Method Article

Analisi quantitativa della composizione cellulare nelle lesioni aterosclerotiche avanzate del muscolo liscio delle cellule Lineage-Tracing topi

DOI:

10.3791/59139

⸱

February 20th, 2019

 ,  ,  , 
1Heart, Lung, Blood and Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh, 2Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia, 3Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia, 4Division of Cardiology, University of Pittsburgh School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vi proponiamo un protocollo standardizzato per caratterizzare la composizione cellulare delle lesioni aterosclerotiche murine di stadio avanzato compreso di metodi sistematici di dissezione animale, inclusione di tessuti, taglio, colorazione e analisi delle arterie brachiocefaliche dai topi di atheroprone del muscolo liscio delle cellule lignaggio traccia.

Abstract

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L'aterosclerosi rimane la principale causa di morte nel mondo e, nonostante innumerevoli studi preclinici che descrive promettenti bersagli terapeutici, nuovi interventi sono rimasti sfuggenti. Questo è probabilmente dovuta, in parte, a una dipendenza da modelli preclinici di prevenzione che studiano gli effetti delle manipolazioni genetiche o trattamenti farmacologici sullo sviluppo di aterosclerosi, piuttosto che di malattia stabilita. Anche, i risultati di questi studi sono spesso confusione perché l'uso delle analisi di lesione superficiale e una mancanza di caratterizzazione delle popolazioni di cellule di lesione. Per aiutare a superare questi ostacoli traslazionali, proponiamo un maggiore affidamento su modelli di intervento che impiegano indagine dei cambiamenti nella composizione cellulare a livello di singola cellula di macchiatura di immunofluorescenza e microscopia confocale. A tal fine, descriviamo un protocollo per la prova di un presunto agente terapeutico in un modello murino di intervento compreso un approccio sistematico per la dissezione animale, l'incorporamento, sezionamento, colorazione e quantificazione delle lesioni dell'arteria brachiocefalica. Inoltre, a causa della diversità fenotipica delle cellule all'interno delle lesioni aterosclerotiche ritardo-fase, descriviamo l'importanza di utilizzare sistemi di cellula-specifico, inducibile lignaggio traccia mouse e come questo può essere sfruttato per caratterizzazione imparziale delle popolazioni di cellule della lesione aterosclerotica. Insieme, queste strategie possono assistere i biologi vascolari più accuratamente gli interventi terapeutici di modellare ed analizzare la malattia aterosclerotica e speriamo che si tradurranno in un più alto tasso di successo negli studi clinici.

Introduction

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L'aterosclerosi è la principale causa di morbilità e mortalità in tutto il mondo sottostante la maggior parte di malattia dell'arteria coronaria, malattie delle arterie periferiche e di colpo. Ritardo-fase aterosclerosi coronaria può portare a complicazioni gravi tra cui contabilità l'infrazione del miocardio quasi il 16% del mondo popolazione mortalità1,2. A causa di un impatto devastante sulla salute pubblica, notevoli sforzi compiuti per decifrare i meccanismi che guidano la progressione di aterosclerosi, così come per sviluppare nuove strategie terapeutiche. Ancora, il tasso di probabilità di approvazione (LOA) di studi clinici per la malattia cardiovascolare è tra i più bassi se paragonato con altri campi clinici (solo 8,7% per la fase I)3. Ciò può essere spiegato in parte da molte barriere che l'aterosclerosi rappresenta per lo sviluppo di farmaci efficaci tra cui la sua natura quasi onnipresente, progressione clinicamente silenziosa e malattia significativa eterogeneità. Inoltre, il design non ottimale di alcuni studi preclinici possa essere rappresentato anche la mancanza di successo nella traduzione clinica. In particolare, riteniamo che è necessario implementare gli studi di intervento ove possibile, per studiare l'efficacia di strategie terapeutiche. Inoltre, c'è una necessità critica di eseguire le procedure standardizzate per le analisi di lesione compreso caratterizzazione avanzata di composizione cellulare lesione aterosclerotica ritardo-fase phenotyping e la mappatura di destino.

