Articolo metodologico

Misurazione della proteinasi metallica della matrice cellulare globale e l'attività metabolica in idrogel 3D

DOI:

10.3791/59123

⸱

22 gennaio 2019

 , 
1Department of Biomedical Engineering, The Ohio State University, 2The Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Arthur G. James Cancer Hospital and Richard J. Solove Research Institute, 3Biomedical Technology Department, King Saud University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui, un protocollo è presentato per l'incapsulamento e la coltura delle cellule in poly(ethylene glycol) (PEG) idrogeli funzionalizzati con un fluorogenic metalloproteinasi (MMP)-peptide degradabile. MMP cellulare e dell'attività metabolica sono misurati direttamente dalle culture idrogel utilizzando un lettore di micropiastre standard.

Abstract

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Sistemi di coltura cellulare (3D) tridimensionale spesso ricapitolano più strettamente in vivo risposte cellulari e funzioni rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D). Tuttavia, la misurazione della funzione delle cellule in cultura 3D è spesso più impegnativo. Molti saggi biologici richiedono il recupero di materiale cellulare che può essere difficile nelle culture 3D. Un modo per affrontare questa sfida è di sviluppare nuovi materiali che consentono una misurazione della funzione delle cellule all'interno del materiale. Qui, è presentato un metodo per la misurazione dell'attività di metalloproteasi (MMP) matrice cellulare in idrogel 3D in un formato a 96 pozzetti. In questo sistema, un idrogel di poly(ethylene glycol) (PEG) è funzionalizzato con un sensore di spaccabili MMP fluorogenic. Attività MMP cellulare è proporzionale all'intensità di fluorescenza e può essere misurata con un lettore di micropiastre standard. Miniaturizzazione di questo test in un formato a 96 pozzetti ridotto il tempo necessario per una impostazione sperimentale di 50% e reagente l'utilizzo del 80% per condizione rispetto alla precedente versione di 24 pozzetti del dosaggio. Questo test è anche compatibile con altre misure della funzione cellulare. Ad esempio, un'analisi di attività metabolica è dimostrata qui, che possono essere condotte simultaneamente con misure di attività MMP entro la stessa idrogel. Il dosaggio è dimostrato con cellule di melanoma umano incapsulate in una gamma di densità per determinare la densità di incapsulamento appropriata per il campo di funzionamento del test di semina cellulare. Dopo 24 h di incapsulamento di cellule, MMP e letture di attività metabolica erano proporzionale alla densità di semina cellulare. Mentre il dosaggio è dimostrato qui con un substrato degradabile fluorogenico, il dosaggio e la metodologia potrebbe essere adattati per una vasta gamma di sistemi di idrogel e altri sensori fluorescenti. Tale prova fornisce una piattaforma di coltura 3D pratica, efficiente e facilmente accessibile per una vasta gamma di applicazioni.

Introduzione

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Sistemi di tridimensionale (3D) cultura spesso più strettamente ricapitolare le risposte cellulari in vivo rispetto ai sistemi tradizionali cultura bidimensionale (2D), vedere diversi eccellenti pubblicazioni1,2,3 . Tuttavia, utilizzando sistemi di coltura 3D per misurare la funzione delle cellule è stato impegnativo a causa della difficoltà di recupero cellulare e ulteriore elaborazione del campione. Questa difficoltà limita la misura di molte funzioni cellulari in sistemi di coltura 3D. Per superare questa difficoltà, sono necessarie nuove tecniche che consentono una facile misurazione della funzione delle cellule all'interno di ambienti 3D. Un modo per rispondere a questa esigenza è lo sviluppo di materiali che non solo supportano la coltura cellulare 3D ma anche incorporare sensori per misurare la funzione delle cellule. Ad esempio, diversi sistemi di idrogel sono integrate moiety spaccabili di proteasi fluorogenic per abilitare la visualizzazione di attività della proteasi all'interno di ambienti 3D4,5,6,7. Mentre questi sistemi erano originariamente utilizzati per l'imaging al microscopio, questi sistemi possono essere adattati per l'uso in un'analisi di attività di metalloproteasi (MMP) matrice globale utilizzando un lettore di piastra standard, consentendo facile misurazione di una funzione di cella in un 3D ambiente8.

