Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

Akiteru Maeno; Hisanori Kohtsuka; Kensuke Takatani; Hiroaki Nakano

doi:10.3791/59161

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Articolo metodologico

Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)

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DOI:

10.3791/59161

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6 agosto 2019

Akiteru Maeno¹ , Hisanori Kohtsuka² , Kensuke Takatani³ , Hiroaki Nakano³

¹Mammalian Genetics Laboratory, National Institute of Genetics, ²Misaki Marine Biological Station, The University of Tokyo, ³Shimoda Marine Research Center, University of Tsukuba

In questo articolo

Sommario

Qui, i protocolli per l'esecuzione di immagini di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) microfocus di tre animali invertebrati marini sono spiegati in dettaglio. Questo studio descrive passaggi quali la fissazione dei campioni, la colorazione, il montaggio, la scansione, la ricostruzione delle immagini e l'analisi dei dati. Vengono inoltre forniti suggerimenti su come il protocollo può essere regolato per diversi campioni.

Abstract

Tradizionalmente, i biologi hanno dovuto fare affidamento su metodi distruttivi come il sezionamento per studiare le strutture interne degli organismi opachi. L'imaging di tomografia computerizzata a raggi X (microCT) non distruttivo è diventato un protocollo potente ed emergente in biologia, grazie ai progressi tecnologici nei metodi di colorazione dei campioni e nelle innovazioni nell'hardware microCT, nei computer di elaborazione e nei dati software di analisi. Tuttavia, questo protocollo non è comunemente usato, come è nei campi medico e industriale. Uno dei motivi di questo uso limitato è la mancanza di un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari: raccolta dei campioni, fissazione, colorazione, montaggio, scansione e analisi dei dati. Un'altra ragione è la grande diversità dei metazoi, in particolare degli invertebrati marini. A causa delle diverse dimensioni, morfologie e fisiologie degli invertebrati marini, è fondamentale regolare le condizioni sperimentali e le configurazioni hardware ad ogni fase, a seconda del campione. Qui, i metodi di imaging microCT sono spiegati in dettaglio utilizzando tre invertebrati marini filogeneticamente diversi: Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) e Xenoturbella japonica ( Xenoturbellida, Xenacoelomorpha). Vengono inoltre forniti suggerimenti sull'esecuzione di immagini microCT su vari animali.

Introduzione

I ricercatori biologici hanno generalmente dovuto fare sezioni sottili ed eseguire osservazioni con microscopia leggera o elettronica al fine di studiare le strutture interne degli organismi opachi. Tuttavia, questi metodi sono distruttivi e problematici se applicati a esemplari rari o preziosi. Inoltre, diversi passaggi del metodo, ad esempio l'incorporamento e il sezionamento, richiedono molto tempo e possono essere necessari diversi giorni per osservare un campione, a seconda del protocollo. Inoltre, quando si maneggiano numerose sezioni, c'è sempre la possibilità di danneggiare o perdere alcune sezioni. Tecniche di sgombero dei tessuti sono disponibili per alcuni esemplari¹^,²^,3^,⁴^,⁵ ma non sono ancora applicabili a molte specie animali.

