Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi

Sommario

Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.

Abstract

Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante degli infanti neonati. Esso è caratterizzato dalle alterazioni patofisiologiche multiple nell'epitelio intestinale umano, che porta ad aumento della permeabilità intestinale, alterato restituzione ed ha aumentato la morte delle cellule. Anche se ci sono numerosi modelli animali di NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. Inoltre, è eticamente impegnativo per studiare la fisiopatologia della malattia o nuovi agenti terapeutici direttamente nei soggetti umani, soprattutto bambini. Di conseguenza, è altamente desiderabile per sviluppare un nuovo modello di NEC utilizzando tessuto umano. Enteroids sono 3-dimensionale organoids derivato dalle cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio delle complesse interazioni fisiologiche, segnalazione delle cellule e della difesa ospite-patogeno. In questo manoscritto Descriviamo un protocollo che culture umane enteroids dopo aver isolato cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione delle viscere. Le cellule della cripta sono coltivate in media che contengono fattori di crescita che favoriscono la differenziazione nel vari nativo di tipi delle cellule dell'epitelio intestinale umano. Queste cellule sono coltivate in un mix sintetico, collageno delle proteine che fungono da un'impalcatura, che imita l'extra-cellulare della membrana dello scantinato. Di conseguenza, enteroids sviluppare apicale basolaterale polarità. La somministrazione concomitante di lipopolisaccaride (LPS) in media provoca una risposta infiammatoria nel enteroids, che portano a istologica, genetica e le alterazioni di espressione della proteina simili a quelli osservati in NEC umano. Un modello sperimentale di NEC utilizzando tessuto umano può fornire una piattaforma più accurata per droga e del trattamento di prova prima della sperimentazione umana, come ci sforziamo di identificare una cura per questa malattia.

Introduzione

Enteroids umana sono un ex vivo sistema di coltura 3-dimensionale generato da cellule staminali isolate da cripte intestinali dei campioni di tessuto intestinale umano. Questo modello innovativo è stato introdotto da Hans Clevers et nel 2007 in seguito alla scoperta di Lgr5 + cellule staminali presso le cripte di piccolo intestino in topi¹. Loro lavoro gettato le basi per l'istituzione di un ex vivo cultura epiteliale intestinale di più tipi di cellule che potrebbero essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici². Dopo questa scoperta, enteroids sono stati utilizzati come un nuovo modello per studiare la normale fisiologia digestiva e fisiopatologia delle malattie intestinali come la malattia di viscere infiammatoria, interazioni ospite-patogeno e medicina rigenerativa².

L'uso di enteroids come un ex vivo modello per lo studio della fisiopatologia intestinale ha diversi vantaggi rispetto a tecniche alternative. Per i parecchi decenni passati, modelli animali e linee cellulari derivate da cancro intestinale immortalate sono state utilizzate per studiare la fisiologia intestinale^3,4,5. Cella singola culture non rappresentano la diversità dei tipi di cellule presenti nell'epitelio intestinale normale, quindi mancano le celle cross-talk e segmento-specificità nell'espressione della proteina, segnalazione e malattia indotta da agente patogeno⁶. Cellule staminali in enteroids differenziarsi nei principali tipi di cellule epiteliali quali enterociti, cellule di Paneth, cellule caliciformi, cellule enteroendocrine e altre³. Polarità per mostre, svolgono funzioni di trasporto epiteliale e consentire per segmento intestinale specificità⁶. Poiché enteroids può ricapitolare i più tipi di cellule dell'epitelio intestinale umano, sono in grado di superare questa limitazione riconosciuta di sistemi basati su cellule di cancro. Nel corso del tempo, derivati di linee cellulari sono subcloned ed evolvono per presentano una maggiore diversità di espressione e la localizzazione della proteina³. Al contrario, enteroids possono essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici². Sebbene esistano numerosi modelli animali per NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. A causa di queste limitazioni, terapie derivate da modelli animali non riuscire il 90% del tempo quando provati nelle prove umane a causa di differenze nella tossicità o l'efficacia³. Enteroids servire come modelli pre-clinici promettenti che possono colmare queste lacune, che conduce ad una migliore comprensione della patofisiologia intestinale complesso e quindi più redditizia e di successo innovazioni terapeutiche. C'è anche la prova recente che l'età del tessuto che un enteroid viene generato da rimane biologicamente importante⁷. Questo è un dettaglio particolarmente importante per il nostro modello poiché enteroids vengono generati dal tessuto neonatale, mantenendo quindi rilevanza fisiologica ai pazienti con NEC.

