Articolo metodologico

Analisi citofluorimetrica delle vescicole extracellulari dal supporto di cella-condizionato

DOI:

10.3791/59128

⸱

12 febbraio 2019

 ,  ,  , 
1Cellular and Molecular Cardiology Laboratory, Cardiocentro Ticino Foundation, Switzerland, 2Molecular Cardiology Institute, Dept. of Cardiology, University of Zürich, 3Faculty of Biomedical Science, Università Svizzera Italiana, Switzerland

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il protocollo descrive un metodo riproducibile progettato per l'utilizzo con i surnatanti di coltura cellulare per rilevare superfici epitopi sulle piccole vescicole extracellulari (EV). Utilizza specifici EV immunoprecipitazione usando i branelli accoppiati con gli anticorpi che riconoscono l'antigene di superficie CD9, CD63 e CD81. Il metodo è ottimizzato per l'analisi di citometria a flusso a valle.

Abstract

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Citometria a flusso (FC) è il metodo di scelta per misurazione semi-quantitativa dei marcatori di superficie cellulare antigene. Recentemente, questa tecnica è stata utilizzata per le analisi fenotipiche di vescicole extracellulari (EV) tra cui esosomi (Exo) nel sangue periferico e altri fluidi corporei. Le piccole dimensioni di EV impone l'utilizzo di strumenti dedicati, avendo una soglia di rilevamento intorno 50-100 nm. In alternativa, EV può essere associato a microsfere in lattice che possono essere rilevati da FC. Microsfere, coniugato con gli anticorpi che riconoscono EV-collegata marcatori/Cluster di differenziazione CD63, CD9 e CD81 può essere utilizzato per la cattura di EV. Exo isolato da CM possa essere analizzato con o senza pre-arricchimento di ultracentrifugazione. Questo approccio è adatto per analisi di EV utilizzando strumenti convenzionali di FC. I nostri risultati dimostrano una correlazione lineare tra i valori di intensità di fluorescenza media (MFI) e concentrazione di EV. Perturbare EV tramite sonicazione drammaticamente diminuito MFI, che indica che il metodo non rileva i detriti della membrana. Segnaliamo un metodo accurato ed affidabile per l'analisi degli antigeni di superficie EV, che può essere implementato facilmente in qualsiasi laboratorio.

Introduzione

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Le cellule secernono vescicole extracellulari (EV) di diverse dimensioni tra cui microvescicole (MV) ed esosomi (Exo). Quest'ultimo può essere distinto da MV da entrambe le dimensioni e il compartimento subcellulare di origine. MV (200 – 1.000 nm in dimensioni) vengono rilasciati dalle cellule del genitore versando dalla membrana del plasma. Al contrario, Exo (30 – 150 nm) provengono dalle membrane endosomal e vengono rilasciati nello spazio extracellulare quando la MVB (MVB) si fondono con la membrana cellulare1,2.

EV sono sempre più utilizzati come biomarcatori diagnostici così come, potenzialmente, strumenti terapeutici in molti campi compreso oncologia, neurologia, la cardiologia e malattie del sistema muscoloscheletrico3,4,5. Una stragrande maggioranza degli studi in corso utilizzando EV come agenti terapeutici sfruttano l'isolamento delle vescicole dal cellulare-condizionato medium (CM) di cellule coltivate in vitro. Cellule staminali mesenchimali (MSCs) esercitare effetti benefici in vari contesti, e MSC-derivato EV hanno dimostrato benefici in modelli di ischemia/riperfusione miocardica lesione6 e cervello lesioni7. MSC-derivato EV inoltre esibiscono attività modulatory immuni che può essere sfruttata per trattare il rigetto immunitario, come dimostrato in un modello di malattia di terapia-refrattario graft - versus - host8. Le cellule staminali del liquido amniotiche (hAFS) attivamente arricchire CM con MVs ed Exo, eterogeneo nelle dimensioni (50 – 1.000 nm), che mediano gli effetti biologici diversi, come la proliferazione di cellule differenziate, angiogenesi, inibizione di fibrosi, e cardioprotezione4. Abbiamo recentemente dimostrato che EV e particolarmente Exo, secreta dalle cellule progenitrici derivate cardiaco umano (Exo-CPC) ridurre la dimensione di infarto del miocardio in ratti5,9.