MMPs, una superfamiglia di proteasi zinco, giocano un ruolo critico nell'omeostasi del tessuto normale e in molte malattie. MMPs degrada e rimodellare la matrice extracellulare (ECM), fendere citochine e recettori di superficie e attivare altre MMPs9,10. MMPs giocano un ruolo critico in processi fisiologici quali la guarigione della ferita e in malattie come l'artrite, l'aterosclerosi, morbo di Alzheimer e cancro (Vedi recensioni in 9,10,11). Nel cancro, alti livelli di espressione di MMP sono fortemente correlati con metastasi e prognosi12. Inoltre, MMPs contribuiscono alla progressione del tumore, promuovendo l'invasione delle cellule di cancro e migrazione, processi cellulari che sono fenomeni intrinsecamente 3D13,14. Di conseguenza, c'è molto interesse per la capacità di misurare l'attività MMP in 3D cultura in molti contesti, tra cui gli studi biologici fondamentali e saggi di screening di stupefacenti.

Idrogeli PEG sono ampiamente usati per la coltura cellulare 3D a causa del loro alto contenuto di acqua, resistenza all'adsorbimento di proteine e la natura sintonizzabile. Idrogeli PEG funzionalizzati con un numero di moiety alla funzione diretta delle cellule, come ad esempio con peptidi mimetici ECM come RGD, RLD e IKVAV per facilitare l'adesione delle cellule, o diretta tethering di fattori di crescita quali trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) 15,16. Più recentemente, PEG idrogeli sono stati funzionalizzati con peptidi di sensore che consentono una misurazione della funzione delle cellule come ben5,8. In particolare, l'uso di un sistema di idrogel di PEG funzionalizzati con un fluorogenic MMP-degradabile misura peptide attivato di attività MMP cellulare in culture 3D con un lettore di piastra standard e non necessaria alcuna ulteriore elaborazione. Questi sistemi sono compatibili anche con altre misure della funzione cellulare, tra cui attività metabolica. Qui, un protocollo è descritto per la misurazione dell'attività MMP delle cellule coltivate in un 3D idrogel PEG funzionalizzati con un peptide MMP-degradabile fluorogenic e risultati presentati che dimostrano gli esperimenti di ottimizzazione iniziale necessari per l'uso di questo test. Cellule di melanoma umano (A375) sono state incapsulate nel caso degli idrogeli fluorogenic sopra una gamma di densità per determinare le densità di semina appropriate che sono all'interno della gamma di funzionamento del test di semina. Dopo 24 h di incapsulamento, MMP e attività metabolica sono stati misurati utilizzando un lettore di micropiastre standard. Successivamente, attività MMP è stata normalizzata per attività metabolica per determinare la densità di semina all'interno della gamma lineare del dosaggio. Infine, il coefficiente intra-piastra delle percentuali di variazione (% CV) sono stati calcolati tra triplici copie in modo da riflettere la riproducibilità dei risultati ottenuti. Questo metodo consente la coltura cellulare 3D semplice e veloce e facile misurazione dell'attività di proteasi con un campione minimo di elaborazione.

