, Simon Fraser University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un metodo sensibile, rapido e discriminante di colorazione post-gel per immagini di RNA etichettati con aptamers RNA Mango I, II, III o IV, utilizzando gel nativi o denacilidi di gel poliacrilamina (PAGE). Dopo aver eseguito gel PAGE standard, l'RNA con etichettatura mango può essere facilmente macchiato con TO1-Biotin e quindi analizzato utilizzando lettori di fluorescenza comunemente disponibili.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I gel ponopazienti e denaclari poliacrilamide sono regolarmente utilizzati per caratterizzare la mobilità complessa della ribonucleoproteina (RNP) e per misurare rispettivamente la dimensione dell'RNA. Poiché molte tecniche di imaging gel utilizzano macchie non specifiche o costose sonde fluoroforo, sono altamente desiderabili metodologie sensibili, discriminanti ed economiche per l'imaging del gel. Le sequenze centrali di RNA Mango sono piccoli motivi di sequenza (19-22 nt) che, se chiusi da un gambo arbitrario dell'RNA, possono essere aggiunti in modo semplice ed economico a un RNA di interesse. Questi tag Mango si legano con un'alta affinità e specificità a un ligando fluoroforo tiazole-arancio chiamato TO1-Biotin, che diventa migliaia di volte più fluorescente dopo il legame. Qui mostriamo che Mango I, II, III e IV possono essere usati per immagini specifiche di RNA in gel ad alta sensibilità. Fino a 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel denatura possono essere rilevati da gel imbecilli in un buffer di imaging contenente potassio e 20 nM TO1-Biotin per 30 min. Dimostriamo la specificità del sistema con etichettatura mango mediante l'imaging di un RNA batterico 6S etichettato con mango nel contesto di una complessa miscela di RNA batterico totale.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il mango è un sistema di etichettatura dell'RNA costituito da un insieme di quattro piccoli aptamer fluorescenti RNA che si legano strettamente (rilegamento nanomolare) a semplici derivati del tiazolo-arancione (TO1-Biotin, Figura 1A)1,2,3 . Al momento del legame, la fluorescenza di questo ligando viene aumentata da 1.000 a 4.000 volte a seconda dell'aptamero specifico. L'elevata luminosità del sistema Mango, che per Mango III supera quella della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), combinata con l'affinità di legame nanomolare degli aptamori RNA Mango, lo permette di essere utilizzato sia nell'imaging che nella purificazione dell'RNA complessi2,4.

Le strutture a raggi X di Mango I5, II6e III7 sono state determinate ad alta risoluzione, e tutti e tre i pulsanti utilizzano un quadruplex di RNA per legare TO1-Biotin (Figura 1B–D). I nuclei compatti di tutti e tre gli aptamers sono isolati dalla sequenza esterna dell'RNA tramite motivi di adattatore compatto. Mango I e II utilizzano entrambi un adattatore di loop flessibile simile a GNRA per collegare i loro nuclei di Mango a un duplex DI RNA arbitrario (Figura 1B, C). Al contrario, Mango III utilizza un motivo triplex rigido per collegare il suo nucleo a un'elica arbitraria dell'RNA (Figura 1D, residui viola), mentre la struttura di Mango IV non è attualmente nota. Poiché il nucleo legante del ligando di ciascuno di questi aptamers è separato dalla sequenza esterna di RNA da questi adattatori elicoidali, sembra probabile che tutti possano essere semplicemente incorporati in una varietà di RNA. L'RNA regolatore 6S batterico (Mango I), i componenti del lievito spicchio (Mango I), e l'RNA umano 5S, U6 RNA, e uno scaRNA C/D (Mango II e IV) sono stati tutti etichettati con successo in questo modo2,8, suggerendo che molti gli RNA biologici possono essere etichettati utilizzando il sistema di aptameri RNA Mango.