Exo Condividi un insieme comune di proteine sulla loro superficie, tra cui tetraspannine (CD63, CD81, CD9) e complesso di istocompatibilità di classe I (MHC-I). Oltre a questo insieme comune delle proteine, Exo contengono anche proteine specifiche per il sottoinsieme di EV del tipo cella produttore. Marcatori di Exo stanno guadagnando importanza fondamentale perché giocano un ruolo cruciale nella comunicazione intercellulare, quindi che regolano molti processi biologici5,10. A causa delle loro piccole dimensioni, trovare un modo semplice per analizzare EV usando il classico flusso cytometry (FC) rimane un compito impegnativo.

Qui, presentiamo un protocollo semplificato per l'analisi di EV con FC, che può essere applicato a campioni pre-arricchiti ottenuti attraverso ultracentrifugazione o direttamente a CM (Figura 1). Il metodo utilizza perline rivestite con un anticorpo specifico che si lega epitopi superfici Exo-collegata canonici (CD63, CD9, CD81) senza ulteriori lavaggi. FC analisi possono essere eseguite utilizzando un citometro convenzionale senza necessità di regolazioni prima di misurazioni. Metodi per la caratterizzazione degli antigeni su singole piccole particelle utilizzando citometri a flusso sono state descritte da altri gruppi rispetto alle varie applicazioni11,12,13. Qui, abbiamo usato microsfere magnetiche funzionalizzate per la cattura di piccole particelle ed Exo, seguita da fenotipizzazione delle particelle catturate dalla FC. Anche se questo metodo può essere utilizzato per caratterizzare la composizione antigenica di piccole vescicole rilasciate da qualsiasi tipo di cellula in vitro, qui abbiamo fornito le condizioni di coltura delle cellule specifiche che si applicano per la coltura delle cellule progenitrici cardiache umane (CPC) e la maggior parte ambiente adatto per la produzione di EV da queste cellule.

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Protocollo

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1. raccolta ed elaborazione dei Media condizionati

  1. Cappotto 55 cm2 capsule di Petri con gelatina di pelle porcina 0,02% in PBS.
  2. Piastra CPC (8.000/cm2) in piatti prerivestiti con 7 mL di per volta Dulbecco di Iscove Medium (IMDM) completati con 20% FBS (siero fetale bovino) e 1% di penicillina/streptomicina (P/S).
    Nota: Il termine "CPC" si riferisce alle cellule di espianto umano derivato che sono stati descritti altrove14. CM possono essere raccolti da diversi tipi di cellule coltivati in condizioni di coltura specifici. Indossare guanti e lavorare sotto una cappa biologica.
  3. Una volta che le cellule raggiungono circa 80% confluenza, rimuovere il terreno di coltura, lavare due volte con di Dulbecco PBS (PBS) Ca e Mg-privo di cellule e sostituirlo con 10 mL di medium di Exo-produzione senza siero (dell'Aquila per volta di Dulbecco medie [DMEM] alto glucosio, 4,5 g/mL).
    Nota: Procedere con una progressiva diminuzione della concentrazione sierica nel terreno di coltura, di adattarsi gradualmente le cellule alla condizione privo di siero (SF). Per le celle che sono sensibili al medium senza siero preparare un supporto contenente FBS ma impoverito di EV. Preparare supplementato con tutte le sostanze nutritive, oltre a 10 – 20% (v/v) FBS. Centrifugare il mezzo durante la notte a 100.000 × g, 4 ° C. Essere consapevoli del fatto che questa procedura non garantisce la rimozione di 100% di FBS-derivato EV.
  4. Dopo 7 giorni, raccogliere i CM in un provette in polipropilene.
    Nota: Il tempo per media condizionata dipende il tipo di cella. Per le celle che sono sensibili al medium senza siero, aumentare il volume iniziale del mezzo e diminuire il tempo per la raccolta di CM per 24-48 h.
  5. Deselezionare CM da detriti cellulari di centrifugare a 3.000 x g per 20 min 4 – 10 ° C. Raccogliere il surnatante in un tubo di filtro centrifugo kDa 100.
  6. Concentrato deselezionata CM facendo girare il tubo a 2.000 x g per 20 min a 4 – 10 ° C.
    Nota: Questo passaggio riduce il volume iniziale di CM permettendo l'uso di tubi di piccolo-volume per la procedura di centrifuga ad alta velocità e contribuirà a eliminare aggregati proteici piccolo.
  7. Raccogliere il concentrato in un tubo del microcentrifuge. Centrifugare a 10.000 x g per 15 min 4 – 10 ° C.
  8. Raccogliere il surnatante e passare alla sezione 2 (EV arricchimento). Se non è disponibile un'ultracentrifuga passare direttamente alla sezione 3 (quantificazione Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)).
    Nota: Pre-arricchimento di EV frazione migliora la lettura finale nell'intensità di fluorescenza (Vedi risultati rappresentativi e Figura 4). Sgomberati CM (dal punto 1.8) possono essere memorizzati a 4 ° C per non più di 1-2 giorni o in alternativa a − 80 ° C per diversi mesi. 5 CM deve essere pre-liquidati per rimuovere eventuali detriti cellulari prima di conservazione a-80 ° C al fine di garantire che detriti esosomi e medie non si sono costituito nel processo di congelamento-scongelamento.