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Protocollo

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1. idrogel preparazione di componenti

  1. Sintetizzare i peptidi proteasi-degradabile fluorescenti come descritto altrove8, utilizzando dabcyl come il quencher e della fluorescina come la molecola fluorescente. Sciogliere il peptide in DMSO ad una concentrazione di 10 mM e conservare in un congelatore a-80 ° C in piccole aliquote (~ 30 µ l) per evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.
    Nota: Questi peptidi possono essere acquistati anche commercialmente. Questo protocollo richiede una cisteina C-terminale nella sequenza del peptide per abilitare incorporazione covalente nel reticolo polimerico idrogel.
  2. Preparare ammina di 8 braccio 40 kDa poli (glicol etilenico) (PEG)-norbornene (NB) come descritto17. Verificare la funzionalizzazione di gruppo fine superiore al 90% utilizzando 1H NMR. PEG-NB si dissolvono in sterile tampone fosfato (PBS) al 25% p/v e conservare in congelatore a-80 ° C in aliquote (~ 300 µ l).
    Nota: PEG funzionalizzati con norbornene può anche essere acquistato in commercio.
  3. Sintetizzare il foto-iniziatore litio fenile 2, 4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) come descritto altrove18. Sciogliere il giro in acqua sterile ad una concentrazione di 68 mM e conservare in congelatore-80 ° C in aliquote (~ 300 µ l).
    Nota: in alternativa, Irgacure (2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone) può essere utilizzato come foto-iniziatore. LAP e Irgacure possono essere acquistati in commercio.
  4. Sciogliere la MMP-degradabile crosslinker del peptide (KCGPQG↓IWGQCK) ed il peptide di adesione delle cellule (CRGDS) in acqua sterile ad una concentrazione di 200 mM e 100 mM rispettivamente e memorizzarli in un congelatore-80 ° C (~ 300 µ l e ~ 30 µ l) le aliquote, rispettivamente.

2. analisi media preparazione

  1. Preparare l'inattivati al calore, carbone spogliato siero bovino fetale (FBS) per il dosaggio MMP:
    Nota: Proteasi in FBS possono produrre un segnale di alta priorità bassa nel dosaggio di MMP; Pertanto, si raccomanda di inattivare a caldo e di carbone di legna i FB per il supporto di analisi della striscia.
    1. Inattivare 100ml di FBS di riscaldamento per 30 min a 55 ° C.
      Nota: 100 mL di FBS è stato utilizzato qui per aliquotare e conservazione a-20 ° C per un uso futuro. Volumi più piccoli possono essere utilizzati come necessario.
    2. Aggiungere 0,25% p/v di carbone attivo e 0.025% w/v di destrano una piccola quantità di FBS (circa 5 mL) e mescolare fino a formare un impasto. Quindi, aggiungere il resto degli FB e sotto agitazione per 30 minuti a 55 ° C.
    3. Centrifuga a 1.962 x g per 20 min a 4 ° C. Quindi trasferire il surnatante su un'altra nave.
    4. Ripetere il punto 2.1.2 ma a 37 ° C, seguita da punto 2.1.3. Sterilizzare il supernatante utilizzando un filtro di 0,45 µm e quindi filtro 0,2 µm.
  2. Preparare il supporto di analisi utilizzando supporti completati con 1% carbone spogliato FBS, 2 mM L-Glutammina, 10 U/mL di penicillina, 10 µ g/mL di streptomicina.
    Nota: Media senza rosso fenolo è raccomandato perché ha meno interferenze di fluorescenza. Altre aggiunte per il supporto di analisi come l'insulina, fattori di crescita, ecc. possono essere aggiunti fino a quando l'assorbanza e picchi di spettro di fluorescenza non si sovrappongono con il sensore (494 nm/521 nm).
  3. Enzima collagenasi batterica diluita tipo alle 10 e 1.000 µ g/mL nei media test come controllo positivo.