La stragrande maggioranza degli studi aterosclerosi concentrarsi su modelli di prevenzione di aterosclerosi composto da droga trattamento o gene manipolazione (KO o knock-in) in topi giovani sani, prima dell'inizio di malattia e progressione. Questi studi hanno portato alla luce un gran numero di geni e molecole di segnalazione che svolgono un ruolo nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, la maggior parte di queste destinazioni non è riuscito a tradurre alle terapie efficienti nell'essere umano. In effetti, è difficile estrapolare l'effetto di una terapia su topi sani giovani ai pazienti anziani con lesioni aterosclerotiche avanzate. Come tale, la realizzazione di studi di intervento in cantiere sperimentale preclinica probabile fornisce una rappresentazione più accurata della pertinenza e dell'efficacia di un nuovo terapeutico. L'idea è sostenuta dagli effetti straordinariamente divergenti di inibire le citochine proinfiammatorie interleuchina-1 β (IL-1 β) quando si impiegano una prevenzione4,5,6 o intervento strategia7. Differenze tra prevenzione e studi di intervento suggeriscono che diversi processi cellulari si verificano alle diverse fasi di sviluppo di aterosclerosi e sottolinea il fatto che studi di prevenzione sono probabilmente insufficiente per modellare lo scenario clinico adeguatamente.

L'American Heart Association ha recentemente pubblicato una dichiarazione scientifica dettagliare raccomandazioni per la corretta progettazione sperimentale, standardizzazione procedurale, analisi e reporting di aterosclerosi animale studi8. Evidenzia i vantaggi ei limiti di predominante tecniche utilizzate nel campo. Ad esempio, face it Sudan IV macchiatura dell'aorta viene spesso eseguita come una prima lettura. Anche se face it Sudan IV macchiatura del deposito del lipido è un metodo adatto per la valutazione del carico globale della placca, è in grado di distinguere le lesioni grasse della striscia iniziale da lesioni più avanzate di ritardo-fase. Come tale, l'interpretazione di face it colorazione è spesso ambigua e superficiale9. Un'attenta analisi del tessuto sezioni trasversali utilizzando la dimensione del vaso, lesione e lume di parametri morfologici e quantificazione degli indici di stabilità della lesione fornisce una comprensione più precisa dell'effetto di un esperimento.

Infine, l'istopatologia umana studi hanno suggerito che la composizione cellulare è un migliore preannunciatore della rottura che la dimensione della lesione stessa, con lesioni poveri nelle cellule muscolari lisce (SMC) e ricchi di macrofagi essere più suscettibili a rottura10, 11. Queste osservazioni sono state basate sulla macchiatura per marcatori classicamente utilizzati per l'identificazione delle cellule (cioè, ACTA2 per SMC e LGALS3 o CD68 per i macrofagi). Tuttavia, l'espressione di questi indicatori non è rigorosamente limitato a un singola cella tipo nelle lesioni aterosclerotiche dovuto la plasticità di stirpi multipli tra cui SMC, cellule endoteliali e cellule mieloidi12. In particolare, l'identificazione univoca degli SMC all'interno della lesione aterosclerotica era praticamente impossibile fino a quando nell'ultimo decennio a causa della proprietà di queste cellule a dedifferentiate e a reprimere i loro geni marcatori lineage-specifici di (un processo definito commutazione fenotipica) in vasi feriti o malati13. Questa limitazione nell'identificazione di SMC è stata aggirata tramite lo sviluppo di lignaggio traccia7,14,15,16,17,18, 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24. si compone di etichettatura permanentemente SMC e la loro progenie per tenere traccia di loro destino e l'evoluzione fenotipica durante la progressione di aterosclerosi utilizzando una combinazione dell'espressione di Cre ricombinasi guidato da promotori SMC-specifici (ad esempio, Myh117,15,17,18,19,20,21,22,23 , 24, Acta225,26 e, SM22α14,16) e l'attivazione dei reporter (ad es., proteine fluorescenti, β-galattosidasi) [recensione a Bentzon e Majesky 201827]. In uno dei primi studi che impiegano l'analisi del lignaggio SMC fuori regolazione embriogenesi, Speer et al.14 fornito la prova che SMC possano modulare il loro fenotipo e transdifferenziare nelle cellule chondrogenic durante la calcificazione vascolare utilizzando un modello di traccia SM22α Cre R26R LacZ lignaggio. Sebbene questi studi ha aperto la strada traccia del lignaggio SMC, erano parzialmente equivoci in quanto qualsiasi dato non-SMC esprimenti SM22α nella regolazione della malattia sarebbe essere etichettati dal reporter. Questa limitazione è stata ignorata dallo sviluppo e l'uso di tamoxifen-inducible Cre ERT/LoxP permettendo un controllo temporale della cella etichettatura. Etichettatura delle cellule si verifica esclusivamente durante la consegna di tamoxifene e sarà limitato alla cella esprimendo il promotore di tipo-specifico cellulare Guida espressione di Cre ERT al tempo di esposizione di tamoxifen, evitando l'analisi di tipi cellulari alternativi attivazione Cre nella impostazione della progressione di malattia. Per l'analisi di lignaggio di SMC nell'aterosclerosi, il tamoxifene-inducible Myh11- Cre/ERT2 transgene associato reporter fluorescenti (eYFP7,15,17,18 , 21, mTmG19,25, coriandoli20,22,23 per studi di espansione clonale) ha dimostrato una notevole efficienza e specificità in SMC etichettatura e ha stato utilizzato per le popolazioni di SMC mappa destino nelle lesioni aterosclerotiche in studi recenti. D'importanza, questi studi hanno rivelato che: 1) 80% di SMC interno avanzato di lesioni aterosclerotiche fare non esprimere qualsiasi convenzionali marcatori SMC (ACTA2, MYH11) utilizzati nell'analisi di immunohistological e pertanto sarebbe sono stati erroneamente senza traccia di lignaggio 17; 2) sottoinsiemi di SMC esprimono marcatori di tipi cellulari alternativi tra cui marcatori dei macrofagi o cellule staminali mesenchimali marcatori16,17,19; e 3) SMC investire e popola lesione aterosclerotica espansione di oligoclonal e SMC cloni conservano plasticità alla transizione a fenotipicamente diverse popolazioni20,23. Per riassumere, è ormai chiaro che le cellule muscolari lisce presentano una notevole diversità fenotipica in lesioni aterosclerotiche e possono avere ruoli benefici o dannosi sulla patogenesi della lesione a seconda della natura delle loro transizioni fenotipiche. Queste scoperte rappresentano una notevole nuova strada terapeutica per il targeting SMC athero-Promozione fenotipiche transizioni in ritardo-fase aterosclerosi.

