Osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xilema fornisce informazioni significative per quanto riguarda la dinamica del flusso d'acqua nelle piante legnose. In questo studio, dimostriamo l'approccio pratico per osservare la distribuzione dell'acqua xylem in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM, che elimina i cambiamenti artifactuali nello stato dell'acqua durante la preparazione del campione.
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Articolo metodologico
Distribuzione dell'acqua Xylem nelle piante legnose con un microscopio elettronico a scansione crio-scansione
In questo articolo
Sommario
Abstract
Un microscopio elettronico a scansione installato crio-unità (crio-SEM) consente l'osservazione dei campioni a temperature sotto zero ed è stato utilizzato per esplorare la distribuzione dell'acqua nei tessuti delle piante in combinazione con tecniche di fissazione del congelamento utilizzando azoto liquido (LN 2). Per le specie legnose, tuttavia, i preparativi per l'osservazione della superficie trasversale dello xilema comportano alcune difficoltà dovute all'orientamento delle fibre di legno. Inoltre, una maggiore tensione nella colonna d'acqua nei condotti xylem può occasionalmente causare cambiamenti artifactuali nella distribuzione dell'acqua, soprattutto durante la fissazione e la raccolta dei campioni. In questo studio, dimostriamo una procedura efficace per osservare la distribuzione dell'acqua all'interno dello xylem delle piante legnose in situ utilizzando un criostato e un crio-SEM. In un primo momento, durante la raccolta del campione, misurare il potenziale dell'acqua xylem dovrebbe determinare se è presente un'alta tensione nei condotti xylem. Quando il potenziale dell'acqua xylem è basso (< ca. 0,5 MPa), è necessaria una procedura di rilassamento della tensione per facilitare una migliore conservazione dello stato dell'acqua nei condotti xylem durante la fissazione del congelamento del campione. Successivamente, un collare a tenuta stagna è attaccato intorno al gambo dell'albero e riempito con LN2 per la fissazione del congelamento dello stato dell'acqua di xylem. Dopo la raccolta, occorre fare attenzione a garantire che il campione sia conservato mentre si completano le procedure di preparazione del campione per l'osservazione. Un criostato viene impiegato per esporre chiaramente la superficie xylem taglio trasversale. Nelle osservazioni crio-SEM, è necessaria la regolazione del tempo per il congelamento per rimuovere la polvere di gelo e accentuare il bordo delle pareti cellulari sulla superficie di visualizzazione. I nostri risultati dimostrano l'applicabilità delle tecniche crio-SEM per l'osservazione della distribuzione dell'acqua all'interno di xylem a livello cellulare e subcellulare. La combinazione di crio-SEM con tecniche di osservazione in situ non distruttive migliorerà profondamente l'esplorazione delle dinamiche del flusso idrico delle piante legnose.
Introduzione
La disponibilità di risorse idriche (ad esempio, precipitazioni, contenuto di acqua del suolo) determina rigorosamente la mortalità e la distribuzione geografica delle specie vegetali, poiché devono assorbire l'acqua dal suolo e trasportarla alle foglie per la produzione fotosintetica. Gli impianti devono mantenere il loro sistema di trasporto idrico sotto l'approvvigionamento idrico fluttuante. In particolare, le piante legnose generano alte tensioni nei loro condotti lungo i corsi d'acqua di traspirazione in quanto, in alcuni casi, hanno bisogno di tenere la corona a più di 100 m da terra. Per mantenere le colonne d'acqua sotto una pressione negativa così elevata, i....
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Protocollo
NOTA: un grafico schematico di questo protocollo è illustrato nella Figura 1.
1. Campionamento: Rilassamento della tensione all'interno della colonna d'acqua dei condotti Xylem
NOTA: Il seguente trattamento di rilassamento della tensione è raccomandato prima dell'applicazione LN2 per evitare sia il congelamento che gli artefatti indotti dalla tensione nella distribuzione dell'acqua xylem.
- Racchiudere un ramo e le foglie per il campionamento con un sacchetto di plastica nera per eclacazione il potenziale idrico tra xylem e foglie più di due ore prima del campionam....
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Risultati
Immagini rappresentative di superfici trasversali di xylem di conifere e a foglia larga, osservate dal crio-SEM, sono mostrate nella Figura 2. A basso ingrandimento, l'area nera nelle immagini indica le cavità da cui l'acqua scompare interamente o parzialmente e l'area grigia indica pareti di cellule xylem, citoplasma e acqua (Figura 2A). Ad alto ingrandimento, è evidente che l'acqua non è completamente persa dal.......
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Discussione
I metodi di osservazione crio-SEM introdotti in questo documento sono pratici per visualizzare chiaramente la distribuzione dell'acqua su scala cellulare. Attraverso questo metodo, esplorare i cambiamenti nella distribuzione dell'acqua all'interno di xylem può potenzialmente aiutare a chiarire il meccanismo di tolleranza delle specie arboree allo stress abiotico (carenza di acqua o congelamento) o allo stress biotico (malattia degli alberi).
Il passo più importante in questo metodo è preservar.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da JSPS KAKENHI (N. . 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| materiale di rivestimento | JOEL Ltd., Giappone | Filo d'oro, 0,50 & 1000 mm, 99,99 %, Codice 125000499 | |
| microscopio elettronico a scansione criogenica | JOEL Ltd., Giappone | JSM-6510 installato con criostato MP-Z09085T / MP-51020ALS | |
| microtomo | Thermo Scientific | CryoStar NX70 | |
| Lame per microtomo monouso Thermo Scientific HP35 ULTRA, 3153735 | |||
| mezzo di inclusione per congelamento dei tessuti | Thermo Scientific | Shandon Cryomatrix resina per inclusione, |
Riferimenti
- Tyree, M. T., Zimmermann, M. H. Xylem structure and the ascent of sap. , Springer-Verlag Berlin Heidelberg. Berlin, Heidelberg. (2002).
- Choat, B., Jansen, S., et al. Global convergence in the vulnerability of forests to drought. Nature. 491 (7426), 752-755 (2012).
- Klein, T., Zeppel, M. J. B., et al.
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Ristampe e permessi