3. idrogel incapsulamento delle cellule e preparazione

  1. Preparare la soluzione di precursore di idrogel.
    1. Aggiungere i reagenti a una provetta da 1,5 mL nel seguente ordine, Vortex dopo l'aggiunta di ogni componente: 20 mM 8 braccio 40 kDa PEG-NB, 12,75 mM crosslinker MMP-degradabile peptide, 17,8 mM NaOH, 1 mM CRGDS, 2mm LAP e peptide fluorogenico MMP-degradabile 0,25 mM.
      Nota: La tabella 1 Mostra il contenuto della soluzione di idrogel precursore, concentrazioni di stock, concentrazioni di lavoro, le formule di calcolo di volume e nei volumi richiesti necessari per rendere 120 µ l di soluzione di precursore di idrogel, che è sufficiente per condurre una esperimento con 10 idrogeli. Per tenere conto per la perdita della soluzione idrogel a causa di pipettaggio, aumentare il volume totale del 20%. I peptidi commerciali sono spesso forniti in una soluzione di acido cloridrico; di conseguenza, NaOH viene aggiunto per ottenere un pH finale di 7. pH della soluzione finale dovrebbe essere confermata dall'utente.
    2. Dividere la soluzione del precursore di idrogel in più provette da 1,5 mL, un tubo a condizione di essere testato.
      Nota: Diverse condizioni di controllo in cui idrogeli sono preparati senza l'aggiunta di cellule sono suggerite. Per un controllo negativo, per tenere conto di degradazione aspecifica del sensore fluorogenici, una condizione di idrogel può incubata con il controllo del veicolo o il supporto sperimentale da solo se non esistono condizioni trattamento. Per un controllo positivo e per la calibrazione tra esperimenti, idrogeli possono essere incubati con una proteasi conosciuta per fendere il sensore fluorogenic. Ad esempio, due concentrazioni di collagenasi batterica sono state usate qui.
  2. Incapsulare le cellule in idrogel.
    1. Preparare una sospensione di singola cella appropriata per il tipo di cella utilizzato. Per esempio, lavare un piatto di 10 cm delle cellule del melanoma A375 con 10 mL di PBS. Tripsinizzano cellule usando 0.05% tripsina e incubare a 37 ° C e 5% di CO2 per 3 min numero di celle con un emocitometro per determinare il numero totale delle cellule.
    2. Centrifugare la soluzione di cella a 314 x g per 3 min, aspirare terreni di coltura, quindi risospendere le cellule in PBS circa tre volte alla massima densità semina necessari per l'esperimento. Ad esempio, una sospensione di cellule con una densità di 21 x 106 cellule è stata usata qui per ottenere una densità incapsulata finale di 7 x 106 cellule/mL.
    3. Contare le celle nuovamente per garantire una concentrazione di cellule accurata.
    4. Aggiungere celle sospese e PBS in ogni provetta della soluzione di precursore di idrogel secondo la densità di semina richiesta (0,25, 0,5, 1, 2, 3, 4, 5, 6 e 7 x 106 cellule/mL in questo esempio). Aggiungere PBS a condizioni con nessun cellule sostituiscono le cellule sospese.
      Nota: Tutte le condizioni devono avere lo stesso volume di soluzione precursore di idrogel finale per garantire il rapporto tra le componenti di idrogel e PBS è costante. Fare non tubi di vortice che hanno cellule in loro, pipettare vigorosamente su e giù senza creare bolle per miscelare la soluzione di precursore.
    5. Pipettare 10 µ l della soluzione di precursore di idrogel in un sterile nero rotondo fondo piastra a 96 pozzetti, assicurando che la punta è centrata nel mezzo di ogni pozzo durante l'erogazione.
    6. Polimerizzare soluzione precursore di idrogel di impressionare la lastra alla luce ultravioletta (UV) a 4 mW/cm2 per 3 min.
      Nota: La lampada UV (UVL-56 palmare lampada UV, UVP, Upland, CA) produce luce di UV-A ad una lunghezza d'onda UV (365 nm), che non influisce la vitalità cellulare.
    7. Aggiungere 150 µ l di media di analisi a tutti i pozzetti tranne che per le condizioni di controllo positivo senza cellule incapsulate. Per i controlli positivi, aggiungere 150 µ l di soluzione degli enzimi collagenasi.
    8. Aggiungere 150 µ l di PBS esterno nei pozzetti della piastra per ridurre l'evaporazione durante l'incubazione.