Nel presente documento, vi proponiamo un protocollo standardizzato per l'analisi di fase avanzata lesioni aterosclerotiche murine inclusi metodi sistematici per la dissezione animale, l'incorporamento, sezionamento, colorazione e quantificazione delle lesioni dell'arteria brachiocefalica. Per determinare l'effetto di inibizione dell'interleuchina-1 β sul destino SMC e fenotipo, abbiamo usato il lignaggio SMC traccia ApoE- / - topi alimentati una dieta occidentale per 18 settimane prima di ricevere le iniezioni settimanali di un anticorpo anti-IL1β o pari isotipo IgG controllo.

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Protocol

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Procedure, la gestione e allevamento degli animali sono state approvate dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale Università di Pittsburgh e l'Università della Virginia.

1. generazione di SMC lignaggio traccia topi

  1. Razza Myh11- Cre/ERT2 maschi28 (Jackson Laboratory; #019079) con le femmine R26R-EYFP (Jackson Laboratory; #006148) per ottenere Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + maschi.
  2. Allevare il Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + maschi con i topi ApoE- / - femminili (laboratorio di Jackson; #002052). Attraversare la progenie e selezionare dalla genotipizzazione Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE- / - uomo e R26R-EYFP+ + topi ApoE- / - femminili come allevatori finali. Code di clip ed eseguire la genotipizzazione su littermates. Tutti i topi maschi dovrebbero essere Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE- / - e può essere utilizzato come topi sperimentali (Figura 1A).
    Nota: Protocolli Genotyping possono essere trovati sul sito Jackson Laboratory. Il transgene Cre/ERT2 Myh11 è localizzato sul cromosoma Y, precludendo l'uso delle femmine. Altri sistemi per il tracciamento lignaggio possono essere utilizzati, ma questo sistema è ad oggi la più affidabile strategia di lignaggio traccia a fate mappa SMC nell'aterosclerosi.