Per superare questi problemi, alcuni biologi hanno iniziato a utilizzare la tomografia computerizzata a raggi X microfocus (microCT)⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁰^,¹¹^, ¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵. Nella TC a raggi X, il campione viene irradiato con raggi X da varie angolazioni generate da una sorgente di raggi X che si muove intorno al campione e i raggi X trasmessi vengono monitorati da un rilevatore che si muove anche intorno al campione. I dati di trasmissione a raggi X ottenuti vengono analizzati per ricostruire le immagini trasversali del campione. Questo metodo consente l'osservazione di strutture interne senza distruzione del campione. A causa della sua sicurezza e facilità, è comunemente usato in applicazioni mediche e dentali, e sistemi CT possono essere trovati in ospedali e centri dentali in tutto il mondo. Inoltre, la TAC industriale a raggi X viene spesso utilizzata per l'osservazione di campioni non medici per l'ispezione e la metrologia nel campo industriale. A differenza della Tac medica, in cui la sorgente di raggi X e i rilevatori sono mobili, le due parti sono fissate nella TC industriale, con il campione che ruota durante la scansione. La TC industriale produce generalmente immagini ad alta risoluzione rispetto alla TC medica ed è indicata come microCT (risoluzione a livello di micrometro) o nanoCT (risoluzione a livello di nanometri). Recentemente, la ricerca con microCT è rapidamente aumentata in vari campi della biologia¹⁴^,¹⁵,¹⁶^,¹⁷^,¹⁸^,¹⁹^, ^{20 anni} ^, ^{21 Mieto} ^, ^{22 Milia} ^, ²³ del 23 o ^, ²⁴ Mi lasa' di ^, ^{25 mi} lato ^, ²⁶ del sistema di ^, ^{27 mi} lapiùdel ^, ^{28 mi la} più del 24 ^, ²⁹ del 22 221 ^, ³⁰ milio ^, ^{31 Milia} ^, ^{32 Milia} risse ^, ³³ Mi lasa ^, ³⁴.

Studi biologici che utilizzano TC inizialmente miravano a strutture interne che consistono principalmente di tessuto duro, come l'osso. I progressi nelle tecniche di colorazione utilizzando vari agenti chimici hanno permesso la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi⁶^,⁷^,⁸^,⁹^,¹⁴^,¹⁵ ^, ¹⁶ ^, ¹⁷ mi lato ^, ¹⁸ mi lato ^, ¹⁹ del 12 ^, ^{20 anni} ^, ^{21 Mieto} ^, ^{22 Milia} ^, ²³ del 23 o ^, ²⁴ Mi lasa' di ^, ^{25 mi} lato ^, ²⁶ del sistema di ^, ^{27 mi} lapiùdel ^, ^{28 mi la} più del 24 ^, ²⁹ del 22 221 ^, ³⁰ milio ^, ^{31 Milia} ^, ^{32 Milia} risse ^, ³³ Mi lasa ^, ³⁴. Di questi reagenti, gli agenti di contrasto a base di iodio sono relativamente sicuri, economici e possono essere utilizzati per la visualizzazione dei tessuti molli in vari organismi⁷^,¹⁴. Per quanto riguarda gli invertebrati marini, la microCT è stata ampiamente utilizzata su animali come molluschi⁶^,²⁵^,³²^,³³, annelidi¹⁸^,¹⁹^, ^{20 anni} ^, ²⁸e arboridi²¹^,²³^,²⁹^,³¹. Tuttavia, ci sono state poche segnalazioni su altri phyla animale, come bryozoans⁶, xenacoelomorfi²⁶, e cnidarians²⁴^,³⁰. In generale, ci sono stati meno studi che utilizzano microCT sugli invertebrati marini rispetto a quelli sui vertebrati. Uno dei motivi principali di questo uso limitato sugli invertebrati marini è la grande diversità osservata in questi animali. A causa delle loro diverse dimensioni, morfologie e fisiologie, ogni specie reagisce in modo diverso alle diverse procedure sperimentali. Pertanto, durante la preparazione del campione è fondamentale scegliere la fissazione e il reagente di colorazione più appropriati e impostare le condizioni ad ogni fase, regolate per ogni specie. Allo stesso modo, è anche necessario impostare le configurazioni di scansione, come il metodo di montaggio, la tensione, la corrente, la velocità di ingrandimento meccanica e la potenza di risoluzione dello spazio, in modo appropriato per ogni campione. Per superare questo problema, è essenziale un manuale semplice e comprensibile che copra tutti i passaggi necessari, spiega come ogni passaggio può essere regolato a seconda del campione e mostra esempi dettagliati tratti da più campioni.