Denatura e gel nativi sono comunemente utilizzati per studiare gli RNA. I gel di denatura sono spesso usati per giudicare la dimensione dell'RNA o l'elaborazione dell'RNA, ma in genere, nel caso di una macchia settentrionale, ad esempio, richiedono diversi passaggi lenti e sequenziali per generare un'immagine. Mentre altri aptameri fluorogeni dell'RNA, come RNA Spinach e Broccoli, sono stati utilizzati con successo per l'imaging in gel9, nessun sistema di aptameri fluorogenico fino ad oggi possiede l'elevata luminosità e affinità del sistema Mango, rendendolo di notevole interesse per studiare le capacità di imaging gel di Mango. In questo studio, ci siamo chiesti se il sistema RNA Mango potesse essere semplicemente esteso all'imaging gel, poiché le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di TO1-Biotin (510 nm e 535 nm, rispettivamente) sono appropriate per l'imaging nel canale eGFP comune alla maggior parte fluorescente strumentazione di scansione gel.

Il protocollo di colorazione post-gel qui presentato fornisce un modo rapido per rilevare specificamente le molecole di RNA etichettate con mango nei gel nativi e denatura del gel poliacrilammide (PAGE). Questo metodo di colorazione prevede gel di ammollo in un buffer contenente potassio e TO1-Biotina. Gli aptamers RNA Mango sono a base di G-quadruplex e il potassio è necessario per stabilizzare tali strutture. Utilizzando l'RNA trascritto da modelli minimi di DNA che codificano mango (vedi la sezione del protocollo), possiamo semplicemente rilevare appena 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel di denatura, utilizzando un protocollo di colorazione semplice. A differenza delle comuni macchie di acido nucleico non specifico (vedi Tabella dei materiali, riferite a SG da qui), possiamo identificare chiaramente l'RNA affettato dal mango anche quando nel campione sono presenti alte concentrazioni di RNA totale senza tag.

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Protocollo

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1. Preparazione dei reagenti

  1. Soluzione di post-staining TO1-Biotin (soluzione di colorazione gel)
    1. Fare 1 L di 1 M fosfato buffer a pH 7.2 a 25 s con l'aggiunta di 342 mL di 1 M di Na2HPO4 e 158 mL di 1 M NaH2PO4. Regolare il pH a 7,2 a 50 mM aggiungendo la soluzione fosfato appropriata. Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,2 m e conservare la soluzione in plastica a temperatura ambiente.
    2. Preparare 5x soluzione di colorazione gel (senza TO1-Biotin) come segue. Make up a 1 L soluzione mescolando 247.5 mL di ddH2O, 700 mL di 1 M KCl, 50 mL di 1 M fosfato buffer (pH 7.2), e 2.5 mL di Tween 20. Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,2 m e conservare la soluzione in materiale plastico. Può essere conservato a temperatura ambiente.
      NOTA: MgCl2 può essere aggiunto a questa soluzione se necessario in quanto può potenzialmente stabilizzare i complessi di RNA. Questo avrà un impatto modesto sul segnale fluorescente2.
    3. Fare una soluzione di colorazione gel 1x utilizzando la soluzione di colorazione gel 5x dal passaggio 1.1.2 e, subito prima dell'uso, integrarla con fluoroforo TO1-Biotin (vedi Tabella deimateriali) ad una concentrazione finale di 20 nM. Ad esempio, aggiungere 20 mL di 5x soluzione di colorazione gel a 80 mL di acqua deionizzata per fare 100 mL di 1x soluzione di colorazione gel, e aggiungere 2 l di uno stock di 1 mM TO1-Biotin (preparato in dimetilmide).
      NOTA: il coefficiente di estinzione per la tintura TO1-Biotin a 500 nm è di 63.000 M-1cm-1, misurato nella soluzione di colorazione1.
  2. Denatura PAGE (soluzione di caricamento gel di denatura 2x e soluzioni A, B, C, persulfato di ammonio e tetrametiletilenea)
    1. Preparare 50 mL di 2x denaturazione gel di carico soluzione mescolando 40 mL di formamide, 0,5 mL di 0,5 M di acido etilenediaminetracetracetico (EDTA, pH 8.0), e 9,5 mL ddH2O. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente. I coloranti di caricamento non vengono aggiunti a questa soluzione in quanto potrebbero oscurare l'imaging fluorescente.
    2. Preparare 2x colorante di carico gel denatura come segue. Quando si purificano l'RNA e gli oligonucleotidi di DNA, aggiungere 0,5 mL del 2,5% (w/v) blu bromofenolo (BB) e 0,5 mL del 2,5% (w/v) xylene cyanol (XC) alla soluzione descritta nel passaggio 1.2.1 e aggiungere 8,5 mL di ddH2O invece di 9,5 mL. La soluzione può essere conservata a temperatura ambiente.
    3. Preparare 100 mL di soluzione A pesando 200,2 g di urea (peso formula: 60,06 g/mol) e aggiungendolo a 312,5 mL del 40% 19:1 acrilammide:N,N'-metilenebisacrylamide. Mescolare con una barra di agitazione magnetica alla massima velocità fino a dissoluzione (circa 3 h) e costituisci la soluzione a 500 mL utilizzando ddH2O. Si noti che le concentrazioni finali sono 6.667 M urea e 25% 19:1 acrilammide:N,N'-metilenebisacrylamide. Conservare a 4 gradi centigradi in plastica pulita.
    4. Preparare 1 L della soluzione B pesando 400,4 g di urea e costituisce la soluzione a 1 L con ddH2O; mescolare fino a quando l'urea si è sciolta. La soluzione B può essere mantenuta a temperatura ambiente.
    5. Preparare la soluzione C (10x Tris-borate-EDTA [TBE]) come segue. Preparare 4 L di 10x TBE pesando 432 g di base Tris e 220 g di acido borico, aggiungendo 160 mL di 0,5 M EDTA con un pH di 8 (filtrato) e realizzando la soluzione a 4 L con ddH2O. Una grande scorta di questo buffer è fatto come viene utilizzato anche come gel buffer in esecuzione.
    6. Preparare il 10% di persofato di ammonio (APS) sciogliendo 1 g di APS in un volume totale di 10 mL di ddH2O. Conservare a 4 gradi centigradi.
    7. Tenere a portata di mano tetrametetileneneamina (TEMED). Conservarlo a 4 gradi centigradi insieme alla soluzione APS.
  3. NATIVE PAGE (soluzione di caricamento gel nativo 2x)
    1. Preparare 50 mL di 2x soluzione di caricamento gel nativo mescolando 25 mL di 100% glicerolo, 10 mL di 5x soluzione di colorazione gel, e 15 mL di ddH2O per fare la soluzione a 50 mL.
      NOTA: Come nella sezione del gel di devogliatura, i coloranti di caricamento possono essere aggiunti a questo stock, ma la loro aggiunta può potenzialmente oscurare il segnale fluorescente nel gel e, quindi, dovrebbe essere evitato.