2. muscolo liscio delle cellule lignaggio traccia del mouse dieta e trattamenti

  1. Sono maschio Myh11- Cre/ERT2+ R26R-EYFP+ + ApoE- / - topi ricevano una serie di iniezioni di tamoxifene 1 mg da sei a otto settimane di età per etichettare definitivamente Myh11+ SMC con YFP e per tenere traccia di loro destino (Figura 1 A).
    1. Olio di arachidi di calore a 55 ° C.
    2. Aggiungere tamoxifene in olio di arachidi pre-riscaldato per preparare una soluzione a 10 mg/mL e incubare a 55 ° C fino al completo scioglimento del tamoxifene.
    3. Eseguire un'iniezione intraperitoneale con 0,1 mL di soluzione di tamoxifen 10mg/mL per una serie di dieci iniezioni oltre due settimane.
      Nota: Il tamoxifene è un rischio biologico e deve essere maneggiato con cura.
  2. Cinque-sette giorni dopo l'ultima iniezione con il tamoxifene, sostituire la dieta del cibo con dieta ricca di grassi (ad es., dieta occidentale; 42% kcal da grasso e colesterolo totale 0,2%) per una durata di 18 settimane per consentire lo sviluppo delle lesioni aterosclerotiche avanzate, che costantemente si sviluppa nei letti vascolari multipli tra cui l'arco aortico, radice aortica, arteria brachiocefalica e dell'aorta addominale.
  3. A 18 settimane della dieta di grassi nutrire, iniziare l'intervento terapeutico per la durata desiderata (Figura 1B).
    Nota: Ad esempio, abbiamo effettuato le iniezioni intraperitoneali settimanale con un anticorpo anti-IL1β o un pari isotipo IgG controllo tra 18 e 26 settimane di dieta grassa alta.
  4. Togliere gli alimenti ai topi veloci per 8 a 16 h prima del tessuto raccolta per eseguire letture accurate per trigliceridi e colesterolo del plasma.

3. raccolta dell'arteria brachiocefalica (BCA)

  1. L'eutanasia animale deve seguire norme e requisiti di cura degli animali e uso Comitato (ACUC). Eutanasia topi sperimentali da CO2 asfissia per circa 5 minuti e verificare la morte di pizzico di punta.
  2. Pesare il mouse e raccogliere il sangue.
    1. Pesare il mouse
    2. Spruzzare il lato ventrale del mouse con 70% etanolo
    3. Eseguire la puntura cardiaca inserendo un ago 25G collegato ad una siringa da 1 mL nel ventricolo dal lato sinistro della cavità toracica. 0,1-1 mL di sangue può essere raccolto.
    4. Trasferire il sangue a un tubo a vuoto EDTA irrigando la siringa e inserire il tubo su un rocker o rotatore per 10-15 min.
    5. Trasferire il sangue in una provetta da 1,5 mL e centrifugare per 10 minuti 250 x g a 4 ° C. Accuratamente ritirare la fase superiore del plasma con una pipetta e consigli adeguati e trasferire in una nuova provetta. Conservare a-20 ° C prima della misura di colesterolo e trigliceridi.
      Nota: il sangue intero può essere utilizzato per ulteriori studi tra cui conteggi di globulo e altri componenti del sangue tra cui citochine o profilatura delle cellule immuni.
  3. Fare un'incisione di circa 2 cm nella pelle in corrispondenza della metà di-addome utilizzando forbici e tirare la pelle per esporre la cavità addominale. Tagliare il peritoneo fino allo sterno senza danneggiare tessuti. Fare due tagli alla linea ascellare medio attraverso il torace, facendo attenzione a non danneggiare il cuore e polmoni.
  4. Sollevare lo sterno con le pinzette e tagliare il diaframma per esporre parzialmente il cuore. Se il cuore non è facilmente accessibile, tagliare via la gabbia toracica abbastanza per raggiungere l'atrio di destra.
  5. Irrorare il mouse con un sistema di perfusione di gravità (Figura 2A). Installare il sistema di perfusione di gravità tale che la pressione del liquido di perfusione è equivalente alla pressione sanguigna murina media (Figura 2B). Questo sistema permette per coerenza nell'aspersione ed entrambi mantiene la nave morfologia e vampate globuli rossi.
    Nota: Come riferimento, topi C57Bl6 hanno una pressione fisiologica tra 120 mmHg (pressione sanguigna sistolica media) e 70 mmHg (pressione sanguigna diastolica media)29,30. La pressione sanguigna sistolica e diastolica media può variare con priorità bassa genetica del mouse.
    1. Collegare un 23 o 25G farfalla dell'ago per il sistema di perfusione di gravità ed eseguire tampone fosfato salino (PBS) attraverso l'ago per espellere l'aria dai tubi. Inserire l'ago nel ventricolo sinistro e fissare l'ago in posizione. Utilizzando le forbici iris, praticare una piccola incisione (< 2 mm) in atrio destro o dell'aorta ascendente.
    2. Irrorare con 5 mL di PBS, quindi 10 mL di soluzione al 4% paraformaldeide (PFA), poi 5 mL di PBS. Utilizzare soluzione PFA PBS e il 4% a temperatura ambiente.
    3. Raccogliere i tessuti di interesse (ad es., fegato, polmone, milza) e inserirli nella soluzione PFA 4%.
  6. Esporre la BCA
    1. Pulire la zona del collo togliendo la pelle e le ghiandole salivari.
    2. Eseguire un taglio lungo la linea mediana dello sterno attraverso il manubrio con le forbici. Fare attenzione che le forbici soggiorno vicino alla parte posteriore dello sterno per evitare di danneggiare il sistema vascolare che si trova strettamente sotto lo sterno. Tirare entrambi i lati della gabbia toracica con una pinza per aprire completamente la cavità toracica. Carotidi dovrebbero essere parzialmente visibile.
    3. Pulire tirando i muscoli e del tessuto connettivo e grasso con pinzette bene fino a quando la carotide destra, arteria brachiocefalica la biforcazione subclavian e arco aortico sono puliti e isolati delle circostanti del tessuto connettivo e grasso (Figura 2C).
  7. Rimuovere la BCA
    1. Usando il forcipe, afferrare la carotide destra sotto sua biforcazione e fare un taglio iniziale sopra il forcipe (Figura 2D).
    2. Ancora in mano la carotide, fare un secondo taglio attraverso l'arteria succlavia. I due tagli finali sono attraverso l'arco aortico, su entrambi i lati dell'arteria brachiocefalica (Figura 2D).
    3. Raccogliere altri tessuti vascolari di interesse (ad es., aorta addominale, parte superiore del cuore contenente la radice aortica).
    4. Posto la BCA e altri tessuti in soluzione al 4% PFA durante la notte a temperatura ambiente.
      Nota: Il tempo di fissazione deve rimanere coerenza in tutto lo studio.