2. extracellulare vescicole arricchimento di ultracentrifuga (opzionale)

  1. Posto il supernatante dal passo 1,8 in un tubo di policarbonato spessore parete ultracentrifuga. Riempire la provetta con la soluzione salina tampone fosfato (PBS): 1x finché raggiunge la massima capacità (3,2 mL).
  2. Caricare i campioni in un rotore ad angolo fisso di titanio (8 x 3.2 mL, fattore k-13). Caricare il rotore in un'ultracentrifuga da tavolo. Ultracentrifuga a 100.000 x g per 3 h 4 – 10 ° c.
  3. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 100 µ l di 1X PBS.

3. Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) quantificazione

  1. Diluire 1 µ l di campione (da passo 2.3 o 1.8) a 999 µ l di PBS 1X. Caricare il campione in una siringa da 1 mL, evitando la formazione di bolle. Caricare la siringa nella porta di ingresso della camera l'esame.
  2. Accendere il laser. Aprire la fotocamera con il tasto di acquisizione . Regolare il fuoco.
  3. Registrare almeno 3 diversi telai: 60 s ciascuno.
  4. Analizzare le 3 diverse acquisizioni utilizzando l'opzione di Elaborazione Batch nel software.
    Nota: Se la tecnologia NTA non è disponibile, eseguire una quantificazione della proteina dall'analisi di Bradford (1 x 108 particelle corrispondono a 1 – 2 µ g di proteina totale dopo ultracentrifugazione o a 50 – 60 µ g proteina totale se la quantificazione è effettuata direttamente per CM come Esso comprende contaminanti di proteine differenti da EV; Vedi tabella 1)5.

4. preparazione del campione

  1. Preparare un pool di 3 tipi di perline di cattura (CD9 perline, perline di CD63 e CD81 perline a un 1: rapporto 1:1; si veda Tabella materiali) e vortex.
    Nota: La piscina è stata testata per essere stabile per 1 mese. Può essere utilizzato un solo tipo di cattura della perla, questo permetterà la rilevazione delle sub-popolazioni EV non discriminabili con piscina di perline. Utilizzando singolo antigene cattura perline, sarà possibile al contemporaneo dimostrare la presenza di proteine di studi, quali CD9, CD81 o CD63, e l'antigene di interesse rilevati dall'anticorpo fluorescente. Granuli di lattice alternativi aldeide-solfato sono anche disponibili in commercio. Queste perle presentano superficie idrofoba per l'adsorbimento di MV ed EV.
  2. In un tubo di fondo tondo, aggiungere la quantità di volume corrispondente a 1 x 108 particelle più 1 µ l della piscina della perla, corrispondente a 1,2 x 105 perline in totale (per ciascun test).
  3. Preparare una provetta contenente 1 µ l di perline senza EV che servirà come controllo negativo, di cui dichiara come "Perle".
  4. Regolare il volume a 100 µ l con 1x PBS. Collocare la provetta in un termo-mixer e agitare a 400 giri/min durante la notte a 4 – 10 ° C.
  5. Il giorno successivo, spostare i campioni a una piastra a 96 pozzetti fondo tondo (o tubi FC).
  6. Aggiungere l'anticorpo (10 µ g/mL di CD9_FITC, 10 µ g/mL di CD63_PE e 5 µ g/mL di CD81_PE).
  7. Incubare 1h a 4 – 10 ° C.
  8. Aggiungere 100 µ l di 1X PBS in ciascun pozzetto.
  9. Procedere all'acquisizione.