2. Preparazione e caricamento di gel di denatura

  1. Preparare un gel di denatura con una percentuale appropriata seguendo la tabella 1. Si consideri il sistema di colata gel specifico; 30 mL gel sono comunemente utilizzati. La percentuale di gel appropriata può essere stimata utilizzando la Tabella 2: selezionare la percentuale di poliacrilammide in cui i coloranti BB e XC hanno motilità più veloci e più lente, rispettivamente, rispetto all'RNA di interesse, per garantire la separazione ad alta fila nelle dimensioni rilevanti serie.
  2. Mescolare le soluzioni A, B e C secondo la tabella 1 e aggiungere APS e TEMED immediatamente prima di versare il gel. Mescolare bene le soluzioni in plastici puliti.
  3. Versare la soluzione gel in un adeguato apparato di colata in gel, dopo aver assicurato che tutti i componenti siano scrupolosamente puliti. Sollevare un lato dell'apparato in modo che il gel sia leggermente inclinato durante la colata, per evitare che eventuali bolle d'aria rimangano intrappolate all'interno del gel stesso.
  4. Inserire il pettine desiderato e lasciarlo polimerizzare (circa 30 min). Osservare la polimerizzazione cercando da vicino un cambiamento nell'indice di rifrazione intorno ai pozze di gel. Preparare il serbatoio gel utilizzando 1x soluzione C (1x TBE) e rimuovere con attenzione il pettine. Utilizzando una siringa, aspirare i pozzi immediatamente prima del caricamento del campione.
  5. Preparare i campioni di denatura come segue. Aggiungere 2x soluzione di caricamento gel denaturazione ai campioni di RNA di interesse per rendere la soluzione di caricamento del gel di denatura 1x e la denatura del calore a 95 gradi centigradi per 5 minuti utilizzando un termociclore o un bagno d'acqua.
  6. Prima di caricare i campioni, raffreddarli ad aria di diversi minuti fino a quando non sono freschi al tatto. Caricare i campioni stratificandoli sul fondo di ogni pozzo, utilizzando punte di caricamento gel.
    NOTA: le punte rotonde possono essere utilizzate per gel di spessore di 1 mm o più; utilizzare punte piatte per gel più sottili.
  7. Eseguire i gel di denatura a temperatura ambiente. Assicurarsi che il wattaggio sia sufficientemente basso in modo che le lastre di vetro del sistema gel non si rompono.
    NOTA: Nel nostro laboratorio, 28 W per piastre 20 cm x 16 cm era sufficiente per questo scopo.