4. tessuto lavorazione e sezionamento

  1. Rimuovere il tessuto da 4% PFA e posto in una cassetta con etichetta tessuto (Figura 3A). Imbottiture per l'uso, nella cassetta per garantire il tessuto mantengono il suo orientamento e rimane nel cassetto attraverso la fase di lavorazione (Figura 3B). Chiudere le cassette e immergere in etanolo al 70% fino a (da 24 a 72 h) di lavorazione del tessuto.
    1. BCA di processo e di altri tessuti raccolti per istologico ed immunofluorescenza colorazione come segue (esempio di procedura di routine durante la notte utilizza un processore con penetrazione vuoto): 10% neutra tamponata formalina per 30 min a temperatura ambiente (2x), 75% etanolo per 60 min a 30 ° C (1x), 90% di etanolo per 60 min a 30 ° C (1x), etanolo al 95% per 60 min a 30 ° C (1x), etanolo al 100% per 60 min a 30 ° C (3x), xilene per 60 min a 30 ° C (3 x) e cera di paraffina per 80 min a 62 ° C (3x).
  2. Incorporare BCA verticalmente, con la più vicina al lato di blocco (Figura 3C) dell'arco aortico.
  3. Tagliare il blocco di paraffina su un microtomo rotativo (10 µm di spessore) fino a raggiungere il tessuto incorporato.
  4. Una volta che il tessuto è visibile, è possibile esaminare una sezione al microscopio per determinare la posizione. Se l'arco aortico è ancora visibile, rimuovere fino a dieci 10 µm sezioni alla volta, esaminando una sezione a ogni intervallo.
  5. Quando l'arco aortico è stato sezionato attraverso e arteria brachiocefalica è visibile, regolare l'orientamento del blocco per posizionare il tessuto completamente perpendicolare alla lama del microtomo.
  6. Tagliare la BCA con uno spessore di sezione di 10 µm. A quel punto, tutte le sezioni sono raccolti in serie con tre sezioni per ogni diapositiva. Raccogliere fino a raggiungere la biforcazione succlavia (Figura 3D).
    Nota: È importante tagliare il BCA con uno spessore di sezione di 10 µm per acquisizione di immagini confocal successive z-stack e singola cella contando. Questo spessore permetterà la valutazione rigorosa e non cofounding dell'associazione tra un singolo nucleo e citoplasma o membrana colorazione però la profondità della sezione trasversale.

5. immunofluorescenza colorazione

Nota: Una completa caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche include la valutazione dei parametri morfologici e indici di stabilità della placca o di instabilità e di composizione cellulare che non sarà al centro del presente protocollo. Morfologia della lesione, il contenuto di collagene e intraplaque l'emorragia può essere analizzati da Movat7,17, percentuale rosso 7,31, Ter119 colorazione 7,18, rispettivamente. Qui, descriviamo il protocollo per analizzare la composizione cellulare delle lesioni.

