Articolo metodologico

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

DOI:

10.3791/59128

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12 febbraio 2019

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1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Abstract

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Citometria a flusso (FC) è il metodo di scelta per misurazione semi-quantitativa dei marcatori di superficie cellulare antigene. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata per le analisi fenotipiche di vescicole extracellulari (EV) tra cui esosomi (Exo) nel sangue periferico e altri fluidi corporei. Le piccole dimensioni di EV impone l'utilizzo di strumenti dedicati, avendo una soglia di rilevamento intorno 50-100 nm. In alternativa, EV può essere associato a microsfere in lattice che possono essere rilevati da FC. Microsfere, coniugato con gli anticorpi che riconoscono EV-collegata marcatori/Cluster di differenziazione CD63, CD9 e CD81 può essere utilizzato per la cattura di EV. Exo isolato da CM possa essere analizzato con o senza pre-arricchimento di ultracentrifugazione. Questo approccio è adatto per analisi di EV utilizzando strumenti convenzionali di FC. I nostri risultati dimostrano una correlazione lineare tra i valori di intensità di fluorescenza media (MFI) e concentrazione di EV. Perturbare EV tramite sonicazione drammaticamente diminuito MFI, che indica che il metodo non rileva i detriti della membrana. Segnaliamo un metodo accurato ed affidabile per l'analisi degli antigeni di superficie EV, che può essere implementato facilmente in qualsiasi laboratorio.

Introduzione

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Le cellule secernono vescicole extracellulari (EV) di diverse dimensioni tra cui microvescicole (MV) ed esosomi (Exo). Quest'ultimo può essere distinto da MV da entrambe le dimensioni e il compartimento subcellulare di origine. MV (200 – 1.000 nm in dimensioni) vengono rilasciati dalle cellule del genitore versando dalla membrana del plasma. Al contrario, Exo (30 – 150 nm) provengono dalle membrane endosomal e vengono rilasciati nello spazio extracellulare quando la MVB (MVB) si fondono con la membrana cellulare1,2.

EV sono sempre più utilizzati come biomarcatori diagnostici così co....

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Protocollo

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1. raccolta ed elaborazione dei Media condizionati

  1. Cappotto 55 cm2 capsule di Petri con gelatina di pelle porcina 0,02% in PBS.
  2. Piastra CPC (8.000/cm2) in piatti prerivestiti con 7 mL di per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM) completati con 20% FBS (siero fetale bovino) e 1% di penicillina/streptomicina (P/S).
    Nota: Il termine "CPC" si riferisce alle cellule di espianto umano derivato che sono stati descritti altrove14. CM possono essere raccolti da diversi tipi di cellule coltivati in condizioni di coltura specifici. Indossare guanti e lavorare sotto una cappa biologica.
    3. <....

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Risultati

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Numero totale di particelle per la colorazione del singolo

Poiché una singola perlina possibile associare più di una particella, abbiamo testato diverse condizioni per impostare la quantità minima di totale EV (singolo anticorpo per provetta) per raggiungere la prima fase esponenziale della curva delle IFM. Una concentrazione fissa di anticorpo è stata utilizzata mentre il numero totale di particelle ha variato .......

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Discussione

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La tecnica convenzionale FC rimane il più semplice metodo analitico per la caratterizzazione di marcatori espressi sulla superficie di EV. A questo proposito, selezionando il protocollo più adatto è fondamentale per ottenere informazioni utili sulle frazioni delle singole particelle di interesse evitando limitazioni a causa di sensibilità dello strumento. Abbiamo descritto un metodo che utilizza particelle magnetiche accoppiate con gli anticorpi che riconoscono Exo e piccoli antigeni di superficie di EV che sono adatti p.......

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Dichiarazioni

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Niente da dichiarare.

Ringraziamenti

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L.B. è stato sostenuto da borse di ricerca di Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurigo (Svizzera). G.V. è stato sostenuto da borse di ricerca di Swiss National Science Foundation, la Fondazione Cecilia-Augusta, Lugano e il SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Svizzera)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex, piattaforma citometro a flussoBeckman Coulter CytoFlex
DMEM, glicemia alta, HEPES, rosso senza fenoloGibco21063045
PBS (PBS) di Dulbecco's PBS (PBS) senza Ca e MgLonzaBE17-512F
ExoCap CD63 CaptureJSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 KitJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Kit di catturaJSR Life SciencesEx-C9-SP
FBS impoverito di esosomiThermofisherA2720801
Integratore multimediale FBS impoverito di esosomiSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Fetale Siero bovinoGibco10270106
FITC Anticorpo CD9 anti-umanoBioleggenda312104                    RRID: AB_2075894
Software di analisi del citometro a flussoBeckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
NanoSight SoftwareMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anti-umano CD63 AntibodyBiolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE anti-umano CD81 (TAPA-1) AnticorpoBiolegend349505                    RRID:AB_10642024
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 rotori

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barile, L., Vassalli, G. Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases. Pharmacology & Therapeutics. , (2017).
  2. Thery, C. Exosomes: secreted vesicles and intercellular communications. Molecular Biology Reports. 3, 15(2011).
  3. Yadav....

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Extracellular VesiclesFlow CytometryCell conditioned MediaCardiac Progenitor CellsUltracentrifugationNanoparticle TrackingAntibody ConjugationMean Fluorescence IntensityCD63 CD9 CD81Bead based Capture

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