Articolo metodologico

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

DOI:

10.3791/59123

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22 gennaio 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

In questo articolo

Sommario

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Qui, un protocollo è presentato per l'incapsulamento e la coltura delle cellule in poly(ethylene glycol) (PEG) idrogeli funzionalizzati con un fluorogenic metalloproteinasi (MMP)-peptide degradabile. MMP cellulare e dell'attività metabolica sono misurati direttamente dalle culture idrogel utilizzando un lettore di micropiastre standard.

Abstract

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Sistemi di coltura cellulare (3D) tridimensionale spesso ricapitolano più strettamente in vivo risposte cellulari e funzioni rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D). Tuttavia, la misurazione della funzione delle cellule in cultura 3D è spesso più impegnativo. Molti saggi biologici richiedono il recupero di materiale cellulare che può essere difficile nelle culture 3D. Un modo per affrontare questa sfida è di sviluppare nuovi materiali che consentono una misurazione della funzione delle cellule all'interno del materiale. Qui, è presentato un metodo per la misurazione dell'attività di metalloproteasi (MMP) matrice cellulare in idrogel 3D in un formato a 96 pozzetti. In questo sistema, un idrogel di poly(ethylene glycol) (PEG) è funzionalizzato con un sensore di spaccabili MMP fluorogenic. Attività MMP cellulare è proporzionale all'intensità di fluorescenza e può essere misurata con un lettore di micropiastre standard. Miniaturizzazione di questo test in un formato a 96 pozzetti ridotto il tempo necessario per una impostazione sperimentale di 50% e reagente l'utilizzo del 80% per condizione rispetto alla precedente versione di 24 pozzetti del dosaggio. Questo test è anche compatibile con altre misure della funzione cellulare. Ad esempio, un'analisi di attività metabolica è dimostrata qui, che possono essere condotte simultaneamente con misure di attività MMP entro la stessa idrogel. Il dosaggio è dimostrato con cellule di melanoma umano incapsulate in una gamma di densità per determinare la densità di incapsulamento appropriata per il campo di funzionamento del test di semina cellulare. Dopo 24 h di incapsulamento di cellule, MMP e letture di attività metabolica erano proporzionale alla densità di semina cellulare. Mentre il dosaggio è dimostrato qui con un substrato degradabile fluorogenico, il dosaggio e la metodologia potrebbe essere adattati per una vasta gamma di sistemi di idrogel e altri sensori fluorescenti. Tale prova fornisce una piattaforma di coltura 3D pratica, efficiente e facilmente accessibile per una vasta gamma di applicazioni.

Introduzione

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Sistemi di tridimensionale (3D) cultura spesso più strettamente ricapitolare le risposte cellulari in vivo rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D), vedere diversi eccellenti pubblicazioni1,2,3 . Tuttavia, utilizzando sistemi di coltura 3D per misurare la funzione delle cellule è stato impegnativo a causa della difficoltà di recupero cellulare e ulteriore elaborazione del campione. Questa difficoltà limita la misura di molte funzioni cellulari in sistemi di coltura 3D. Per superare questa difficoltà, sono necessarie nuove tecniche che consentono u....

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Protocollo

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1. idrogel preparazione di componenti

  1. Sintetizzare i peptidi proteasi-degradabile fluorescenti come descritto altrove8, utilizzando dabcyl come il quencher e della fluorescina come la molecola fluorescente. Sciogliere il peptide in DMSO ad una concentrazione di 10 mM e conservare in un congelatore a-80 ° C in piccole aliquote (~ 30 µ l) per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
    Nota: Questi peptidi possono essere acquistati anche commercialmente. Questo protocollo richiede una cisteina C-terminale nella sequenza del peptide per abilitare incorporazione covalente nel reticolo polimerico idrogel.
  2. Preparare a....

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Risultati

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Il dosaggio attuale è stato adattato da un sistema di coltura di idrogel 3D precedentemente sviluppati e caratterizzati funzionalizzato con un fluorogenic MMP spaccabili sensore8. Il sensore MMP fluorogenic qui utilizzato è costituito da una sequenza peptidica, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Roberta) C (↓ indica il sito di clivaggio) che in precedenza è stato ottimizzato per la scissione di MMP-14 e MMP-1119. Il peptide è etichettato con una mole.......

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Discussione

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Coltura cellulare in vitro 3D ricapitola molti aspetti importanti dell'ambiente in vivo. Tuttavia, cultura 3D rende inoltre valutare la funzione delle cellule e segnalazione impegnativo, come molti saggi biologici richiedono recupero cellulare e un gran numero di cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un sistema di semplice cultura 3D che consente la misurazione della funzione cellulare senza ulteriore campione elaborazione aumenterebbe notevolmente l'utilità dei sistemi di coltura 3D. Il sistema 3D qui descritto può es.......

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori si desidera ringraziare Ohio cancro ricerca (OCR), OH, Stati Uniti d'America per il finanziamento di quest'opera così come King Saud University (KSU), Riyadh, KSA per sponsorizzare il primo autore. Peso molecolare del sensore fluorescente del peptide è stato misurato utilizzando matrice assistita, laser desorption-ionizzazione, spettrometria di massa (MALDI-TOF) tempo di volo con assistenza del Campus chimica strumento centro spettrometria di massa e proteomica Impianto presso la Ohio State University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1X Soluzione salina tamponata con fosfatoFisher Scientific10-010-049
Carbone attivo Sigma-AldrichC3345
Piastra nera a 96 pozzetti a fondo tondoBrand-Tech89093-600
Peptide di adesione cellulare (CRGDS)GenScript USA Inc.su misura
tipo I Life Technologies17100-017
destranoSigma-AldrichD4876
DMEM media ad alto glucosioInvitrogen11965118
Siero fetale bovino (FBS) Seradigm1500-500
Lettore di micropiastre a fluorescenza Emocitometro BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-glutamminaLife Technologies25030-081
Reticolante peptidico degradabile MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.misura
NaOHFisher ScientificS318500
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140-122
Resazurin (blu di Alamar)Life TechnologiesDAL1100
luce UV UVP95-0006-02
Enzima Collagenasi su

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  2. Duval, K., et al. Modeling Physiological Events in 2D vs. 3D Cell Culture. Ph....

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Idrogel 3DAttivit delle metalloproteinasi della matriceSaggio dell attivit metabolicaSensore fluorescenteLettore di micropiastreSoluzione precursore dell idrogelIncapsulamento cellularePolimerizzazione UVIntensit di fluorescenzaCellule di melanoma A375

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