  1. Incubare i vetrini nelle seguenti soluzioni a temperatura ambiente sotto una cappa chimica: xilene per 5 min (2x), etanolo al 100% per 5 min (2x), etanolo al 95% per 5 min (2x), etanolo al 70% per 5 min (2x) e H2O deionizzata (diH2O) per 5 min (x 2).
  2. Incubare i vetrini nella soluzione di smascheramento dell'antigene seguendo le istruzioni del produttore.
    1. Con acido citrico basato soluzione lo smascheramento dell'antigene (Vedi Tabella materiali), diluire 3 mL di soluzione in 320 mL di diH2O. Posizionare i vetrini in una colorazione serbatoio e riempire verso l'alto con la soluzione di recupero dell'antigene preparato.
    2. Riempire qualsiasi slot vuoti nel portavetrini con diapositive vuote per garantire anche il riscaldamento. Coprire il recipiente con un coperchio per consentire la soluzione di recupero dell'antigene a bollire senza evaporazione.
    3. I vetrini in un forno a microonde per 20 min a circa 675-700 watt di calore. Controllare le diapositive regolarmente e Sostituisci evaporato liquido con diH2O tale che le sezioni rimangono immersi in soluzione che smaschera in ogni momento.
    4. Lasciare i vetrini raffreddare in soluzione per 1 h a temperatura ambiente.
  3. Sciogliere 6 g di gelatina di pelle di pesce (FSG) in 1 L di PBS. PBS/FSG è usato come tampone di lavaggio. Preparare una soluzione bloccante del siero normale di 10% in PBS/FSG.
    Nota: Gelatina di pesce della pelle viene utilizzata nella preparazione di tampone bloccante. FSG non contiene proteine del siero che possono cross-reagiscono con gli anticorpi dei mammiferi, riducendo al minimo rumore di fondo. Tuttavia, altre opzione di blocco dovrebbe essere comodo con sistemi di rilevamento di biotina come FSG contiene biotina endogena. Il tipo di siero normale utilizzato è basato sull'anticorpo secondario utilizzato. Quando vengono utilizzati anticorpi secondari asino, siero equino normale deve essere selezionato per diluizioni di anticorpo e di blocco.
  4. Incubare i vetrini in PBS per 5 min a temperatura ambiente. Sezioni di tessuto di cerchio con una penna idrofobica. Coprire le sezioni con il tampone di bloccaggio del siero di PBS/FSG/normale per 1 h a temperatura ambiente. Preparare la soluzione di anticorpo primario nel siero normale/PBS/FSG durante questo passaggio, mentre i tessuti stanno bloccando.
  5. Incubare con gli anticorpi primari diluiti nel siero di PBS/FSG/normale durante la notte a 4 ° C in una camera umida. Una sezione per ogni diapositiva deve essere incubata con un mix di IgG anticorpi di controllo alla stessa concentrazione come gli anticorpi primari di controllo per la specificità dell'anticorpo primario.
  6. Lavare i vetrini come segue a temperatura ambiente: PBS/FSG per 5 min (3x), quindi PBS per 5 min (1x).
  7. Incubare con anticorpi secondari coniugati fluoroforo (Vedi Tabella materiali) e diamidino-2-phenylindole (DAPI) per nucleo colorazione di contrasto diluito nel siero di PBS/FSG/normale per 1 h a temperatura ambiente. Proteggere i vetrini dalla luce.
  8. Lavare i vetrini come descritto al punto 5.6.
  9. Montare le diapositive utilizzando mezzi di montaggio adatto per fluorescenza (Vedi Tabella materiali).

6. microscopio confocale

Nota: L'uso di un microscopio confocale e l'acquisizione di z-stack è fondamentale per il conteggio di cella singola.

  1. Impostare i parametri di acquisizione deve essere utilizzato in tutto lo studio: immagine ad alta risoluzione (1024 x 1024 o 2048 x 2048 pixel); Percorso ottico e numero di canali, che sono una funzione della combinazione di anticorpi secondari selezionati; velocità di scansione (consigliato a velocità di scansione: 7-8); e canale (DIC) contrasto differenziale di interferenza.
  2. Utilizzando sezioni macchiate con gli anticorpi primari e IgG Controllo, impostare la sensibilità del rilevatore, potenza laser e offset per ogni singolo canale. Il controllo di IgG è utilizzato per ridurre al minimo il segnale di fondo.
  3. Impostare le posizioni superiori e inferiori per l'acquisizione di z-stack. Predeterminare lo spessore e il numero di stack di acquisire. Questi parametri devono rimanere coerenti in tutto lo studio.
    Nota: Si consiglia di imaging 8 a 10 pile di 1 µm di spessore. Rimanere coerenti nel numero di pile imaged in tutto lo studio.
  4. Sezioni di immagine tessuto macchiato con gli anticorpi primari e IgG controllo per tutti i canali compresi DIC.
  5. Etichetta almeno un'immagine con una barra di scala per la calibrazione delle immagini durante il conteggio della singola cella.

