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Articolo metodologico

Intramucosa inoculazione delle cellule di Carcinoma di cellule Squamous nei topi per profilatura Immune tumore e valutazione della risposta di trattamento

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DOI:

10.3791/59195

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22 aprile 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Radiation Oncology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 2Department of Anesthesiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus, 3Division of Radiology, University of Colorado Denver - Anschutz Medical Campus

In questo articolo

Sommario

Qui presentiamo un metodo riproducibile per lo sviluppo di un modello murino ortotopico di carcinoma di cellule squamous testa e del collo. I tumori dimostrano clinicamente rilevanti caratteristiche istopatologiche della malattia, compreso necrosi, differenziazione difficile, le metastasi nodali e infiltrazione immune. Topi del tumore-cuscinetto sviluppano sintomi clinicamente rilevanti tra cui disfagia, spostamento mascella e la perdita di peso.

Abstract

Carcinoma di cellule squamous di testa e del collo (HNSCC) è una malattia debilitante e mortale con un'alta prevalenza di ricorrenza e di guasto di trattamento. Per sviluppare meglio le strategie terapeutiche, fattori microambientali del tumore di comprensione che contribuiscono alla resistenza del trattamento è importante. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee murine che ricordano la natura aggressiva e metastatica della HNSCCs umana. Inoltre, una maggioranza di modelli murini impiegano impianti sottocutanei di tumori che mancano importanti caratteristiche fisiologiche della regione testa e collo, compreso alta densità vascolare, vasto sistema vascolare linfatico e flora residente della mucosa. Lo scopo di questo studio è di sviluppare e caratterizzare un modello ortotopico di HNSCC. Ci avvaliamo di due linee cellulari murine geneticamente distinte e tumori stabiliti nel mucosa orale dei topi. Ottimizziamo i metodi di digestione tumore collagenosi-basato per il recupero ottimo delle singole cellule dai tumori stabiliti. I dati presentati qui indicano che i topi sviluppano tumori altamente vascularized che riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Massa di citometria multiparametrica unicellulare dimostra la presenza di diverse popolazioni immunitarie con cellule mieloidi che rappresentano la maggioranza di tutte le cellule immunitarie. Il modello proposto in questo studio ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e sviluppo preclinico di approcci terapeutici. La somiglianza del modello ortotopico alle caratteristiche cliniche della malattia umana fornirà uno strumento per la traduzione avanzata e migliorare i risultati pazienti.

Introduzione

HNSCC è la malignità quinto più comune a livello mondiale, con oltre 600.000 pazienti diagnosticati ogni anno1. Malgrado il trattamento aggressivo che coinvolgono la chemioterapia e la radioterapia (RT), la sopravvivenza globale (OS) per i pazienti HNSCC senza infezione umana di papillomavirus (HPV) rimane inferiore al 50% dopo 5 anni2. Questo è in gran parte attribuito a un microambiente tumorale altamente complesse come i tumori possono provenire da diverse sedi anatomiche distinte all'interno della regione testa e del collo, tra cui la mucosa orale, lingua, pavimento della bocca, cavità nasale, cavità orale, faringe, orofaringe e ipofaringe. Inoltre, la regione del collo e della testa è altamente vascolarizzata e contiene quasi la metà di tutti i linfonodi nel corpo3. Maggior parte degli studi che studiano la biologia dei tumori testa e collo si basano su modelli di tumore della regione di fianco. Tali modelli in grado di offrire comprensione nei meccanismi intrinseci del tumore, ma la mancanza del microenvironment del nativo di testa e del collo possa influenzare notevolmente il potenziale traslazionale di tali risultati. Un metodo che è stato utilizzato per indurre tumori orali è attraverso l'esposizione all'agente cancerogeno 9,10-dimetil-1,2-benzanthracene (DMBA)4. Tuttavia, questo metodo è associato con un processo lungo, induce i tumori in ratti e criceti, ma non nei topi, e i tumori risultanti non possiedono molte delle caratteristiche istologiche di differenziata SCCs5,6. L'introduzione del carcinogen4-nitroquinoline 1-ossido (4-NQO), un derivato chinolonico solubile in acqua, ha provocato tumori orali del mouse quando applicato per via orale, ma anche sofferto di lunghi tempi di esposizione (16 settimane) e un numero limitato di prendere tasso all'interno e tra i lotti di topi7,8,9. Al fine di sviluppare modelli clinicamente rilevanti, diversi gruppi utilizzati modelli geneticamente ingegnerizzati che coinvolgono la manipolazione dei driver oncogeni o geni soppressori del tumore, tra cui TP53, TGFB, KRAS, HRA e SMAD410. Questi modelli possono offrire comprensione nei tumori con geni noti driver ma non ricapitolare la complessa eterogeneità di HNSCCs umano.