Nel presente studio, descriviamo il protocollo di microCT, passo dopo passo, dalla fissazione dei campioni all'analisi dei dati, utilizzando tre specie di invertebrati marini. Gli esemplari dell'anemone marino Actinia equina (Anthozoa, Cnidaria) sono stati raccolti nei pressi della Stazione Biologica Marina di Misaki, dell'Università di Tokyo. Avevano un corpo sferico e morbido di circa 2 cm di diametro (Figura 1A-C). Sono stati raccolti anche campioni di Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) nei pressi della stazione biologica marina di Misaki. Erano vermi sottili che erano di circa 1,5 cm di lunghezza, con chaetae duri presenti lungo tutto il corpo (Figura 1D). Un xenoturbella japonica³⁵ (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) esemplare è stato raccolto vicino a Shimoda Marine Research Center, Università di Tsukuba, durante il 13th COASTAL Organism Joint Survey. Era un verme dal corpo morbido che era di circa 0,8 cm di lunghezza (Figura 1E). Le regolazioni effettuate per le condizioni e le configurazioni di ciascun campione sono spiegate in dettaglio. Il nostro studio fornisce diversi suggerimenti su come eseguire l'imaging microCT sugli invertebrati marini, e speriamo che ispirerà i biologi a utilizzare questo protocollo per la loro ricerca.

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Protocollo

1. Fissazione

Per Actinia equina,rilassare gli animali in 10% MgCl₂ acqua di mare per circa 15 min a temperatura ambiente. Trasferire al 70% di etanolo e conservarlo a temperatura ambiente.
Per Harmothoe sp., anestesizzare gli animali mettendoli in acqua di mare ghiacciata per circa 15 min. Trasferire al 10% (v/v) soluzione formalina con acqua di mare e conservarli a temperatura ambiente.
Per Xenoturbella japonica,rilassare l'animale utilizzando il 7% MgCl₂in acqua dolce. Fissare in 4% paraformaldeide (PFA) in acqua di mare filtrata durante la notte. Mettere in 70% etanolo e conservare a 4 gradi centigradi.
AVVISO: il PFA è pericoloso e deve essere maneggiato con cura.

2. Colorazione

Trasferire i campioni al 50% di etanolo e conservarli a temperatura ambiente per 15 h. Sostituire il 50% di etanolo con il 25% di etanolo e conservarli a temperatura ambiente per 2 h.
NOTA: Questo non è necessario per il campione Harmothoe sp. in soluzione formalina 10% (v/v) con acqua di mare.
Sostituire la soluzione con acqua distillata (DW) e conservare i campioni in DW a temperatura ambiente per 2 h. Ripetere questo passaggio tre volte.
Preparare la soluzione 25% Lugol diluindo la soluzione stock (sotto) al 25% con DW. Soluzione di riserva (100% soluzione Lugol) contiene 10 g di KI e 5 g di I₂, regolato a 100 mL con DW.
NOTA: la soluzione Lugol è sensibile alla luce, quindi conserva e gestisci la soluzione protetta dalla luce. Seguire le normative di ogni paese e istituzione per la movimentazione dello iodio e lo smaltimento dei rifiuti.
Decant il DW dai campioni e versare nella soluzione 25% Lugol. Macchie per 24 h a temperatura ambiente.