4. MMP e misurazione dell'attività metabolica

  1. Misurare la fluorescenza immediatamente post-incapsulamento per stabilire una misurazione della fluorescenza di base e garantire l'uniformità nella polimerizzazione di idrogel. Leggere la piastra utilizzando un microplate di fluorescenza lettore che utilizzano un protocollo di opaco piastra a 96 pozzetti con un'area di analisi impostazione a 494 nm/521 nm (eccitazione/emissione). Questo sarà l'h 0 leggere.
  2. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per 18 h.
  3. Aggiungere il reagente di attività metabolica (resazurin) alle 01:10 (v/v) per ogni pozzetto.
  4. Incubare la piastra in un incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per ulteriori 6 ore.
    Nota: Questo tempo di incubazione può variare a seconda del tipo di cella.
  5. Misurare la fluorescenza post-all'incapsulamento 24 h. Leggere la piastra utilizzando un microplate di fluorescenza lettore che utilizzano un protocollo di opaco piastra a 96 pozzetti con un'area di analisi impostazione a 494 nm/521 nm (eccitazione/emissione) per attività MMP e 560 nm/590 nm (eccitazione/emissione) per attività metabolica.

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Risultati

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Il dosaggio attuale è stato adattato da un sistema di coltura di idrogel 3D precedentemente sviluppati e caratterizzati funzionalizzato con un fluorogenic MMP spaccabili sensore8. Il sensore MMP fluorogenic qui utilizzato è costituito da una sequenza peptidica, GPLAC (pMeOBzl) ↓WARKDDK (Roberta) C (↓ indica il sito di clivaggio) che in precedenza è stato ottimizzato per la scissione di MMP-14 e MMP-1119. Il peptide è etichettato con una mole...

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Discussione

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Coltura cellulare in vitro 3D ricapitola molti aspetti importanti dell'ambiente in vivo. Tuttavia, cultura 3D rende inoltre valutare la funzione delle cellule e segnalazione impegnativo, come molti saggi biologici richiedono recupero cellulare e un gran numero di cellule. Di conseguenza, lo sviluppo di un sistema di semplice cultura 3D che consente la misurazione della funzione cellulare senza ulteriore campione elaborazione aumenterebbe notevolmente l'utilità dei sistemi di coltura 3D. Il sistema 3D qui descritto può es...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori si desidera ringraziare Ohio cancro ricerca (OCR), OH, Stati Uniti d'America per il finanziamento di quest'opera così come King Saud University (KSU), Riyadh, KSA per sponsorizzare il primo autore. Peso molecolare del sensore fluorescente del peptide è stato misurato utilizzando matrice assistita, laser desorption-ionizzazione, spettrometria di massa (MALDI-TOF) tempo di volo con assistenza del Campus chimica strumento centro spettrometria di massa e proteomica Impianto presso la Ohio State University.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1X Soluzione salina tamponata con fosfatoFisher Scientific10-010-049
Carbone attivo Sigma-AldrichC3345
Piastra nera a 96 pozzetti a fondo tondoBrand-Tech89093-600
Peptide di adesione cellulare (CRGDS)GenScript USA Inc.su misura
tipo I Life Technologies17100-017
destranoSigma-AldrichD4876
DMEM media ad alto glucosioInvitrogen11965118
Siero fetale bovino (FBS) Seradigm1500-500
Lettore di micropiastre a fluorescenza Emocitometro BioTekCytation 3
Hausser Scientific Co.3200
L-glutamminaLife Technologies25030-081
Reticolante peptidico degradabile MMP (KCGPQG↓ IWGQCK)GenScript USA Inc.misura
NaOHFisher ScientificS318500
Penicillina/streptomicinaLife Technologies15140-122
Resazurin (blu di Alamar)Life TechnologiesDAL1100
luce UV UVP95-0006-02
Enzima Collagenasi su

Riferimenti

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