L'utilità di enteroids come modelli di malattie umane continua ad espandersi, nella speranza di trovare cure per le condizioni gravi e pervasive. Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante intestinale dei neonati caratterizzata da necrosi intestinale e frequentemente conduce alla perforazione della parete delle viscere, setticemia e morte⁸. A causa di patofisiologia complessa e multifattoriale di NEC, il meccanismo esatto della malattia non è ancora stato completamente delucidato; Tuttavia, la permeabilità intestinale aumentata è stata chiaramente implicata nella malattia processo⁸. Dato che lo studio del NEC e potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, soprattutto bambini, è altamente auspicabile per utilizzare un modello di enteroid biologicamente rilevanti del NEC utilizzando tessuto umano neonatale. Finora, enteroids hanno un ruolo limitato nello studio del NEC. Questo protocollo descrive l'uso di enteroids derivati da campioni di tessuto intestinale umano come un romanzo ex vivo modello per lo studio di enterocolite necrotizzantesi.

Protocollo

L'approvazione del Consiglio di revisione istituzionale è stata ottenuta (IRB #2013-15152) per la raccolta di campioni di tessuto da pazienti sottoposti a resezione delle viscere all'ospedale Ann e Robert H. Lurie bambini di Chicago, Chicago, IL. Tutti i protocolli sono stati eseguiti in conformità alle linee guida istituzionali e nazionali e dei regolamenti per il benessere umano. Consenso informato dei genitori è stato richiesto e ottenuto prima della raccolta del campione in tutti i casi.

1. preparazione dei reagenti

1. Prepara la soluzione di riserva di terreni di coltura per intero tessuto collection: 1 L di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), 110 mL di siero bovino fetale (FBS), 11 mL di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%) e 1,1 mL di insulina filtro-sterilizzato (concentrazione finale 0.1%.) Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
2. Preparare chelante Buffer #1: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 600 µ l di 0,5 M acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (concentrazione finale di 10 mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
3. Preparare il tampone di chelante #2: 30 mL di terreni di coltura (come descritto in 1.1), 300 µ l di EDTA 0.5 M (concentrazione finale di 5mM), 300 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%) e 60 µ l di anfotericina B (concentrazione finale 0,2%). Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
4. Preparare il supporto di Minigut umana: 41,4 mL di DMEM/F-12, 5 mL di FBS (finale 10%), 500 µ l di penicillina-streptomicina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di L-Glutammina (concentrazione finale 1%), 500 µ l di gentamicina (concentrazione finale 1%), 100 µ l di amfotericina B (finale concentrazione 0,2%), 500 µ l di 1 M N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane dell'acido solfonico (HEPES) (concentrazione finale di 10 mM), 500 µ l di 100 x N-2 supplemento e 1 mL di 50 x B-27 supplemento meno vitamina A per un volume totale di 50 mL. Conservare la soluzione di riserva a-20 ° C.
5. Preparare umano Minigut Media Complete: 10 mL di umana Minigut Media (preparati a 1.4), 10 µ l di 100 µ g/mL Wnt3a (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 100 µ g/mL Noggin (concentrazione finale 100 ng/mL), 10 µ l di 1 mg/mL R-Spondin (concentrazione finale di 1 µ g/mL) , 10 µ l di 500 µ g/mL Epidermal Growth Factor (EGF) (concentrazione finale di 50 ng/mL), 10 µ l di 1 M N-acetilcisteina (concentrazione finale di 1 mM), 10 µ l di 10 mM Y-27632 (concentrazione finale di 10 µM), 10 µ l di 500 µM A-83 (concentrazione finale 500 nM), 10 µ l di 10 mM SB202190 (finale concentrazione di 10 µM), 100 µ l di 1 M nicotinammide (concentrazione finale di 10 mM) e 1 µ l di 100 µM [leu] 15-gastrin 1 (concentrazione finale di 10 nM). Volume totale 10 mL. Conservare la soluzione di riserva a 4 ° C.
   Nota: Soluzioni devono essere utilizzate entro 48h.