3. Montaggio a tappe

Preparare lo 0,5% di agarose sciogliendo 500 mg di agarose in 100 mL di DW in una fiaschetta conica da 250 ml in un forno a microonde (800 W, circa 1-3 min). Raffreddare fino a circa 30-40 gradi centigradi mantenendo a temperatura ambiente.
AVVISO: Non surriscaldare o sigillare completamente il pallone durante il riscaldamento per evitare che l'agarose ebollisca.
Montare campioni di grandi dimensioni come A. equina utilizzando un tubo da 50 mL.
NOTA: Utilizzare tubi da 50 mL per il montaggio di campioni di grandi dimensioni che non si adattano a una punta 'blu' di micropipette da 1.000 l.l.
1. Mettere il campione colorato in un piatto da 60 mm con DW per lavare via un'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie.
2. Versare delicatamente 5 mL dello 0,5% di agarose in un tubo da 50 mL e indurire l'agarose sul ghiaccio. Fare attenzione a non fare bolle nell'agarose.
3. Aggiungere delicatamente 20 mL di 0,5% di agarose al tubo da 50 mL e mettere sul ghiaccio fino a quando l'agarose inizia a indurirsi. Posizionare il campione all'interno dello 0,5% di agarose usando le pinze. Fare attenzione a non fare bolle nell'agarose.
4. Regolare la posizione e l'orientamento del campione con pinze e indurire l'agarose sul ghiaccio.
5. Posizionare l'argilla sullo stadio di montaggio microCT e impostare il tubo da 50 mL sull'argilla (Figura 2A).
Montare piccoli campioni come Harmothoe sp. e X. japonica utilizzando una punta 'blu' di micropipette da 1.000 .L.
NOTA: Per i campioni più piccoli, è possibile utilizzare la punta "giallo" di micropipette a 200 . In questo caso, utilizzare 30 l di agarose per la spina e aggiungere 200 lofd di acqua agarose o distillata.
1. Prelevare 100 L dello 0,5% di agarose in una punta 'blu' di micropipette da 1.000 ,L e indurire l'agarose tenendo la punta sul ghiaccio, facendo una spina nella punta (Figura 2B-a).
2. Decant il campione macchiato in un piatto di 60 mm senza usare pinze.
3. Trasferire delicatamente il campione utilizzando pinzette ad anello in un altro piatto da 60 mm con DW per lavare via un'eccessiva soluzione di colorazione dalla superficie.
4. Aggiungere 1.000 L di 0,5% di agarose o DW nella punta collegata (passaggio 3.3.1) utilizzando una micropipetta.
  NOTA: si raccomanda l'uso di agarose dello 0,5%, ma utilizzare DW per campioni fragili o preziosi in cui agarose dovrebbe essere evitato.
5. Trasferire delicatamente il campione dal piatto da 60 mm nell'agarose o dW nella punta collegata utilizzando una pinzetta ad anello.
6. Regolare delicatamente la posizione e l'orientamento del campione con un ago petiolato o una pinzetta di precisione. Fare attenzione a non fare bolle nel supporto di montaggio. Assicurarsi che il campione sia stabile tra le pareti della punta quando DW viene utilizzato come supporto di montaggio (Figura 2D-b). Posizionare la punta sul ghiaccio per indurire l'agarose se viene utilizzata come mezzo di montaggio.
7. Tagliare la punta di una nuova punta 'blu' di micropipette da 1.000 (Figura2B-b,c) e inserire la punta della punta collegata nella nuova punta.
8. Posizionare l'argilla sulla fase di montaggio microCT e impostare le punte con il campione all'interno sull'argilla (Figura 2C,D).
  NOTA: La soluzione di colorazione inizierà a lavare via il campione una volta inserito in DW, quindi procedere al passaggio successivo della scansione.