5. acquisizione

  1. Aprire il software di acquisizione e start up dello strumento (citometro > programma di avvio di sistema). Aprire un nuovo esperimento.
  2. Creare un modello sperimentale, quindi selezionare la piastra e quindi Aggiungi. Selezionare la posizione dei campioni sulla piastra e quindi premere Set come esempio ben.
  3. Immettere il nome del campione (cioè CPC n. 1_CD9FITC) nelle Regole di denominazione. Aprire la scheda di canale e accendere il FITC e canali di PE.
  4. Caricare la piastra nello strumento.
  5. Premere Dot Plot e creare un nuovo grafico di punto (P1). Impostare Forward Scatter Area (FSC-A) contro zona Side Scatter (SSC-A).
  6. Selezionare inizializzare per iniziare il laser e la fluidica. Premere Acquisisci per avviare l'acquisizione.
  7. Regolare la scala per visualizzare la popolazione nel mezzo il P1. In P1 disegnare il cancello "Perline" intorno a tutta la popolazione (escluse detriti) (Figura 2A). Premere Stop.
  8. Premere Dot Plot e creare un nuovo grafico di dot (P2). Impostare Forward Scatter-altezza (FSC-H) versus FSC-A. Gate la nuova trama di punto su "Perline". In P2 disegnare un nuovo cancello intorno alla più grande popolazione e denominarlo "CAMICIOLE" (Figura 2A).
    Nota: Questa strategia è stata progettata al fine di evitare il più possibile l'inclusione di aggregati di perline in fasi di analisi e acquisizione.
  9. Premere Dot Plot e creare due punti diversi lotti; uno FITC contro SSC-A e uno PE contro SSC-A. Gate la nuova trama di punto su "Canottiere."
  10. Selezionare il numero di eventi da registrare (ad es., 20.000). Selezionare Record e iniziare l'esperimento.

6. analisi dei dati

  1. Caricare i file di acquisizione nel software di analisi.
    Nota: I passaggi seguenti devono essere applicati ad ogni campione tra cui perline solo e ogni campione sconosciuto.
  2. Aprire un nuovo protocollo e creare trame puntino seguendo la stessa strategia descritta nel passaggio 5.
  3. Impostare tutti gli assi di dispersione in scala lineare e tutti gli assi di fluorescenza a scala logaritmica.
  4. Visualizza la media geometrica di fluorescenza (X-Gmean-MFI) nei canali FITC e PE.
  5. Calcolare il rapporto X-Gdire dei campioni / X-Gdire delle perline colorate con anticorpo senza esosomi.
  6. Confrontare la variazione piega MFI di diverse preparazioni di EV.

7. extracellulare vescicola numero titolazione

Nota: Sezioni da 7 a 10 può essere eseguita per impostare il numero di particelle, la concentrazione di anticorpi e la specificità, ma può essere ignorato se il tipo di cella, da cui sono derivati EV, e gli anticorpi rimangono gli stessi.

  1. Diluire le particelle, ottenute dal passaggio 2.3, in PBS 1X per ottenere una serie di sospensioni che vanno da 5 x 105 a 2,5 x 108 particelle.
  2. Per ogni sospensione aggiungere in un tubo di fondo tondo 1 µ l di piscina di perlina di cattura.
  3. Seguire il protocollo dal punto 4.3.

8. titolazione di anticorpi

Nota: Titolazione di anticorpi è di solito eseguita con l'aggiunta di un singolo anticorpo per ogni provetta.

  1. Mantenere il numero di EV (totale delle particelle o contenuto proteico) costante in tutti i campioni.
    Nota: Il numero appropriato è determinato empiricamente come descritto sopra nella sezione 7.
  2. Seguire il protocollo da 4.1 a 4.5 di Spagna.
  3. Testare una gamma di concentrazioni nell'anticorpo sopra e sotto l'importo consigliato dal fornitore. Ad esempio, per un anticorpo con una concentrazione consigliata di 10 µ g/mL per ogni test, test 1, 2, 5, 10, 20 e 50 µ g/mL. Includere un campione con "solo perline", aggiungendo la più alta concentrazione di anticorpo.
  4. Incubare per 1 h a 4 – 10 ° C.
  5. Aggiungere 100 µ l di 1X PBS per ciascun campione.
  6. Acquisire i campioni.