2. cripta isolamento e placcatura dall'intero tessuto

1. Al momento della raccolta nella suite operativa, posizionare il campione di tessuto intestinale piccolo umano in di freddo Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). Lavare il campione in DPBS freddo fino al chiaro delle feci e sangue. Conservare campione a 4 ° C in Medium RPMI 1640 fino al momento per l'isolamento di cripta.
   Nota: Tessuto non può essere memorizzato più di 24 h.
   1. Assicurarsi che il campione sia chiaro delle feci e sangue. Utilizzando le forbici per dissezione delicate, rimuovere qualsiasi eccesso grassi o chirurgici clip/graffette ecc. Pesare il campione.
      Nota: Scopo per un pezzo circa 0,75-2,5 g.
2. Il campione tagliato a pezzi di 0,5 cm e posto in 30 mL di tampone di chelanti n. 1 (come preparato al punto 1.2).
   1. Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.
   2. Filtro tessuto con colino di cella 100 µm e scartare flusso attraverso.
3. Aggiungere il tessuto a 30 mL di tampone di chelatazione #2 (come preparata al punto 1.3).
   1. Agitare a bassa velocità per 15 min a 4 ° C.
   2. Filtro tessuto attraverso un colino di cella di 100 µm e scartare flusso attraverso.
4. Scongelare i 500 mL di matrice della membrana basale su ghiaccio per uso nel punto 2.8.
5. Aggiungere tessuto a 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica da 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
   1. Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta n. 1). Tenere il tubo #1 sul ghiaccio.
   2. Aggiungere del tessuto a un'altra 10 mL di DMEM freddo in una provetta conica separato 50 mL e agitare vigorosamente per 10 s.
   3. Filtrare attraverso un colino di cella di 100 µm e raccogliere flusso attraverso (etichetta #2).
   4. Ripetere due volte fino a quando ci sono quattro provette coniche con flusso attraverso (provette di #1-4).
6. Filtro tubo #1 soluzione attraverso un 100 µm cella colino e trasferimento flusso attraverso in provetta conica da 15 mL (etichetta n. 1). Ripetere per #2-4.
   1. Centrifugare le provette da 15 mL #1-4 a 200 x g per 15 min a 4 ° C.
7. Nella cappa a flusso laminare, rimuovere il supernatante da tubi #1-4 e scartare. Evitare di perturbare la nube del tessuto immediatamente di sopra del pellet, anche se questo significa lasciando alcuni surnatante.
   1. Pipettando lentamente, mescolate insieme il pellet con le rimanenze surnatante in tubi #1-4.
   2. Trasferire il composto da tubi #1-4 in una provetta conica da mL 2 singole.
   3. Centrifugare la provetta conica a 200 x g per 20 min a 4 ° C.
8. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di matrice della membrana basale.
   Nota: tenere la matrice della membrana basale su ghiaccio in ogni momento e lavorare velocemente per i passaggi successivi. Questo prodotto si polimerizza molto rapidamente a temperatura ambiente.
   1. Applicare 50 µ l di campione/seminterrato membrana matrice sospensione al centro di un pozzo in una piastra a 24 pozzetti. Questo dovrebbe apparire a forma di cupola.
      Nota: Uso di puntali refrigerati per aiuti in più agevole trasferimento della sospensione, riducendo al minimo polimerizzazione.
   2. Ripetere 9 volte per riempire 10 pozzi totale.
9. Posizionare la piastra a 24 pozzetti a 37 ° C, 5% CO₂ incubatrice per 30 min consentire di polimerizzazione.
10. Aggiungere 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto. Sostituire ogni 2 giorni.
11. Raccogliere enteroids dopo 5-10 giorni, quando è visualizzato in erba. Vedere i passaggi 4 e 5 per istruzioni per la raccolta.

3. induzione di NEC sperimentale

1. Aggiungere 10 µ l di 5 mg/mL di lipopolisaccaride (LPS) a 500 µ l di umana Minigut Media completa (come preparato al punto 1.5) in ciascun pozzetto il giorno 0. Sostituire ogni 2 giorni fino alla raccolta.