In questo lavoro, dimostriamo la possibilità di effettuazione di un'inoculazione intramucosal delle cellule di carcinoma di cellule squamous nei topi. Cellule inoculate sviluppano in tumori aggressivi entro 1 settimana dall'iniezione. Simile a HNSCCs umana, i tumori riprodurrsi per metastasi ai linfonodi regionali. Ci caratterizzano le caratteristiche istologiche e cliniche della malattia e consentono di comprendere il microambiente tumorale immuni. Proponiamo che questo modello ortotopico di HNSCC ha applicazioni nella biologia del cancro, immunologia dei tumori e studi preclinici. Meccanismi di evasione immune, progressione del tumore, resistenza al trattamento e le metastasi rappresentano aree di rilevanza clinica che possono essere affrontate utilizzando il modello proposto.

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Protocollo

Animale tutte le procedure sono state eseguite in conformità con un approvato istituzionale animale cura e uso Comitato (IACUC) protocollo della University of Colorado Denver (protocollo n. 00250).

1. tumore coltura cellulare

Nota: B4B8 e LY2 linee cellulari sono state utilizzate per generare tumori HNSCC ortotopico: B4B8 cellule del tumore sono stata derivate da cheratinociti della mucosa cancerogeno-trasformate (da topi BALB/C)11. LY2 cellule del tumore sono state derivate dalle metastasi di linfonodo di un12,di linea (Pam 212) del keratinocyte spontaneamente trasformata BALB/C13. Entrambe le linee cellulari sono state gentilmente concesse da Dr. Nadarajah Vigneswaran (UTHealth, Houston, TX, USA).

  1. Uso Dulbecco per volta medium (DMEM) F/12 di Eagle completato con 10% siero bovino fetale (FBS) e 1% reagente antimicrobica per la manutenzione di linea cellulare. Mantenere queste linee cellulari in una sterile incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Le cellule devono essere utilizzate per l'inoculazione prima superiore a 15 passaggi.
  2. Piastra di 2 x 106 a 4 x 106 cellule in matracci di cultura cellulare2 175 cm.
    Nota: Garantire le cellule sono meno di 90% confluenti per evitare di indurre una risposta allo stress.
  3. Quando le cellule sono 70% confluenti (~ 48 h), togliere il matraccio dall'incubatrice e lavare le cellule 3 x con freddo tampone fosfato salino (PBS).
  4. Staccare le cellule dal pallone utilizzando 0,25% tripsina, abbastanza per coprire la superficie della piastra.
    1. Per effettuare questa operazione, dispensare 4 mL di tripsina in un pallone da2 175 cm contenente il 70% di cellule confluenti. Incubare le cellule con tripsina per 3 – 4 minuti nell'incubatrice di coltura cellulare a 37 ° C e 5% CO2.
    2. Visualizzare le cellule al microscopio per garantire il distacco delle cellule.
    3. Aggiungere 12 mL di DMEM F/12 supporti contenenti FBS per neutralizzare l'attività della tripsina.
  5. Aspirare la sospensione cellulare e metterlo in una provetta conica da 50 mL.
  6. Agitare la provetta contenente le cellule capovolgendo la x-4 3 x.
  7. Facoltativamente, mescolare un'aliquota di 10 µ l di sospensione cellulare con 10 µ l di tripan blu in una provetta da microcentrifuga e contare le celle utilizzando un emocitometro. Determinare la vitalità cellulare sottraendo il numero di celle di Trypan-blu-positivo dal numero totale delle cellule e dividere per il numero totale di cellule.
  8. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 min a 4 ° C.
  9. Risospendere le cellule in DMEM privo di siero e senza antibiotico ad un volume adatto affinché 1 x 106 cellule sono presenti in 50 µ l di media.
    Nota: Basato sull'aggressività di linea cellulare in vivo (determinato empiricamente), 1 x 106 cellule per sito di inoculo per topo è stato ritenuto appropriato per le cellule B4B8 e LY2.
  10. Collocare il flaconcino contenente la sospensione cellulare su ghiaccio.
  11. Inserire la matrice della membrana basale pre-scongelati sul ghiaccio.
    Nota: La matrice della membrana basale è stata scongelata durante la notte a 4 ° C.

