Articolo metodologico

Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica

DOI:

10.3791/59213

⸱

1 aprile 2019

 , 
1Graduate Interdisciplinary Program in Entomology and Insect Science, University of Arizona, 2Department of Entomology, University of Arizona

In questo articolo

Sommario

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Vi presentiamo una semplice tecnica citogenetica usando 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per determinare il tasso di fertilizzazione e rapporto primario del sesso del parassita invasivo haplodiploid Bemisia tabaci.

Abstract

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Poche specie di aleurodidi sap-succhiare sono alcuni dei più dannosi parassiti terrestri in tutto il mondo a causa i danni alle colture che infliggono e virus vegetali che hanno vector. Nonostante i numerosi studi della biologia di queste specie in ambienti diversi, un parametro chiave vita storia, prole rapporti del sesso, ha ricevuto poca attenzione, è ancora importante per prevedere la dinamica di popolazione. Il rapporto primario del sesso (rapporto del sesso alla deposizione delle uova) di Bemisia tabaci non è stato segnalato mai, ma può essere trovato determinando il tasso di fertilizzazione dell'uovo di questo insetto haplodiploid. La tecnica prevede il dechorionation di uova con candeggina, una serie di passaggi di fissazione e l'applicazione della generale macchia fluorescente DNA, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, una tintura fluorescente DNA-binding), da associare alla pronuclei maschili e femminili. Qui, presentiamo la tecnica e un esempio della sua applicazione, per verificare se un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenzato il rapporto primario del sesso di b. tabaci. Questo metodo può aiutare negli studi di popolazione di aleurodidi, o determinare se allocazione sesso esiste con determinati stimoli ambientali.

Introduzione

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Lo studio dell'allocazione di sesso, o il relativo investimento nella prole maschio e femmina, è una pietra angolare di ecologia comportamentale1,2,3. Oltre alla sua potenza per test adattivi modelli di comportamento, sapendo che la strategia di allocazione del sesso di un organismo può migliorare modelli delle sue dinamiche di popolazione. In molte specie, allocazione di sesso è controllata dalle madri. Per determinare l'allocazione di sesso, è importante determinare il rapporto primario del sesso o la percentuale di femmine al momento della deposizione dell'uovo. Anche se il rapporto del sesso adulto emersione può fornire indicazioni di attribuzione di sesso, mortalità differenziale dello sviluppo tra i giovani maschi e femminili comunemente comunque alterare il rapporto del sesso adulto sostanzialmente. In alcune specie di imenotteri, l'ordine di insetti che contiene le formiche, API e vespe, il rapporto primario del sesso è stato determinato con analisi citogenetiche, gli embrioni per visualizzare DNA genetico di colorazione. Perché imenotteri sono haplodiploid, un incipiente uovo maschio è aploide e contiene solo il pronucleo femmina (n), mentre incipiente uova femminile sono diploidi e contengono pronuclei maschili e femminili (2n). Anche se Aleyrodidae, la famiglia di insetti Rincoti (Hemiptera) conosciuto come whiteflies, sap-alimentazione sono anche haplodiploid, non c'è un'analisi consolidata per trovare il rapporto primario del sesso in questi insetti. Questo è forse sorprendente dato l'intensità di studio dei pochi parassiti gravi cosmopoliti in questa famiglia e l'importanza dei rapporti del sesso in interazioni concorrenziali di aleurodidi4,5,6,7 ,8,9,10 e in dinamica di popolazione in genere. In haplodiploid insetti troppo, rapporti del sesso non sono vincolati dai sistemi di determinazione del sesso, consentendo la possibilità di fecondazione selettiva e labili rapporti del sesso che variano con l' ambiente2. Qui presentiamo una tecnica per determinare il rapporto primario del sesso del complesso specie di aleurodidi conosciuti collettivamente come il sweetpotato whitefly, b. tabaci. Questo nome di una specie comprende più di 28 specie in tutto il mondo11e comprende alcuni dei più dannosi parassiti invasivi globale12,13. L'applicazione di questa tecnica per determinare gli schemi di allocazione di sesso in b. tabaci e altri Aleyrodidae permetterà una più rigorosa indagine di variabili, tra cui temperatura, pianta ospite, endosymbiotic batteri o pianta/whitefly agenti patogeni, che possono influenzare whitefly primaria rapporti del sesso e dinamica di popolazione di mosche bianche.

