Articolo metodologico

Medio-throughput Screening Test per la valutazione degli effetti sulla Ca2 +-segnalazione e reazione acrosomiale in sperma umano

DOI:

10.3791/59212

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1 marzo 2019

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1Department of Growth and Reproduction, Copenhagen University Hospital, 2International Center for Research and Research Training in Endocrine Disruption of Male Reproduction and Child Health (EDMaRC), University of Copenhagen

In questo articolo

Sommario

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Qui, due saggi di medio-velocità effettiva per la valutazione degli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sono descritti. Queste analisi possono essere utilizzate per rapidamente e facilmente a schermo grandi quantità di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano.

Abstract

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CA2 +-segnalazione è essenziale per la funzione normale delle cellule dello sperma e la fertilità maschile. Allo stesso modo, la reazione acrosomiale è vitale per la capacità di una cellula di sperma umana di penetrare la zona pellucida e fecondare l'uovo. È quindi di grande interesse per testare composti (per esempio, sostanze chimiche ambientali o candidati farmaci) per il loro effetto su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano sia per esaminare i potenziali effetti negativi sulla funzione delle cellule dello sperma umano o per indagare su un possibile ruolo come contraccettivo. Qui sono descritti due saggi di media-velocità di trasmissione: 1) un'analisi di fluorescenza-basata per la valutazione degli effetti su Ca2 +-segnalazione in sperma umano e 2) un'analisi cytometric di immagine per la valutazione della reazione acrosomiale in sperma umano. Queste analisi possono essere utilizzate per lo screening di un gran numero di composti per effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano. Inoltre, l'analisi possono essere utilizzate per generare le curve dose-risposta altamente specifici dei singoli composti, determinare il potenziale additività/sinergismo per due o più composti e per studiare il modo farmacologico di azione attraverso l'inibizione competitiva esperimenti con gli inibitori CatSper.

Introduzione

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Lo scopo dei due saggi qui descritto è quello di esaminare gli effetti su Ca2 +-reazione acrosomiale e di segnalazione in sperma umano, come è stato dimostrato per molteplici composti in diverse pubblicazioni che impiegano questi dosaggi1,2, 3,4,5,6,7. CA2 +-segnalazione e la reazione acrosomiale sono entrambi funzione vitale al normale umano delle cellule dello sperma e fertilità maschile.

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Protocollo

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La raccolta e l'analisi di campioni di liquido seminale umano nei protocolli segue le linee guida del comitato etico di ricerca della regione di Hovedstaden. Tutti i campioni di seme sono stati ottenuti dopo consenso informato da donatori volontari. Dopo la consegna, i campioni sono stati completamente anonimi. Per loro disagi ogni donatore ha ricevuto un compenso di 500 DKK (circa $75 dollari USA) per campione. I campioni sono stati analizzati il giorno della consegna e poi distrutti immediatamente dopo gli esperimenti di laboratorio.

Nota: La velocità effettiva media Ca2 +-segnalazione test è descritto in passaggi 4-5 e l'anali....

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Risultati

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Rappresentante risultati da un esperimento per verificare l'effetto di 4 composti (A, B, C e D) unitamente ad una positiva (progesterone) e un controllo negativo (buffer) sulla [Ca2 +]i in sperma umano utilizzando la velocità media effettiva Ca2 +-segnalazione dosaggio può essere visto in Figura 4a. In Figura 4b, viene visualizzata una curva dose-risposta di progesterone, che è stato derivato da p.......

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Discussione

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La velocità effettiva media Ca2 + segnalazione di analisi è basata sulla misura della fluorescenza da singoli pozzetti ogni contenente circa 250.000 cellule dello sperma. Il segnale acquisito è in media da tutte le singole celle di sperma nel pozzo. Il dosaggio fornisce così che non spaziali informazioni su dove in particolare la cellula dello sperma [Ca2 +]i sono modificati, in quanto grande una proporzione delle cellule dello sperma avviene un cambiamento in [Ca2 +]i

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori si desidera ringraziare il laboratorio di Timo Strünker per supervisione di AR e DLE durante i loro soggiorni presso il suo laboratorio. Inoltre, vorremmo ringraziare i nostri colleghi presso il dipartimento di crescita e la riproduzione, ospedale universitario di Copenhagen, Rigshospitalet per la loro assistenza con l'impostazione di questi due test. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da parte del fondo per l'innovazione Danimarca (numeri di grant 2010-005-3 e 14-2013-4).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,2 µ ThermoFisher Scientific, USA296-4545
Cilindro graduato da 1 LThermo Fisher Scientific, USA3662-1000
Provette in plastica da 1, 4 e 2 mLEppendorf, Germania30120086 e 0030120094
Pipetta a 12 canaliEppendorf, Germania4861000813
384 piastre multipozzettoGreiner Bio-One, Germania781096
Provette in plastica da 15 e 50 mLEppendorf, Germania0030122151 e 30122178
vetrini A2ChemoMetec, Danimarca942-0001
Pipetta a ripetizione automaticaEppendorf, Germania4987000010
CaCl2
Centrifuga
Clean, a bocca larga contenitore in plastica per campione di
Dimetil solfossido (DMSO)
Lectina accoppiata a FITC di Pisum sativum (FITC-PSA)Sigma-Aldrich, GermaniaL0770
Fluo-4 AMThermo Fisher Scientific, USAF14201
FLUOstar OMEGA lettore di micropiastre a fluorescenzaBMG Labtech, Germania
Glucosio anidro
HEPES
Hoechst-33342ChemoMetec, Danimarca910-3015
Albumina sierica umana (HSA)Irvine Scientific9988In aggiunta a HTF+
Soluzione immobilizzante contenente 0,6 M NaHCO3 e 0,37% (v/v) di formaldeide in acqua
distillataIncubatore
KCl
KH2PO4
Agitatore
MgSO4
Na-Lattato
NaCl
NaHCO3
NC-3000 citometro a immaginiChemoMetec, Danimarca970-3003
Pipette e puntali
ioduro di propidio (PI)ChemoMetec, Danimarca910-3002
Acqua
Rack per il posizionamento di provette di plastica da 50 mL con un angolo
Tampone S100ChemoMetec, Danimarca910-0101
SP1-cassettaChemoMetec, Danimarca941-0006
Palloni volumetrici di dimensioni
Vortexer
spermamagneticoper tubazionipurificata di 45 gradiappropriate

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schiffer, C., et al. Direct action of endocrine disrupting chemicals on human sperm. EMBO reports. , (2014).
  2. Rehfeld, A., Dissing, S., Skakkebæk, N. E. Chemical UV Filters Mimic the Effect of Progesterone on Ca(2+) Signaling in Human Sperm Cells. Endocrin....

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Tag

Saggio di segnalazione del calcioSaggio di reazione acrosomialeSaggio basato sulla fluorescenzaSaggio di citometria per immaginiCurve dose rispostaInibizione competitivaInibitori di CatSperFunzione delle cellule spermatiche

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