4. preparazione per inclusione in paraffina

1. Rimuovere delicatamente il supporto.
   1. Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale con cura non per lisare il enteroids.
   2. Centrifugare la miscela di PBS/enteroid a < x 300 g per 5 min per pellet e rimuovere PBS.
2. Aggiungere 4% paraformaldeide per fissare a temperatura ambiente per 1 h.
3. Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.
   1. Lavare delicatamente con 1 mL di PBS e centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet e quindi rimuovere PBS.
   2. Ripetere il punto 4.3.1.
4. Sciogliere un volume sufficiente del tessuto lavorazione gel (circa 300 µ l) posizionando la quantità desiderata in una provetta conica e riscaldandola in un'incubatrice di bagno secco a 65 ° C per 3-10 min fino a liquido.
   1. Aggiungere il gel al pellet di lavorazione del tessuto e mescolare delicatamente.
   2. Su un vetrino coprioggetti, posizionare un piccolo anello di clonazione.
   3. Dispensare il tessuto di miscela di gel ed enteroid di elaborazione in un anello di clonazione montato su un vetrino coprioggetti.
5. Consentire il miscela di gel ed enteroid a solidificare a 4 ° C per 1 h di lavorazione del tessuto.
   1. Immergere l'anello di clonazione con miscela solidificata in etanolo al 70% in preparazione per inclusione in paraffina.

5. Enteroid collezione per estrazione di proteine e RNA

1. Rimuovere delicatamente umana Minigut Media completa da ogni pozzetto.
2. Aggiungere 1 mL di PBS e pipettare delicatamente su e giù per dissolvere la matrice della membrana basale. Fare attenzione a non dissociare la enteroids.
   1. Mettere PBS/enteroid composto in una provetta conica sterile mL 2.
   2. Centrifugare a < x 300 g per 5 min a pellet.
   3. Rimuovere delicatamente il PBS, facendo attenzione a non per rimuovere il enteroids.
3. Ripetere i passaggio serie 5.2 altre due volte.
4. Congelare a-80 ° C fino al momento per proteine e/o estrazione del RNA.
5. Eseguire l'isolamento di espressione e proteina di gene di enteroids utilizzando ben consolidata qRT-PCR e tecniche di Western Blotting.

Risultati

Immediatamente dopo il placcaggio, cripte intestinali appena isolate vengono visualizzati come barre di forma allungate. Poche ore, il enteroid avrà un aspetto rotondo (Figura 1a). Nei prossimi giorni, il enteroids inizierà a formare sfere come visto in Figura 1b. In erba dovrebbe verificarsi tra 5-10 giorni (Figura 1c) ed enteroid collezione dovrebb...

Discussione

Questo romanzo ex vivo enteroid intestinale umano modello serve come un metodo utile per lo studio della disfunzione della barriera intestinale in enterocolite necrotizzante (NEC). I metodi di elaborazione di enteroid qui presentati sono stati adattati dal precedente lavoro della d. ssa Misty Good, Michael Helmrath e Jason Wertheim^10,11,12.

Dettagli che circondano l'intera collezione dei tessuti e la ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
4% Paraformaldeide	ThermoFisher	AAJ19943K2
A-83	R& D Tocris	2939/10
Amfotericina B	ThermoFisher	15290026
integratore di B-27 meno vitamina A	ThermoFisher	17504-044
Matrice della membrana basale (Matrigel)	Corning	CB-40230C
DMEM/F-12	ThermoFisher	MT-16-405-CV
Dulbecco' s Aquila modificata media (DMEM)	ThermoFisher	11-965-118
Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)	ThermoFisher	14190-144
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Sigma	E9644-.2MG
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma	EDS-500G
Siero fetale bovino (FBS)	Gemini Bio-Pro	100-125
Gentamicina	Sigma	G5013-1G
GlutaMAX ( L-glutammina)	ThermoFisher	35050-061
Insulina	Sigma	I9278-5mL
[leu] 15-gastrina 1	Sigma	G9145-.1MG
Lipopolisaccaride (LPS)	Sigma	L2630-25MG
N-2 integratore	ThermoFisher	17502-048
N-2-idrossietilpiperazina-N-2-etano acido solfonico (HEPES)	ThermoFisher	15630-080
N-acetilcisteina	Sigma	A9165-5G
Nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Noggin	R& D Systems INC	6057-NG/CF
Penicillina-Streptomicina	ThermoFisher	15140-148
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	P5368-5X10PAK
RPMI 1640 Medium	Invitrogen	11875093
R-spondin	PEPROTECH INC	120-38
SB202190	Sigma	S7067-5MG
gel per la lavorazione dei tessuti (Histogel)	ThermoFisher	22-110-678
Wnt3a	R& D Systems INC	5036-WN-010
Y-27632	Sigma	Y0503-1MG