Siamo ignari di qualsiasi tecnica di uovo-macchiatura paragonabile per b. tabaci. Il protocollo è conveniente rispetto ai metodi di colorazione utilizzate per altre uova dell'insetto14 come viene omesso un passaggio di fissazione durante la notte e, di conseguenza, può essere completato in 3 h. Come un esempio di un'applicazione, un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, è associato con bias femminile nelle nostre linee di laboratorio di b. tabaci Medio Oriente-Asia minore 1 (MEAM1)15,16. In una sola riga di laboratorio b. tabaci MEAM1 ("MAC1," raccolto dalla Maricopa Agricultural Center), verifichiamo se Rickettsia-infetti (R+) femmine fertilizzano più uova rispetto alle femmine (R.–) non infette.

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Protocollo

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Nota: Garantire che tutto il lavoro è eseguito a temperatura ambiente in una zona ben ventilata o sotto una cappa aspirante. Tutte le 'gocce' in questo protocollo sono definiti come 5 – 20 µ l, a seconda delle preferenze dell'operatore.

1. il primo programma di installazione

  1. Consentire whiteflies femminile a oviposit su foglie di pulito. Sono esempi per arene di deposizione delle uova gabbie clip o foglie tagliate per adattarsi su agar in una capsula di Petri. Fare un buco copribile nella gabbia di clip o copertura di Petri da inserire e rimuovere gli adulti. In alternativa, rapidamente mettere un vaso di adulti raccolti sul ghiaccio e, quindi, li depositi sulla foglia. Limitare il tempo tra la deposizione delle uova e la fissazione di uovo a non più di 60 min, per garantire l'osservazione della transizione dello sperma nel pronucleo paterno nelle uova.
    Nota: Uova non rimosse dalla foglia possono essere allevate fino all'età adulta per registrare i rapporti del sesso adulti.
  2. Prima o durante la deposizione delle uova di mosche bianche, preparare un vetrino da microscopio di pulirlo con acqua e sapone, asciugarlo bene e poi si estende un pezzo di pellicola di paraffina su un'estremità, facendo attenzione a che non rompere la superficie della pellicola di paraffina (Figura 1).
    Nota: Il film di paraffina è idrofobo e semi-coprente, consentendo liquidi per formare gocce e uova per essere visto più facilmente.

2. Dechorionation

  1. Con un bicchiere di Pasteur pipetta, aggiungere gocce di soluzione di candeggina (ipoclorito di sodio 0,83%) per il film di paraffina.
    Nota: È più facile tenere traccia delle uova se solo 2-3 uova sono in ogni goccia. In alternativa, per gestire un numero di grande uovo, raccogliere le uova in gocce di 1x tampone fosfato salino (PBS).
    Attenzione: Bleach è corrosivo; indossare guanti durante la manipolazione candeggina e non inalano.
  2. Rimuovere il whiteflies adulti dalla foglia.
  3. Posizionare la foglia al microscopio per vedere chiaramente le uova e raccogliere le uova singolarmente e accuratamente con una sonda sottile. Per rendere una sonda, è necessario inserire un pin di nadel minuten a 45° o a un angolo di lavoro confortevole in un puntale fuso (Figura 2).
  4. Trasferire le uova a candeggina o 1X PBS. Se si utilizza 1X PBS, togliere il 1X PBS con un vetro Pasteur pipetta una volta tutte le uova sono raccolti e, quindi, aggiungere candeggina per le uova.
    Nota: Quando si raccolgono le uova, sollevare lentamente l'uovo dalla sua base fino a quando il pedicello è rimosso dalla foglia. Il pedicello è appiccicoso, e l'uovo comunemente si attaccherà alla punta della sonda fino a quando si è tuffato nella candeggina.
    Nota: Si raccomanda di utilizzare pipette Pasteur separata di vetro per tutti i reagenti e le pipette possono essere modificate con calore a restringere le punte e ridurre il rischio di aspirare accidentalmente uova di mosche bianche. Per evitare residui e contaminazioni, pulire le pipette con acqua deionizzata dopo ogni uso.
  5. Attendere 10 min. Se c'è un interesse nell'embriogenesi in uova oltre 1 h, è possibile lasciare le uova in candeggina per fino a 15 min.
    Nota: Per le uova che sono fino a 1h di vecchia, 10 min è sufficiente.