2. cellula iniezione nei topi

  1. Preparare una miscela 1:1 della matrice della membrana di cellule: seminterrato (50 µ l).
  2. Aggiungere le celle prima; poi, gradualmente dispensare la matrice della membrana basale. Evitare di introdurre bolle d'aria. Assicurare che la miscela è fatta immediatamente prima dell'iniezione degli animali. Aggiunta di cellule alla matrice della membrana basale per un periodo prolungato di tempo può comportare nella cella ambientando la miscela di matrice, che rende la miscela difficile da scuotere rigorosamente. Ciò causerà una considerevole variabilità nel formato di tumore fra i topi.
  3. Mescolare delicatamente. Garantire tutti i passaggi che coinvolgono matrice vengono eseguiti sul ghiaccio. Matrice della membrana basale polimerizzerà a temperatura ambiente.
  4. Preparare siringhe per inoculazione.
  5. Caricare siringhe da insulina 0,5 mL (23 G) con 100 µ l della soluzione di matrice di membrana cellulare/seminterrato.
  6. Tenere le siringhe sul ghiaccio per evitare una polimerizzazione di matrice della membrana dello scantinato.
  7. Anestetizzare topi inserendoli in una camera con isoflurano e ossigeno (2,5%).
  8. Assicurarsi che i topi sono anestetizzati prima di eseguire l'iniezione (assicurando una mancanza di risposta a un pizzico di punta).
  9. Inserire l'ago nella regione buccale destra o sinistra. Questo avviene attraverso lo spazio aperto disponibile su entrambi i lati della bocca.
  10. Accertarsi che la linguetta del mouse non è nel modo.
    Nota: È facile a ficcare la lingua, che si tradurrà in tumori di lingua. Se necessario, spostare la linguetta sul lato opposto.
  11. Tenere la siringa parallelo alla regione buccale mentre all'interno della cavità orale.
  12. Quando si è pronti a iniettare, tirare indietro la siringa e inserire lentamente la siringa con un'angolazione di 10°.
  13. Iniettare 100 µ l della sospensione di matrice di membrana cellulare/seminterrato per un periodo di 5 s.
  14. Tenere la siringa in posizione per un ulteriore 5 s affinché tutto il materiale viene iniettato.
    Nota: Per topi di controllo nontumor-cuscinetto, iniettare una miscela dei media privo di siero e matrice (come descritto sopra) senza le cellule del tumore.
  15. Estrarre delicatamente la siringa.
  16. Continuare la procedura di cui sopra con i topi restanti.
  17. Consentire per 1 settimana fino a quando i tumori cominciano ad apparire grossolanamente (50 – 200 mm3 per le cellule B4B8 e LY2).