7. singola cella contando

  1. Installare e aprire ImageJ. Se necessario, scaricare il plugin nella sezione Download > Input/Output della ImageJ sito Web per aprire il file di immagine generato a seconda del formato delle immagini generate dal microscopio confocale.
  2. Aprire il file di immagine in ImageJ.
  3. Calibrare l'immagine con una scala di riferimento barra utilizzando l'immagine generata nel paragrafo 6.6.
  4. Delineare l'area di interesse in cui Contiamo singola cella verrà eseguita utilizzando il canale DIC (Figura 4).
    Nota: Una regione può essere delineata in un momento. A seconda delle domande sperimentale, contiamo di singola cellula può essere eseguita nella zona intera lesione (vedere 7.3.1) e/o in un'ubicazione secondaria della lesione. Ad esempio, indagine sulla zona del cappuccio fibroso (Vedi 7.3.2) è particolarmente rilevante poiché la sua composizione cellulare è un indice importante della propensione di lesione alla rottura.
    1. Delineare l'area di lesione seguendo il confine di lumen (Figura 4A; frecce bianche) e la lamina elastica interna (Figura 4A; frecce gialle) visibile nell'immagine di DIC.
    2. Per l'analisi dell'area cappuccio fibroso, determinare il confine distante di 30 µm dal lume e traccia il confine ( Figura 4B-D).
      Nota: L'area di cappuccio fibroso è classicamente definita come la regione arricchita in cellule ACTA2 + e collagene garzare il lume (Figura 4B). L'arricchimento in ACTA2 + cella e collagene svolge un ruolo critico nella stabilità della lesione. Precedenti studi hanno determinato che le ACTA2 + cella ricca cappuccio fibroso medie zona uno spessore di 30 µm dal lume in SMC-lignaggio traccia ApoE- / - topi alimentati una dieta ad alta percentuale di grassi per 18 a 26 settimane (Figura 4C). Così, meticolosa caratterizzazione degli effetti della manipolazione genetica o trattamento farmacologico sulla composizione cellulare zona cappuccio fibroso è notevolmente rilevante.
  5. Aprire il pannello Strumenti di canali (Image > colore > canale strumenti) e macchiatura pseudo-colore i diversi canali (Figura 5A; 1 casella).
  6. Unire i canali di colore (Image > colore > Unisci colori) (Figura 5A; box 2). Tutti i canali devono essere visibili sull'immagine stessa (Figura 5B). Attivare e disattivare singoli canali di colore tramite il pannello di Strumenti canale (Figura 5A; 1 casella).
  7. Impostare lo strumento conteggio.
    1. Fare clic con il pulsante destro sull'icona nella barra degli strumenti conteggio (Figura 5C; box 1) e selezionare Lo strumento multi-punto.
    2. Fare doppio clic sulla stessa icona per aprire il pannello di Strumento punto (Figura 5C; casella 2).
    3. Selezionare il tipo e la dimensione degli elementi utilizzati per contare le celle.
    4. Verifica visualizzare tutto.
  8. Attivare il canale DAPI solo nel pannello Strumenti di canale e selezionare il canale del contatore 0 (Figura 5C; casella 3). Fare clic su diversi nuclei che saranno etichettati (ad es., giallo punti in Figura 5C-D). Z-stack di scorrimento per contare tutti i nuclei macchiati nella regione di interesse. Il numero degli eventi è indicato sotto il canale di contatore nel Punto strumento pannello (Figura 5C; casella 4).
  9. Girare su un altro canale di colorazione (ad es., colorazione eYFP). Selezionare il canale 1 del contatore. Fare clic su celle in cui c'è una colocalizzazione tra DAPI e colorazione. Per la macchiatura citoplasmica, selezionare le celle per con la macchiatura circonda il nucleo su tutta la profondità del nucleo (controllare diversi z-stack).
  10. Ripetere modificando la macchiatura combinazioni e selezionando nuovi canali di conteggio per contare le popolazioni delle cellule di interesse. Colore ogni puntino rappresenta una popolazione di cellule diverse(Figura 5). Risultati possono essere espressa come numero di cellule per numero totale di DAPI o numero di celle per regione area.

