Visualizzazione fluorescente dell'RNA marcato al mango nei gel di poliacrilofofora tramite un metodo poststaino

Sommario

Qui presentiamo un metodo sensibile, rapido e discriminante di colorazione post-gel per immagini di RNA etichettati con aptamers RNA Mango I, II, III o IV, utilizzando gel nativi o denacilidi di gel poliacrilamina (PAGE). Dopo aver eseguito gel PAGE standard, l'RNA con etichettatura mango può essere facilmente macchiato con TO1-Biotin e quindi analizzato utilizzando lettori di fluorescenza comunemente disponibili.

Abstract

I gel ponopazienti e denaclari poliacrilamide sono regolarmente utilizzati per caratterizzare la mobilità complessa della ribonucleoproteina (RNP) e per misurare rispettivamente la dimensione dell'RNA. Poiché molte tecniche di imaging gel utilizzano macchie non specifiche o costose sonde fluoroforo, sono altamente desiderabili metodologie sensibili, discriminanti ed economiche per l'imaging del gel. Le sequenze centrali di RNA Mango sono piccoli motivi di sequenza (19-22 nt) che, se chiusi da un gambo arbitrario dell'RNA, possono essere aggiunti in modo semplice ed economico a un RNA di interesse. Questi tag Mango si legano con un'alta affinità e specificità a un ligando fluoroforo tiazole-arancio chiamato TO1-Biotin, che diventa migliaia di volte più fluorescente dopo il legame. Qui mostriamo che Mango I, II, III e IV possono essere usati per immagini specifiche di RNA in gel ad alta sensibilità. Fino a 62,5 fmol di RNA nei gel nativi e 125 fmol di RNA nei gel denatura possono essere rilevati da gel imbecilli in un buffer di imaging contenente potassio e 20 nM TO1-Biotin per 30 min. Dimostriamo la specificità del sistema con etichettatura mango mediante l'imaging di un RNA batterico 6S etichettato con mango nel contesto di una complessa miscela di RNA batterico totale.

Introduzione

Il mango è un sistema di etichettatura dell'RNA costituito da un insieme di quattro piccoli aptamer fluorescenti RNA che si legano strettamente (rilegamento nanomolare) a semplici derivati del tiazolo-arancione (TO1-Biotin, Figura 1A)^1,2,3 . Al momento del legame, la fluorescenza di questo ligando viene aumentata da 1.000 a 4.000 volte a seconda dell'aptamero specifico. L'elevata luminosità del sistema Mango, che per Mango III supera quella della proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), combinata con l'affinità di legame nanomolare degli ap....

Protocollo

1. Preparazione dei reagenti

1. Soluzione di post-staining TO1-Biotin (soluzione di colorazione gel)
   1. Fare 1 L di 1 M fosfato buffer a pH 7.2 a 25 s con l'aggiunta di 342 mL di 1 M di Na₂HPO₄ e 158 mL di 1 M NaH₂PO₄. Regolare il pH a 7,2 a 50 mM aggiungendo la soluzione fosfato appropriata. Filtro sterile utilizzando un filtro da 0,2 m e conservare la soluzione in plastica a temperatura ambiente.
   2. Preparare 5x soluzione di colorazione gel (senza TO1-Biotin) come segue. Make up a 1 L soluzione mescolando 247.5 mL di ddH₂O, 700 mL di 1 M KCl, 50 mL di 1 M fosfato buffer (p....

Risultati

Gli RNA con tag Mango brevi sono stati preparati come descritto nella sezione del protocollo. Supponendo che la fluorescenza nelle condizioni di denaturazione sarebbe più difficile da osservare a causa della presenza di urea nei gel, abbiamo prima studiato la resistenza degli aptamers Mango all'urea, che agisce come denaturante acido nucleico. La Noiabbiamo scoperto che gli aptamers mango sono sostanzialmente resistenti alla denaturazione fino a una concentrazione di urea di circa 1 M (Fi.......

Discussione

Un vantaggio significativo del tag fluorescente Mango è che un singolo tag può essere utilizzato in più modi. L'elevata luminosità e affinità di questi aptamers li rendono utili non solo per la visualizzazione cellulare 2, ma anche per l'RNA in vitro o la purificazione rnP⁴. Pertanto, l'imaging gel estende la versatilità del tag Mango in modo semplice. La sensibilità all'imaging del gel di mango è leggermente inferiore a quella di una macchia settentrionale

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pettine spesso 0,8 mm 14 pozzetti per gel PAGE da 30 mL	LabRepCo	11956042
101-1000 &; L  punte	Fisher	02-707-511
20-200 µ L bassa ritenzione  Fisher	Scientific	02-717-143
Acrilammide:N,N'-metilenebisacrilammide (40% 19:1)	Bioreagenti	BP1406-1	Tossicità acuta
Acrilammide:N,N'-metilenebisacrilammide (40% 29:1)	Fisher	BP1408-1	Tossicità acuta
Agar	Anachemia	02116-380
Piastra TLC con supporto in alluminio	Sigma-Aldrich
Amersham Imager 600	GE Healthcare Lifesciences	29083461
Persolfato di ammonio	Biorad	161-0700
Cellule BL21	NEB	C2527H
Acido borico	ACP	B-2940
Bromofenolo Sale sodico blu	Sigma	B8026-25G
Chloloform	ACP	C3300
Ditiotreitolo	Sigma Aldrich Alcoli	D0632-5G
DNasi I	ThermoFisher	EN0525
EDTA Sale disodico	ACP	E-4320
Etanolo	commerciale
Flat Gel Suggerimenti per il caricamento	Costar	CS004854
Formamide 99%	Alfa Aesar	A11076
Set di apparecchi in gel con distanziatori e pettini	LabRepCo	41077017
Piatto in vetro con coperchio in plastica	Pyrex	1122963	Dovrebbe essere abbastanza grande da contenere il tuo pezzo di gel
Glycerol	Anachemia	43567-540
ImageQuanTL	GE Healthcare Lifesciences
IPTG	Invitrogen	15529-019
KCl	ACP	P-2940
MgCl2	Caledron	4903-01
MgSO4	Sigma-Aldrich	M3409
NaCl	ACP	S-2830
NaOH	BDH	BDH9292
rotatore orbitale	Lab-Line
Fenolo	Invitrogen	15513-039
Gel rotondo Punte di caricamento	Costar	CS004853
Fosfato di sodio bibasico	Caledron	8120-1
Fosfato di sodio monobasico	Caledron	8180-01
SYBRGold	ThermoFisher	S11494
T7 RNA polimerasi	ABM	E041
TEMED	Sigma-Aldrich	T7024-50 ml
TO1-3PEG-Biotina Fluoroforo	ABM	G955
Tris Base	Fisher	BP152-500
Triptone	Fisher	BP1421-500
Tween-20	Sigma	P9496-100
Urea	Fisher	U15-3
Xilene Cyanol	Sigma	X4126-10G
Estratto di lievito	Bioshop	YEX401.500

1164840001 dannose P016EAAN 464140468 29000605