3. Preparazione e caricamento di gel nativi

  1. Preparare un gel nativo con una percentuale appropriata facendo riferimento alla tabella 3. Si consideri il sistema di colata gel specifico, ma tenere a mente che 30 mL gel sono comunemente utilizzati. Mescolare le soluzioni di 1x TBE, 40% 29:1 acrilamide:N,N'-methylenebisacrylamide, e glicerolo secondo la tabella 3e aggiungere APS e TEMED immediatamente prima di versare il gel. Procedere come descritto nei passaggi 2.3 e 2.4.
  2. Preparare campioni nativi aggiungendo 2x soluzione nativa di caricamento del gel ai campioni di RNA di interesse per rendere la soluzione 1x e permettergli di incubare a temperatura ambiente per 100 min prima di eseguire il gel per garantire il ripiegamento completo dell'RNA.
  3. Eseguire il gel nativo in una cella frigorifera di 4 gradi centigradi, assicurando che il wattaggio sia sufficientemente basso per non riscaldare il gel.
    NOTA: Nel nostro laboratorio, 14 W per piastre 20 cm x 16 cm era sufficiente per questo scopo.

4. Preparazione dell'RNA mediante essenza della trascrizione T7

NOTA: le sequenze di DNA utilizzate per la trascrizione di deflusso10 dei costrutti DI RNA Mango sono state ordinate commercialmente. In questo metodo, gli oligonucleotidi del DNA che contengono il complemento inverso (RC) sia della sequenza da trascrivere che del promotore T7 vengono ibridati in una sequenza di fili del primo promotore T7 e quindi trascritti in vitro. Di seguito, per ogni oligonucleotide, il RC della sequenza core Mango è mostrato in grassetto e il RC della regione promotore T7 è mostrato in corsivo. I residui nel carattere normale corrispondono a regioni elicoidali complementari altrimenti arbitrarie necessarie per consentire al nucleo di Mango di piegarsi correttamente.

Mango I: GCA CGT AC TCTC CTC TCC GCG TCC CTT CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA TA CT AAG
Mango II: GCA CGT AC TCTC CTC TTC CTC TCC TCT CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA CTA
Mango III: GGC ACG TAC GAA TAT ACC ACA TAC CAA TCC TTC CTT CGT ACG TGC CTA TAG TGA GTC GTA AAG
Mango IV: GCA CGT ACT CGC CTC ATC CTC ACC CT CT TCC TCG GTA CGT GCC TGT AGT GAG TCG TAT TAA AG
T7 Top Strand: CTT TAA TAC GAC TCA TAGA G