3. fissazione

Nota: Questi passaggi provengono da un protocollo dell'ordine dei Hymenoptera.17.

  1. Rimuovere la candeggina (che contiene i frammenti di corion) con un pipetta Pasteur di vetro ed eliminarlo. Aggiungere gocce di acido acetico glaciale con un vetro Pasteur pipetta e attendere 3 min.
    Attenzione: Procedere con questo passaggio sotto cappa aspirante. Acido acetico glaciale è corrosivo; indossare guanti quando movimentazione acido acetico glaciale e non inalare, specialmente in combinazione con la candeggina residua.
  2. Rimuovere l'acido acetico glaciale con un pipetta Pasteur di vetro e aggiungere gocce di soluzione di Clarke (3:1 di etanolo assoluto: acido acetico glaciale) con un bicchiere di Pasteur pipetta. Attendere fino a quando la maggior parte della soluzione è evaporata (o 10 minuti max).
  3. Aggiungere gocce di etanolo al 70% per le uova con un vetro pipetta Pasteur e attendere fino a quando la maggior parte dell'etanolo evaporato (o 10 min max).

4. colorazione

  1. Rimuovere qualsiasi residuo etanolo con un pipetta Pasteur di vetro e aggiungere gocce di PBS 1X le uova con un vetro pipetta Pasteur per ottenere il pH vicino a 7.0. Impostare il vetrino in una camera umida per evitare dissecazione, ad esempio, in una casella di punta di pipetta vuoto con un tovagliolo di carta bagnato all'interno (Figura 3). Attendere almeno 30 min.
    Nota: Questo è il punto migliore se è necessaria una pausa, come camera umidostatica può prevenire l'essiccazione.
  2. Rimuovere il PBS 1x con un pipetta Pasteur, di vetro e aggiungere gocce di 0,1 μg/mL DAPI, una macchia fluorescente DNA, con un bicchiere di Pasteur pipetta. Impostare il vetrino in una camera umida scuro e aspettare almeno 15 minuti.
    Attenzione: DAPI è un irritante, quindi maneggiare con guanti.

5. lavaggio

  1. Rimuovere il DAPI con un pipetta Pasteur di vetro.
  2. Aggiungere gocce di 1 x TBST (5 x soluzione fatta da 30 g di Tris, 43,8 g di NaCl, 5 mL di polisorbato 20 e 1,0 g di NaN3 [pH 7.5] e portato a 1 L con acqua grado PCR) per le uova con un bicchiere di Pasteur pipetta. Attendere 5 minuti prima di rimuovere la 1 x TBST con un pipetta Pasteur di vetro. Ripetere questo passaggio 2 volte.

6. montaggio

  1. Dopo il lavaggio finale, Pipettare attentamente tutte le uova dal film di paraffina su una parte pulita del vetrino da microscopio. Rimuovere l'eccesso 1 x TBST; quindi, aggiungere 20 µ l di supporti di montaggio (glicerolo 80% e 20% 1 x TBST con 2% n-gallato di propile) e posizionare un vetrino pulito sopra le uova.
  2. Per l'archiviazione a lungo termine, sigillare il vetrino di copertura con smalto trasparente e, quindi, conservare il vetrino al buio a 2 ° C o visualizzarlo immediatamente sotto un microscopio a fluorescenza.

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Risultati

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Per verificare se la Rickettsia colpisce il tasso di fertilizzazione di b. tabaci MEAM1 femmine, abbiamo allevato Rickettsia-infettati (R+) o non infetti (R.–) b. tabaci su piante di fagiolo dall'occhio (Vigna unguiculata) in separare le gabbie a 27 ° C, umidità relativa 70% e un fotoperiodo di 16 h luce/8 h scuro. R+ e R– quarto instar whiteflies erano accuratamente rimosso dalle foglie e isolato in ...

