Questo studio dimostra l'uso di citometria a flusso per rilevare produzione reattiva dell'ossigeno specie (ROS) derivanti dall'attivazione della FcγR. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella funzione dei fagociti in risposta a complessi immuni, opsonized microrganismi o diretto FcγR cross-linking di segnalazione redox e antimicrobico.
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Articolo metodologico
Misurazione del flusso Cytometric di produzione di ROS nei macrofagi In risposta a FcγR cross-linking
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il burst ossidativo o respiratorio è usato per descrivere il rapido consumo di ossigeno e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte dei fagociti in risposta a vari stimoli immuni. ROS generati durante l'attivazione del sistema immunitario esercita la potente attività antimicrobica principalmente attraverso la capacità di ROS di danneggiare il DNA e proteine, causando la morte dei microrganismi. Essere in grado di misurare la produzione di ROS riproducibile e con facilità è necessario al fine di valutare il contributo dei vari meccanismi e nuove molecole per questo meccanismo di difesa ospite. In questa carta, dimostriamo l'utilizzo di sonde fluorescenti e flusso cytometry per rilevare la produzione di ROS. Anche se ampiamente utilizzato, misure in fluorescenza di ROS sono notoriamente problematica, soprattutto per quanto riguarda la misura del ROS indotta da stimoli specifici e non mitogenici. Vi presentiamo una dettagliata metodologia per rilevare ROS generati a seguito di stimolazione specifica di FcγR cominciando con generazione del macrofago, adescamento, colorazione, FcγR cross-linking e termina con l'analisi cytometric di flusso.
Introduzione
Specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole reattive o i radicali liberi che sono sottoprodotti della respirazione aerobica (rivisto in 1). Questi includono l'anione superossido, il perossido, perossido di idrogeno, radicale ossidrile e ioni dell'idrossile, tra gli altri. In condizioni fisiologiche normali, ROS sono prodotte principalmente dalla mitocondri e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi e sono rapidamente disintossicati da vari enzimi e proteine quali superossido dismutasi e glutatione. Una produzione esagerata di ROS o un difetto nella capacità di rimuovere ROS può causare stress ossidativo, per cui le spec....
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Protocollo
Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale Animal Care e uso (IACUC) della Università della Florida centrale.
1. generazione del midollo osseo derivato macrofagi (BMDMs)
-
Preparazione di terreni di coltura
- Preparare il supporto di base D10F: A di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e β-mercaptoetanolo 0,05 mM.
Nota: Anche se è meglio usare fresco D10F media, D10F base media può essere preparato fin....
- Preparare il supporto di base D10F: A di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES) e β-mercaptoetanolo 0,05 mM.
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Risultati
Utilizzando il protocollo delineato all'interno, vi presentiamo dati rappresentativi dimostrando rilevamento di cytometric di flusso della produzione di ROS derivando dallo stimolo di WT C57BL/6J BMDMs attraverso il FcγR. Come previsto, osserviamo i cambiamenti minimi nella fluorescenza FL1 o FL2 sopra i livelli di sfondo in cellule non stimolate (Figura 3A, Confronta vs "macchiati, non stimolate" dot "senza macchia, non stimolate" trame). Si osserva un marcato aumento nella fluorescenza FL1.......
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Discussione
2DCFH -DA e rilevazione basata su DHE di ROS è una tecnica ampiamente usato14,15. Facilità d'uso e l'adattabilità di queste sonde ROS per micropiastra cinetica formati, analisi di cytometric di flusso o microscopia di fluorescenza ha contribuito alla loro popolarità. Tuttavia, nei nostri studi di funzioni FcγR-mediata del macrofago, ci non sembrano essere un protocollo standard per l'esecuzione di questo test per analisi citofluorimetrica delle cellule.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.
Ringraziamenti
Gli autori vorrei ringraziare altri membri del laboratorio Tigno-Aranjuez inclusi Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh per il loro aiuto nella manutenzione di Colonia di manutenzione e topo di laboratorio. Il supporto per questa ricerca è stato fornito da grant R00 HL122365 e fondi di Start-up a J.T.T-A.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Ricerca innovativa anti-BSA IgG1 | IBSA9E2C2 | ||
| Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400626 | |
| Anti-topo CD16/32 | BioLegend | 101302 | |
| Anticorpo anti-topo F4/80 coniugato ad Alexa Fluor 647 | BD Biosciences | 565853 | |
| Anticorpo anti-topo F4/80 coniugato a FITC | BioLegend | 123108 | |
| Anticorpo CD11b anti-topo/umano coniugato ad Alexa Fluor 647 | BioLegend | 101218 | |
| beta-mercaptoetanolo (BME) | Sigma | M3148-100ml | |
| Albumina sierica bovina (BSA) FrazioneV | Fisher | BP1600-100 | |
| C57BL/6J | Codice | 000664 | |
| Sonde molecolari | CM-H2DCFDA | C6827 | Può essere un sostituto del reagente per la rilevazione dello stress ossidativo nel kit Enzo |
| Sonde molecolari | diidroetidio (DHE) | D11347 | Può essere un sostituto per il reagente per la rilevazione del superossido nel kit Enzo |
| DMEM 1x | Corning | 10-013-CV | |
| DMEM senza rosso fenolo | Gibco | 31053-028 | |
| DMF anidro | Acros Organics | 61094-1000 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | VWR | 97068-085 | |
| FITC Rat IgG2a, κ Isotipo Ctrl Anticorpo | BioLegend | 400506 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| L glutammina | Gibco | 25030-081 | |
| Cellule LADMAC | ATCC | CRL-2420 | |
| MEM | Corning | 10-010-CV | |
| Mouse IFN-g GoldBio | 1360-06-100 | ||
| N-Acetil-L-cisteina | EMD Milipore | 106425 | Può essere un sostituto dell'inibitore/scavenger dei ROS nel kit Enzo |
| Citometro a flusso per novociti con autocampionatore | Acea | 2060R | |
| Piocianina (induttore ROS) | 10009594 chimico Cayman | Può essere un sostituto per l'induttore nel kit Enzo | |
| rilevazione di ROS/superossido totali ROS-ID | ENZO | ENZ-51010 | |
| Piruvato di sodio (100mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-056 |
Riferimenti
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function. Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).
- Schieber, M., Chandel, N. S. ROS function in redox signaling and oxidative stress. Current Biology. 24 (10), R453-R462....
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Ristampe e permessi