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Results

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Myh11- Cre/ERT2 R26R-EYFP Apoe- / - topi sono stati iniettati con tamoxifene tra sei e otto settimane di età prima di essere alimentati una dieta grassa alta. A 18 settimane della dieta grassa alta alimentazione, due gruppi di otto topi sono stati trattati settimanalmente con un anticorpo monoclonale anti-IL-1 β topo o un controllo di IgG isotipo-pari a 10 mg/kg per 8 settimane (Figura 1)7. Topi sono stati sacrifica...

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Discussion

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Nonostante decenni di ricerca e progressi tecnici nello studio della aterosclerosi, il campo ha una storia deludente di tradurre le scoperte scientifiche a terapie cliniche34,35. Questo fenomeno può essere spiegato in parte dalle discrepanze in modelli animali, disegni sperimentali e analisi della lesione. Qui, descriviamo una pipeline sperimentale che abbiamo usato per analizzare la composizione cellulare in lesioni aterosclerotiche avanzate utilizzando lignaggi...

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

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Ringraziamo il centro per l'Imaging biologico (supportato da NIH 1S10OD019973-01) presso l'Università di Pittsburgh per la loro assistenza. Questo lavoro è stato supportato da è supportato da Scientific Development Grant 15SDG25860021 dall'associazione americana del cuore di r.a.b. D.G. è stata sostenuta dal NIH concedere F30 HL136188.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Paraformaldeide soluzione acquosa Microscopiaelettronica ScienzeRT 15710Perfusione e fissazione tissutale
23G ago a farfallaFisherBD367342
25G agoFisher14-821-13D 
Microscopio confocale A1Microscopio confocaleNikon
Anticorpo ACTA2-FITC (topo)Sigma AldrichF3777Anticorpo primario
Alexa-647 anti capraInvitrogenA-21447Anticorpo secondario
Soluzione di smascheramento dell'antigene, a base di acido citricoVector LabsH-3300Soluzione di recupero dell'antigene
Chow DietHarlan TekladTD.7012
Vetrino coprioggettiFisher12-544-14Qualsiasi vetro di copertura 50 x 24 mm
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)InvitrogenD1306Nucleo fluorescente controcolorazione
Donkey Alexa-488 anti-coniglioInvitrogenA-21206Anticorpo secondario
Donkey Alexa-555 anti-rattoAbcamab150154Anticorpo secondario
DPBS 10X senza Calcio e MagnesioGibco14200166PBS per diluizioni e lavaggi in soluzione. Diluire a 1x in acqua deionizzata
Cassetta per inclusioneFisher15-182-701D
Tubo a vuoto ETDAFisher02-685-2B
Etanolo 200 proofDecon2701
Tampone in schiumaFisher22-222-012
Gelatina da pelle di pesce d'acqua freddaAnticorpo Sigma AldrichG7765
GFP (capra)abcamab6673Anticorpo primario
di capra ControlloIgG Vector LabsI-5000Controllo IgG
Dieta ricca di grassiHarlan TekladTD.88137
ImageJNIHProgramma per computer https://imagej.nih.gov/ij/ 
Anticorpo LGALS3 (ratto)CedarlaneCL8942APAnticorpo primario
LSM700 Microscopio confocaleZeissVetrini
microscopio, Superfrost PlusFisher12-550-15
Lame per microtomoFisher30-538-35
Controllo IgG di topoVector LabsI-2000Controllo
IgGSoftware di imaging degli elementi NISNikonper l'acquisizione di immagini z-stack
Siero di cavallo normaleSigma AldrichH1270
Pap PenFisher50-550-221
Olio di arachidiSigmaP2144
Prolong gold Antifade mountantInvitrogenP36930Supporto di montaggio 
Controllo IgG di coniglioVector LabsControllo IgG I-1000IgG
rattoControllo IgG Vector LabsI-4000Controllo IgG
Anticorpo RUNX2 (coniglio)Abcamab192256anticorpi primari
BD309628Siringa da 1 ml
TamoxifeneSigmaT5648
XyleneFisherX55K-4
Software di imaging ZenZeissImaging per l'acquisizione di
per Software di imaging Controllo per Siringa per Software immagini z-stack

References

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