  1. Purificazione del gel preparativo degli oligonucleotidi del DNA
    1. Per una sintesi del DNA in scala 0.2, risospendere l'oligonucleotide del DNA deprotetto in 100 : L di ddH2O e 100 L di 2 volte colorante di carico denatura (dal punto 1.2.2). In questo caso, è preferibile includere i coloranti per il caricamento gel nella soluzione di carico alla stessa concentrazione del passaggio 1.2.2.
    2. Purificare l'oligonucleotide del DNA utilizzando un gel di denatura in scala preparativa da 50 mL della percentuale di poliacrilammide appropriata; utilizzare la Tabella 2 per scegliere la percentuale di gel. Ad esempio, utilizzare un gel 8% per una sequenza di 50 nt. Idealmente, il blu bromofenolo dovrebbe correre più veloce dell'oligonucleotide, e lo xilene cianol dovrebbe correre più lentamente.
      NOTA: Nel nostro laboratorio, tali gel sono stati lanciati utilizzando distanziali di colata che erano spessi 1,5 mm e un pettine a carica gel con pozzi che erano 2–2,5 cm di larghezza.
    3. Caricare 100 l delle soluzioni oligonucleotide del DNA preparate al punto 4.1.2 per gel preparatore, come descritto nei passaggi da 2,4 a 2,7.
    4. Asciugare con cura l'esterno del gel, rimuovere le lastre di vetro e coprire entrambi i lati del gel in un involucro di plastica. Posizionarlo su uno schermo di imaging fluorescente (le lastre di cromatografia a strato sottile con schienale in alluminio impregnate di fluoroforo sono una soluzione economica) e utilizzare una lampada a mano UV a lunghezza d'onda corta per visualizzare le bande di DNA mediante shadowing UV.
    5. Un'ombra croccante e ben definita deve essere osservata se la sintesi del DNA è di alta qualità. Contrassegnare le bande sull'involucro di plastica, utilizzando un pennarello permanente.
      NOTA: Proteggere la pelle e gli occhi dalla luce UV e mantenere le esposizioni brevi per evitare di danneggiare il campione di acido nucleico.
    6. Posizionare il gel su una lastra di vetro pulita, ritagliare con cura le bande contrassegnate e posizionare ogni frammento di gel in 400 .L di 300 mM NaCl. Eluire il DNA durante la notte, utilizzando un rotatore a temperatura ambiente.
    7. Recuperare l'eluente in un tubo di centrifuga pulito e aggiungere 2,5 equivalenti di etanolo per far precipitare il DNA. Vorticare bene e posizionare il tubo a -20 gradi centigradi per 30 min.
    8. Pellere il campione in una panca top centrifuga a 156.000 x g per 30 min a 4 gradi centigradi. Rimuovere con attenzione il supernatante e risospendere il pellet in ddH2O. Utilizzare uno spettrometro per determinare con precisione la concentrazione di oligonucleotide del DNA. Conservare il campione come stock di 10 M per comodità a -20 gradi centigradi.
  2. Trascrizione run-off e purificazione gel di campioni di RNA
    1. Preparare uno stock di tripofosfati 5x nucleoside (NTP) mescolando scorte NTP liquide costituite da una concentrazione finale di trifosfato di guanosina 40 mM (GTP, 11.400 M-1cm-1), 25 m citidino tripfosotti (CTP, 7.600 M-1cm-1), 25 mM trifosfato di adenosina (ATP, 5.000 M-1cm-1) e 10 mM di triptolode uridino (UTP, 10.000 M-1cm-1); tutti i coefficienti di estinzione a 260 nm.
      NOTA: Le scorte liquide o in polvere possono essere ottenute commercialmente. Se si preparano le scorte primarie dalla polvere, regolare attentamente il pH su un pH finale di 7,9, utilizzando 1 M NaOH. Aliquota lo stock in tubi di microcentrismo da 1,5 mL e conservarlo a -20 gradi centigradi.
    2. Preparare 100 mL di 10x T7 trascrizione di riserva tampone tamponando mescolando 25.6 mL di 1 M Tris-HCl, 14.4 mL di 1 M Tris base, 26 mL di 1 M MgCl2, 10 mL di 10% Triton X-100, e 0.637 g di spermide. Fare il magazzino ad un volume finale di 100 mL con l'aggiunta di ddH2O.
      NOTA: Un pH finale di 7,9 della soluzione 1x deve essere confermato utilizzando un misuratore di pH calibrato. Il 10x deve essere filtrato sterile e conservato a -20 gradi centigradi in aliquote di dimensioni adeguate.