9. incubazione

  1. Verificare il tempo di incubazione eseguire acquisizioni in diversi momenti (ad es., 1 h, 2h e 5 h).
  2. Seguire il protocollo a partire dalla sezione 4.
  3. Incubare i campioni a 4 – 10 ° C per 1 h.
  4. Acquisire campioni.
  5. Incubare i campioni a 4 – 10 ° C per 3 h.
  6. Acquisire campioni.

10. protocollo convalida

  1. Associazione di EV
    1. In un tubo di fondo tondo, aggiungere la quantità di volume corrispondente a 1 x 108 particelle o la corrispondente quantità di proteine totali.
    2. Regolare il volume a 100 µ l con 1x PBS.
    3. Interromperebbe la membrana EV di sonicazione (in alternativa un passo di scossa di calore può essere applicato) secondo le istruzioni del produttore. Impostare la frequenza e l'intensità. Il periodo di sonicazione può essere stabilito empiricamente l'impostazione di un esperimento di corso di tempo (cioè, 0 s, 30 s, 1 min, 5 min, ecc.).
    4. Aggiungere 1 µ l della piscina della perla.
    5. Seguire il protocollo a partire dal punto 4.4.
  2. Specificità dell'anticorpo
    1. Preparare una provetta per ogni fluorocromo coniugato IgG e aggiungere il complesso di perline-EV come descritto al punto 4.6.
      Nota: L'isotipo fluorocromo-coniugate dovrà corrispondere con le IgG dell'anticorpo utilizzato.

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Risultati

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Numero totale di particelle per la colorazione del singolo

Poiché una singola perlina possibile associare più di una particella, abbiamo testato diverse condizioni per impostare la quantità minima di totale EV (singolo anticorpo per provetta) per raggiungere la prima fase esponenziale della curva delle IFM. Una concentrazione fissa di anticorpo è stata utilizzata mentre il numero totale di particelle ha variato ...

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Discussione

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La tecnica convenzionale FC rimane il più semplice metodo analitico per la caratterizzazione di marcatori espressi sulla superficie di EV. A questo proposito, selezionando il protocollo più adatto è fondamentale per ottenere informazioni utili sulle frazioni delle singole particelle di interesse evitando limitazioni a causa di sensibilità dello strumento. Abbiamo descritto un metodo che utilizza particelle magnetiche accoppiate con gli anticorpi che riconoscono Exo e piccoli antigeni di superficie di EV che sono adatti p...

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Dichiarazioni

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Niente da dichiarare.

Ringraziamenti

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L.B. è stato sostenuto da borse di ricerca di Helmut Horten Stiftung e Velux Stiftung, Zurigo (Svizzera). G.V. è stato sostenuto da borse di ricerca di Swiss National Science Foundation, la Fondazione Cecilia-Augusta, Lugano e il SHK Stiftung für Herz-und Kreislaufkrankheiten (Svizzera)

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
IMDMGibco12440061
Amicon Ultra-15, PLHK Ultracel-PL Membran, 100  kDa MilliporeUFC910024
CytoFlex, piattaforma citometro a flussoBeckman Coulter CytoFlex
DMEM, glicemia alta, HEPES, rosso senza fenoloGibco21063045
PBS (PBS) di Dulbecco's PBS (PBS) senza Ca e MgLonzaBE17-512F
ExoCap CD63 CaptureJSR Life SciencesEx-C63-SP
ExoCap CD81 KitJSR Life SciencesEx-C81-SP
ExoCap CD9 Kit di catturaJSR Life SciencesEx-C9-SP
FBS impoverito di esosomiThermofisherA2720801
Integratore multimediale FBS impoverito di esosomiSBIEXO-FBS-250A-1
FBS-Fetale Siero bovinoGibco10270106
FITC Anticorpo CD9 anti-umanoBioleggenda312104                    RRID: AB_2075894
Software di analisi del citometro a flussoBeckman CoulterKaluza
NanoSight LM10MalvernNanoSight LM10
NanoSight SoftwareMalvernNTA 2.3
Optima Max-XPBeckman Coulter393315
PE anti-umano CD63 AntibodyBiolegend353004                    RRID:AB_10897809
PE anti-umano CD81 (TAPA-1) AnticorpoBiolegend349505                    RRID:AB_10642024
Penicillina-StreptomicinaGibco15140122
Thermomixer CEppendorf5382 000 015
TLA-110Beckman CoulterTLA-110 rotori

Riferimenti

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