3. Mouse monitoraggio

  1. Eseguire la prima misurazione utilizzando pinze a 1 settimana dopo l'iniezione di cellule del tumore. Al fine di calcolare il volume del tumore usando pinze esterne, determinare il più grande diametro longitudinale (lunghezza) e il più grande diametro trasversa (larghezza) e utilizzare le modificate in formula ellissoidali14,15.
    figure-protocol-1
  2. Continuare a eseguire misurazioni regolari pinza per volume del tumore (x-2 1x a settimana a intervalli regolari).
  3. Misurare il peso dell'animale per valutare gli effetti della crescita del tumore sull'alimentazione.

4. tumori di raccolta

  1. Quando viene raggiunto l'endpoint sperimentale, eutanasia degli animali mediante misure adeguate (ad es., CO2 asfissia, decapitazione o dislocazione cervicale).
    Nota: In questo studio, l'endpoint è stato raggiunto se i topi divennero moribondi (con una perdita di peso > 15% del loro peso iniziale, una mancanza di governare, cachessia) e/o se le dimensioni del tumore ha raggiunto 1.000 mm3.
  2. Iniziare la dissezione animale creando una lunga incisione attraverso la linea mediana nella regione del collo.
    1. Utilizzare forcipe smussato per afferrare la pelle e forbici per tagliare la pelle affilate.
  3. Inserire le forbici delicatamente sotto la pelle che copre il tumore e creare sacche d'aria spingendo le forbici attraverso e nella pelle.
  4. Una volta che la pelle è sufficientemente distaccata dal tumore, identificare il linfonodo drenante (DLNs) ed asportare loro per evitare che il tessuto del tumore confuso dalla presenza di linfonodi.
    Nota: Tumori di grandi dimensioni possono raggiungere e/o coprire il DLN. A seconda del tipo di analisi viene eseguita, l'isolamento dei linfonodi intatti è essenziale per evitare gli schizzi delle cellule immunitarie nel tumore, che si tradurrà in distorsione dei risultati di analisi.
  5. Tagliare i bordi del tumore fino a quando si stacca l'intero volume.

5. tumore elaborazione per applicazioni a valle

  1. Per l'esame istologico a valle, è possibile posizionare i tumori in formalina al 10% a temperatura ambiente. Per evitare overfixation, sostituire la formalina con etanolo al 70%. Per l'analisi di citometria a flusso, è necessario elaborare i tumori come descritto di seguito.
    Nota: Il tessuto può essere mantenuto in formalina per 72 h prima overfixation può diventare problematico per alcuni tipi di colorazione.
  2. Tagliare il tumore in 1-2 mm-dimensioni pezzi usando una lama di rasoio sterile o forbici affilate.
  3. Mettere i pezzi di taglio del tumore in una provetta conica da 50 mL con collagenasi III (4.250 unità per esempio), dnasi I (0,1 mg / campione) e inibitore della tripsina (1 mg per campione).
  4. Incubare a 37 ° C per 30 min con agitazione ogni 10 min.
    Nota: I campioni possono essere inseriti in un sacchetto richiudibile, sterilizzati con 90% di etanolo e collocato in un'incubatrice di coltura cellulare.
  5. Dopo 30 min, aggiungere 20 mL di Hank equilibrata soluzione salina (HBSS) e spin a 300 x g per 5 min.
    Nota: HBSS è composto di cloruro di potassio, cloruro di sodio, bicarbonato di sodio, sodio fosfato bibasico, sodio fosfato monobasico e glucosio.
  6. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 2 – 3 mL di tampone di lisi di globuli rossi (RBC). Pipettare rigorosamente.
    Nota: Buffer di lisi RBC è composto di cloruro di ammonio, bicarbonato di sodio e disodico.
  7. Incubare per 2 min a temperatura ambiente.
    Nota: Incubazione più lungo può essere tossico per altre popolazioni cellulari.
  8. Aggiungere 20 mL di HBSS per neutralizzare l'effetto di tampone di lisi.
  9. Centrifugare a 300 x g per 5 min e scartare il surnatante.
  10. Risospendere il pellet in 10 mL di HBSS.
  11. Filtrare la soluzione attraverso un restrainer di nylon 70 µm e centrifugare a 300 x g per 5 min, scartare il surnatante.
  12. Ripetere i passaggi da 5,8 – 5,10 e passare la sospensione cellulare attraverso un dispositivo di ritenuta nylon 40 µm per garantire che eventuali detriti aggiuntivo viene rimosso dalla sospensione.