    3. Eseguire la trascrizione come indicato di seguito.
      1. Aggiungere i seguenti reagenti per creare una concentrazione finale di 1x t7 memorizzazione buffer utilizzando il 10x T7 transcription buffer stock e ddH2O (dal passaggio 4.2.2), 1x NTPs, 10 mM di dithiothreitol (DTT), 1 sequenza di filamento superiore T7 (vedere sezione 4 Nota per il sequenza di DNA Mango purificata dal gel (passaggio 2.1) e enzima di polimerasi di RNA T7 (1 U/L).
      2. Vorticare, ruotare verso il basso e incubare la soluzione a 37 gradi centigradi per 2 ore o fino a quando non diventa torbida e si forma un precipitato bianco nella parte inferiore del tubo. Una trascrizione di 50-L dovrebbe dare come risultato 50 litri di RNA da 50 m dopo la purificazione del gel. Aggiungere un volume uguale di colorante denatura 2x e conservarlo a -20 gradi centigradi fino a quando non è pronto per la purificazione del gel.
    4. Gel-purificare l'RNA risultante come descritto nella sezione di purificazione del gel di oligonucleotidi del DNA seguendo i passi 4.1.2 - u20124.1.8, sostituendo il campione di RNA con il DNA.
      NOTA: l'RNA è estremamente sensibile alla degradazione di RNase, quindi assicurati che in tutti i passaggi, i guanti e un cappotto da laboratorio pulito siano indossati in ogni momento. Assicurarsi che tutti i campioni siano preparati e conservati in plastici monouso per proteggersi dalla contaminazione da RNase e lavare accuratamente le lastre di vetro con sapone caldo e acqua prima dell'uso, sciacquarle accuratamente con ddH2O e asciugare il vetro con l'assistenza dell'etanolo applicato da una bottiglia di compressione.
    5. Utilizzare 1 - L del campione di RNA finale e, utilizzando uno spettrofotometro a base di gocciolamento, determinare l'assorbimento a 260 nm. Utilizzando un coefficiente di estinzione determinato dal metodo vicino più vicino, calcolare la concentrazione di RNA e regolare la concentrazione del campione a 10 m con ddH2O per comodità. Conservare i campioni di RNA a -20 gradi centigradi.
  3. Escherichia coli estrazione totale dell'acido nucleico grezzo
    NOTA: il seguente protocollo è un esempio. Questo protocollo utilizza l'RNA Mango I-tagged 6S espresso endogenamente da un plasmide in E. coli, e l'induzione da questo plasmide è descritta altrove nel dettaglio4.
    1. Ai fini di questo studio, preparare 500 mL di cellule indotte sia per il mango pEcoli-RNA che per il plasmico pEcoli-T1 (le cellule sono indotte a un OD600nm di 1). Pellere le cellule e conservarle a -80 gradi centigradi prima dell'uso.
    2. Eseguire l'estrazione dell'RNA come segue.
      1. Prendere 0,5 mL del pellet di cellule pEcoli indotte e aggiungere 500 -L di fenolo equilibrato. Quindi, vortice il campione; la soluzione diventerà bianca lattea. Centrifuga alla massima velocità per 2 min per separare gli strati.
      2. Estrarre lo strato superiore, che sarà leggermente giallo, e ripetere il passo 4.3.2.1 aggiungendo un volume uguale di fenolo, centrifugando ed estraendo per un totale di 5x (o fino a quando lo strato intermedio, che è bianco opaco, va via e solo due strati chiari sono a sinistra).
      3. Aggiungere il volume acquoso estratto dal fenolo ad un volume uguale di cloroformio, vortice, quindi centrifugare alla massima velocità per 2 min.
      4. Estrarre lo strato acquoso e aggiungere NaCl ad una concentrazione finale di 300 mM. Precipitare l'acido nucleico risultante con l'aggiunta di 2,5 equivalenti di etanolo, vortice, spin down, e precipitare a -20 gradi centigradi per almeno 30 min.
      5. Pellet in una panca a 15,6 x 1.000 x g a 4 gradi centigradi per 30 min. rimuovere con attenzione il supernatante e risospendere il pellet in 100 gradi l di ddH2O.
      6. Aggiungere un passaggio di digestione DNase I a questa procedura, seguendo il protocollo11a cui si fa riferimento per ottenere l'RNA totale.
        NOTA: Vorticare vigorosamente fino a quando il pellet è completamente sciolto in ddH2O.