4. Scansione MicroCT

Accendere il fascio di raggi X a 80 kV, 100 A.
Osservando l'immagine di trasmissione a raggi X al centro dello schermo (Figura 3A), spostare lo stage in modo che l'intero campione possa essere visualizzato facendo clic sui pulsanti dell'asse X e z (Figura 3A) e manualmente regolazione della manopola dell'asse Y sulla fase di montaggio (Figura 3B). Impostare il contrasto dell'immagine in modo che le strutture interne possano essere osservate regolando le condizioni di contrasto (Figura 3A: Contrasto dell'immagine).
Regolare l'orientamento del campione modificando l'angolo del tubo/punta nell'argilla (Figura 2A). Ruotare lo stage di 90 gradi impostando l'asse di rotazione (Figura 3A) su 90 e facendo clic sul pulsante di movimento relativo (Figura 3A). Esegui la stessa manovra quattro volte per completare una rotazione completa.
NOTA: Spegnere manualmente il raggio a raggi X ogni volta che viene aperta la porta campione, a meno che il sistema non lo spenghi automaticamente.
Spostare la fase in modo che il campione si trovi al centro della vista facendo clic sul pulsante dell'asse z (Figura 3A) e regolando manualmente la manopola dell'asse Y sulla fase di montaggio (Figura 3B). Girare il palco di 90 gradi e fare lo stesso. Ruotare la fase a 360 gradi e verificare che il campione si trova al centro della vista da tutte le direzioni.
Spostare lo stage lungo l'asse x verso la sorgente del fascio di raggi X facendo clic sul pulsante dell'asse X (Figura 3A) per ingrandire il campione e regolarlo in base alle esigenze in modo che si adatti alla vista (Figura 3C).
Ruotare lo stage a 360 gradi e regolare in base alle esigenze in modo che il campione si adatti alla vista da tutte le direzioni.
Regolare le condizioni di scansione come mostrato nella Tabella 1.
Avviare la scansione; ci vogliono circa 10 min.

5. Ricostruzione dell'immagine

Avviare il software accessorio del sistema microCT (vedere la tabella deimateriali) e aprire i dati scansionati.
Regolare le differenze nell'asse di rotazione del campione durante la scansione facendo clic sul pulsante di calcolo automatico del valore di spostamento (Figura4A: casella verde).
Regolare l'orientamento dell'immagine ruotando le frecce arancioni (Figura 4B). Se l'orientamento è stato modificato, ripetere il passaggio 5.2.
Fare clic sulla scheda area (Figura4C: casella magenta) e tagliare le aree in cui i campioni non sono presenti (Figura4C: casella gialla).
Fare clic sulla scheda di riconfigurazione (Figura4D: scatola magenta) e impostare i filtri come segue per rimuovere il rumore. Artefatto ad anello ridurre il filtro: filtro mediano -3; Filtro di eliminazione del rumore: filtro medio-1.
Eseguire la riconfigurazione facendo clic sul pulsante di riconfigurazione (Figura4D: casella verde).
Regolare la luminosità e il contrasto dell'immagine impostando i valori in bianco e nero come valore nero 0, valore bianco 250 (Figura4D: casella blu).
Salvare il set di dati dell'immagine TIFF ricostruito come TIFF a 8 bit facendo clic sul pulsante Salva. Rinominare i file TIFF come segue: Date_sample_resolution (m)_number.tiff.
NOTA: i set di dati microCT originali di questo studio sono disponibili nel repository Figshare, doi:10.6084/m9.figshare.7670837³⁶.

6. Analisi dei dati

Avviare il software di analisi dei dati (vedere la tabella dei materiali) e consentire l'importazione di file TIFF facendo clic sull'icona Database (Figura 5A: scatola magenta) e spegnendo la casella mostrata in Figura 5B.
Fare clic sull'icona di importazione (Figura5C: magenta box), selezionare il set di dati salvato nella sezione 5 e fare clic su Apri.
Fare clic sul pulsante Copia collegamenti (Figura 5D) per importare i dati.
Visualizzare la sezione trasversale 2D facendo clic sull'icona del visualizzatore 2D (Figura5C: casella blu).
Calibrare il set di dati facendo clic sulla scheda del visualizzatore 3D (Figura5E: scatola magenta) e immettendo il valore di risoluzione al momento della scansione (che era 0.018 in questo studio [ Figura5F]).
Fare clic sull'icona luminosità/contrasto (Figura5E casella verde). Regolare la luminosità e il contrasto spostando il cursore all'interno dell'immagine 2D visualizzata e modificando il livello della finestra e la larghezza della finestra (Figura 5G).
Controllare altre immagini di sezione spostando la barra di scorrimento (Figura 5G: casella).
Modificare l'orientamento della sezione trasversale facendo clic sull'icona di orientamento (Figura 5E: casella blu) e controllare le immagini a tutti gli orientamenti (Figura 5H).
Fare clic sull'immagine visualizzata e scegliere la scheda Esporta per memorizzare le immagini di sezione trasversale.