6. cella macchiatura e acquisizione dati

  1. Risospendere il pellet cellulare in 1 mL di HBSS.
  2. Contare le celle utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule automatizzato, come descritto al punto 1.7
  3. Determinare il numero totale delle cellule e la concentrazione appropriata per la colorazione.
    Nota:     la concentrazione cellulare ideale per la colorazione di citometria a flusso è 1 milione di cellule. Ad esempio, se la colorazione viene eseguita in una piastra a 96 pozzetti e ci sono 10 milioni di cellule, risospendere il campione in 1 mL e piastra 100 µ l per 1 milione cellule per pozzetto.
  4. Aggiungere blocco Fc (CD16/CD32) ad una concentrazione di 1: 100 per impedire il legame di nonantigen specifico delle immunoglobuline ai recettori FcγIII e FcγII. Incubare per 5 min a temperatura ambiente.
    1. Centrifugare e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di tampone di colorazione cellulare di citometria a flusso (composto contenente 5% FBS, EDTA 2% e 1% di soluzione salina HEPES).
  5. Eseguire la superficie cellulare colorazione secondo le istruzioni fornite dal fornitore (aggiungendo ogni anticorpo la diluizione appropriata). Incubare per 60 min a temperatura ambiente.
    1. Centrifugare e risospendere il pellet cellulare in 100 µ l di HBSS. Ripetere 2x per sbarazzarsi dell'anticorpo in eccesso.
  6. Eseguire gli esempi su un citometro a flusso appropriato.
    1. Se l'analisi di marcatori intracellulari (ad es., foxp3), eseguire permeabilizzazione delle cellule e la macchiatura secondo le istruzioni del fornitore.

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Risultati

La valutazione in vitro di proliferazione delle cellule LY2 e B4B8 hanno dimostrato che entrambe le linee cellulari hanno simili tempi di raddoppiamento (21 e 23 h, rispettivamente). In vivo, entrambe le linee cellulari formano una massa unica, visibile e palpabile entro 1 settimana dall'inoculazione (Figura 1A). In topi che sopportano i tumori LY2, la mascella è stata spostata da 3 settimane a causa del carico del tumore (Figura 1A

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Discussione

Rigorosa analisi e caratterizzazione del microambiente tumorale rappresentano una strategia importante per comprendere i meccanismi di sviluppo del tumore, la progressione e la metastasi e per lo sviluppo di terapie efficaci. Cancro del collo e della testa è una malattia complessa che può avere origine da sedi anatomiche multiple all'interno della regione del collo e della testa. Dei principali ostacoli alla comprensione dei meccanismi di malattia e migliorare la terapia è stata una mancanza di linee cellulari murine del...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Collagenasi IIIWorthington Biochemical Corp.
DNasi IWorthington Biochemical Corp.
Blocco Fc (CD16/32)BD Biosciences553141  Clone 2.4G2 
tampone di colorazione per citometria a flussoeBioscience00-4222-26
HBSSThermoFisher Scientific14175079senza calcio, senza magnesio, senza fenorosso
Citometro di massa HeloisFluidigmNA
Matrigel matrice di membranaCorning CB-40234B
Scanner MRIBrukerNA7.4 Tesla
Tampone di lisi RBCBioLegend420301
Inibitore della tripsinaWorthington Biochemical Corp.
LS004183LS006328LS002830

Riferimenti

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