5. Colorazione post gel

  1. Preparare 1x soluzione di colorazione gel secondo la ricetta nel passaggio 1.1.3 e aggiungerlo a un contenitore di vetro pulito che è abbastanza ampio da adattarsi comodamente al gel.
    NOTA: I contenitori di vetro borosilicato con coperchi a scatto servono bene a questo scopo.
  2. Aggiungere abbastanza 1x soluzione di colorazione gel al contenitore in modo che il gel sia completamente coperto con la soluzione e il liquido sloshes sopra la parte superiore del gel quando è posto sul rotatore orbitale.
    NOTA: Il contenitore deve essere abbastanza grande da adattarsi al gel in modo che possa muoversi e avere abbastanza buffer nel contenitore per coprire completamente il gel.
  3. Una volta che il gel nativo o denatura ha terminato la corsa (sezione 2 o 3, rispettivamente), rimuovere il gel dall'apparato e tagliare i suoi pozzi. Può essere utile rimuovere un angolo del gel per l'orientamento più avanti nell'analisi.
  4. Trasferire con attenzione il gel alla soluzione di colorazione del gel 1x preparata al punto 5.2.
    NOTA: I gel sono fragili e inclini a rompersi quindi fate attenzione durante il trasferimento del gel. Tenere sempre il coperchio sul contenitore di colorazione in modo da non contaminare il gel.
  5. Posizionare il gel su un rotatore orbitale ad una velocità di 100 giri/mper per 30 min a temperatura ambiente.
    NOTA: Assicurarsi che il gel non si ripiega su se stesso; in caso contrario, l'RNA può diffondersi dal gel e quindi etichettare una parte diversa del gel.

6. Imaging RNA con tag Mango in gel

  1. Decant decant attentamente il buffer di imaging. Sciacquare rapidamente il gel con acqua, assicurandosi che rimanga abbastanza liquido da mantenere il gel leggermente mobile nel contenitore.
  2. Trasferire con attenzione il gel sull'imager. Trasferire raccogliendo accuratamente i lati del gel e posizionandolo sul vassoio dell'imager; in alternativa, il gel può essere versato lentamente sul vassoio. Assicurarsi che non ci siano bolle sotto il gel e che non ci sia liquido in eccesso sotto il gel. Una pipetta arrotolata sul gel può essere utile per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso.
    NOTA: Utilizzare un tovagliolo di carta per assorbire il liquido in eccesso.
  3. Prendete un'immagine gel, osservando la fluorescenza tra la lunghezza d'onda di eccitazione 510 nm e la lunghezza d'onda di emissione 535 nm (ad esempio, luce verde a impostazioni di fluorescenza a lunghezza d'onda di 520 nm sull'imager). Assicurarsi che le impostazioni siano completamente ottimizzate sullo strumento e seguire attentamente le istruzioni per lo strumento utilizzato.

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Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli RNA con tag Mango brevi sono stati preparati come descritto nella sezione del protocollo. Supponendo che la fluorescenza nelle condizioni di denaturazione sarebbe più difficile da osservare a causa della presenza di urea nei gel, abbiamo prima studiato la resistenza degli aptamers Mango all'urea, che agisce come denaturante acido nucleico. La Noiabbiamo scoperto che gli aptamers mango sono sostanzialmente resistenti alla denaturazione fino a una concentrazione di urea di circa 1 M (Fi...

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Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un vantaggio significativo del tag fluorescente Mango è che un singolo tag può essere utilizzato in più modi. L'elevata luminosità e affinità di questi aptamers li rendono utili non solo per la visualizzazione cellulare 2, ma anche per l'RNA in vitro o la purificazione rnP4. Pertanto, l'imaging gel estende la versatilità del tag Mango in modo semplice. La sensibilità all'imaging del gel di mango è leggermente inferiore a quella di una macchia settentrionale