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Risultati

Abbiamo eseguito immagini microCT su A. equina (Anthozoa, Cnidaria), Harmothoe sp. (Polychaeta, Annelida) e X. japonica (Xenoturbellida, Xenacoelomorpha) dopo aver colorato i campioni con soluzione 25% Lugol. La colorazione ha migliorato con successo il contrasto delle strutture interne in tutti i campioni, consentendo osservazioni di tessuti molli interni (Figura 6). Insieme alle relazioni passate⁶^,⁷^,...

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Discussione

Fissativi che utilizzano formalina, come la soluzione formalina 10% (v/v) in acqua di mare utilizzata in questo studio, sono noti per preservare la morfologia di diversi invertebrati marini e sono spesso utilizzati per l'imaging microCT¹⁸^,²⁴^,²⁵ ^,²⁶^,²⁸^,³⁰^,³³. Tuttavia, restrizioni sull'uso d...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Ringraziamo Toshihiko Shiroishi per la sua assistenza e per aver fornito l'ambiente di ricerca durante questo studio. Siamo grati a Kensuke Yanagi e Takato Izumi per consigli su A. equina, e Masaatsu Tanaka per consigli sul esemplare Harmothoe sp. Vorremmo ringraziare il personale del Shimoda Marine Research Center, dell'Università di Tsukuba, e della Misaki Marine Biological Station, l'Università di Tokyo per il loro aiuto nelle collezioni di campioni. Ringraziamo Editage (www.editage.jp) per l'editing in lingua inglese. Questo lavoro è stato supportato dal JSPS Grant-in-Aid for Young Scientists (A) (JP2671022) all'HN, e dalla JAMBIO, Associazione Giapponese per la Biologia Marina.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Pallone di Erlenmeyer da 250 ml	Corning	CLS430183
Provetta di campionamento da 5 ml ST-500	BIO-BIK	103010
Tubo in polipropilene da 50 ml	Greiner Bio One International	227261
60 mm Piatto non trattato	IWAKI	1010-060
Agarosio	Promega	V3125
Punta di grado ecologico (blu) 1000 µ l	BMBio	BIO1000RF
Etanolo	Wako Pure Chemical Industries	057-00451
Formalina	Wako Pure Chemical Industries	061-00416
Iodio	Wako Pure Chemical Industries	094-05421
Cloruro di magnesio esaidrato	Wako Pure Chemical Industries	135-00165
OsiriX DICOM Viewer	Pixmeo SARL	OsiriX MD v10.0	https://www.osirix-viewer.com
Paraformaldeide	Wako Pure Chemical Industries	163-25983
Ago picciolato	AS ONE	2-013-01
Pipetman P200 Micropipetta	GILSON	F123601
Pipetman P1000 Micropipetta	GILSON	F123602
Ioduro di potassio	Wako Pure Chemical Industries	166-03971
Pinzetta di precisione 5	DUMONT	0302-5-PS
QuickRack MultI fit tip (giallo) 200 ul	Sorenson	10660
Lamette da barba	Feather	FA-10
Pinzetta ad anello	NAPOX	A-26
Microscopio stereoscopico	Leica	MZ95
sistema di imaging micro-CT a raggi X	Comscantechno	ScanXmate-E090S105

Riferimenti

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Microfocus X-ray CT (microCT) Imaging di Actinia equina (Cnidaria), Harmothoe sp. (Annelida), e Xenoturbella japonica (Xenacoelomorpha)