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un brevetto è in sospeso sul sistema fluorogenico di Mango.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori ringraziano Razvan Cojocaru e Amir Abdolahzadeh per la loro assistenza tecnica e Lena Dolgosheina per la revisione del manoscritto. Il finanziamento è stato fornito per questo progetto da una sovvenzione operativa del Canadian Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) a P.J.U.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pettine spesso 0,8 mm 14 pozzetti per gel PAGE da 30 mLLabRepCo11956042
101-1000 &; L  punteFisher02-707-511
20-200 µ L bassa ritenzione  FisherScientific02-717-143
Acrilammide:N,N'-metilenebisacrilammide (40% 19:1)BioreagentiBP1406-1Tossicità acuta
Acrilammide:N,N'-metilenebisacrilammide (40% 29:1)FisherBP1408-1Tossicità acuta
AgarAnachemia02116-380
Piastra TLC con supporto in alluminioSigma-Aldrich
Amersham Imager 600GE Healthcare Lifesciences29083461
Persolfato di ammonioBiorad161-0700
Cellule BL21NEBC2527H
Acido boricoACPB-2940
Bromofenolo Sale sodico bluSigmaB8026-25G
ChloloformACPC3300
DitiotreitoloSigma Aldrich AlcoliD0632-5G
DNasi IThermoFisherEN0525
EDTA Sale disodicoACPE-4320
Etanolocommerciale 
Flat Gel Suggerimenti per il caricamentoCostarCS004854
Formamide 99%Alfa AesarA11076
Set di apparecchi in gel con distanziatori e pettiniLabRepCo41077017
Piatto in vetro con coperchio in plasticaPyrex1122963Dovrebbe essere abbastanza grande da contenere il tuo pezzo di gel
GlycerolAnachemia43567-540
ImageQuanTLGE Healthcare Lifesciences
IPTGInvitrogen15529-019
KClACPP-2940
MgCl2Caledron4903-01
MgSO4Sigma-AldrichM3409
NaClACPS-2830
NaOHBDHBDH9292
rotatore orbitaleLab-Line
FenoloInvitrogen15513-039
Gel rotondo Punte di caricamentoCostarCS004853
Fosfato di sodio bibasicoCaledron8120-1
Fosfato di sodio monobasicoCaledron8180-01
SYBRGoldThermoFisherS11494
T7 RNA polimerasiABME041
TEMEDSigma-AldrichT7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotina FluoroforoABMG955
Tris BaseFisherBP152-500
TriptoneFisherBP1421-500
Tween-20SigmaP9496-100
UreaFisherU15-3
Xilene CyanolSigmaX4126-10G
Estratto di lievitoBioshopYEX401.500
1164840001 dannose P016EAAN 464140468 29000605

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Autour, A., et al. Fluorogenic RNA Mango aptamers for imaging small non-coding RNAs in mammalian cells. Nature Communications. 9, 656(2018).
  3. Dolgosheina, E. V., Unrau, P. J. Fluorophore-binding RNA aptamers and their applications: Fluorophore-binding RNA aptamers. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2016).
  4. Panchapakesan, S. S., et al. Ribonucleoprotein Purification and Characterization using RNA Mango. RNA. , 1592-1599 (2017).
  5. Trachman, R. J. III, et al. Structural basis for high-affinity fluorophore binding and activation by RNA Mango. Nature Chemical Biology. 13, 807(2017).
  6. Trachman, R. J., et al. Crystal Structures of the Mango-II RNA Aptamer Reveal Heterogeneous Fluorophore Binding and Guide Engineering of Variants with Improved Selectivity and Brightness. Biochemistry. 57, 3544-3548 (2018).
  7. Trachman, R., et al. Mango-III is a compact fluorogenic RNA aptamer of unusual structural complexity. Nature Chemical Biology. , in review (2018).
  8. Panchapakesan, S. S. S., Jeng, S. C. Y., Unrau, P. J. RNA complex purification using high-affinity fluorescent RNA aptamer tags. Annals of the New York Academy of Sciences. , (2015).
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  10. Milligan, J. F., Groebe, D. R., Witherell, G. W., Uhlenbeck, O. C. Oligoribonucleotide synthesis using T7 RNA polymerase and synthetic DNA templates. Nucleic Acids Research. 15, 8783-8798 (1987).
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  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), pdb.prot4455 (2006).
  13. Tuma, R. S., et al. Characterization of SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain: A Dye Optimized for Use with 300-nm Ultraviolet Transilluminators. Analytical Biochemistry. 268, 278-288 (1999).
  14. Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Northern Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nature Protocols. 4, 37-43 (2009).
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