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Discussione

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Questo protocollo è il primo a catturare il tasso di fertilizzazione o rapporto primario del sesso di b. tabaci. La sfida del presente protocollo è che richiede ai ricercatori di imparare a gestire le uova di mosche bianche rapidamente, garantendo che non più di 1 h è passato dal momento che le uova erano oviposited fino a quando non sono fissi. Durante gli esperimenti preliminari, uova che sono stati corretti alle 3h o più postoviposition erano troppo vecchie per osservare la fecondazione, come singamia aveva a...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ringraziamenti

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Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione di NSF (DEB-1020460) a M.S.H. e una sovvenzione di USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Gli autori ringraziano Brennan Zehr per la macchiatura uova di mosche bianche con molta abilità e Zen. Gli autori ringraziano Mike Riehle per consentire l'uso del suo microscopio a fluorescenza per l'imaging. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Marco Gebiola per le immagini di uovo. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Jimmy Conway per aiutare nei momenti cruciali durante gli esperimenti.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1x PBSQualsiasi
1x TBSTQualsiasi5x soluzione composta da 30 g di Tris, 43,8 g di NaCl, 5 mL di Tween-20 e 1,0 g di NaN3 pH 7,5 e portata a 1 L con acqua di grado PCR
CandegginaCloroxQualsiasi candeggina per uso domestico funzionerà purché possa essere diluita allo 0,83% di ipoclorito di sodio
Smalto trasparenteQualsiasi
DAPI dilattatoSanta Cruz Biotechnologysc300415
EtanoloQualsiasiDiluire al 70% di EtOH
Microscopio fluorescenteNikon NikonEclipse 50i è stato utilizzato in questo esperimento, ma qualsiasi microscopio fluorescente con filtro di eccitazione 340/380 nm e ingrandimento di almeno 4-10x può essere utilizzato
Acido acetico glacialeMallinckrodtUN2789
GliceroloPer
questo esperimento è stato utilizzato un microscopio Wild M5A, ma è possibile utilizzare qualsiasi microscopio in cui l'operatore possa vedere chiaramente le uova di mosca bianca
Per i coperchi delle diapositive più grandi sarà necessario aggiungere più supporti di montaggio.
Vetrini per microscopioQualsiasi
perno nadel MinutenBioQuip1208SAI perni nadel Minuten sono opzionali per la modellazione come sonde con punte per pipette
NaClQualsiasi
NaN3Any
n-propil-gallatoSigma/Santa Cruz BiotechnologyP3130/sc-250794
ParafilmPipette Bemis
PasteurFisher Scientific13-678-20AFisherbrand Pipette monouso in vetro borosilicato Pasteur 5,75 pollici. Potrebbe essere necessario anche un bruciatore Bunsen se l'operatore desidera allungare e restringere le pipette Acqua di
grado PCRQualsiasi
Puntali per pipetteQualsiasiI puntali per pipette sono opzionali per la modellazione come sonde con perni nadel minuten
Piccolo bulbo contagocceQualsiasiDeve adattarsi alla pipetta
Pasteur TrisAny
Tween-20Any
Coprivetrini per microscopio Tutti i metodi sono per vetrini di dimensioni 18 mm x 18 mm.

Riferimenti

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  1. Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
  2. Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
  3. Bourke, A. F. G., Franks, N. R. Social Evolution in Ants. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1995).
  4. Pascal, S., Callejas, C. Intra- and interspecific competition between biotypes B and Q of Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae) from Spain. Bulletin of Entomological Research. 94 (4), 369-375 (2004).
  5. Liu, S. -S., et al. Asymmetric mating interactions drive widespread invasion and displacement in a whitefly. Science. 318 (5857), 1769-1772 (2007).
  6. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Mate discrimination in invasive whitefly species. Journal of Insect Behavior. 23 (5), 364-380 (2010).
  7. Crowder, D. W., Sitvarin, M. I., Carrière, Y. Plasticity in mating behaviour drives asymmetric reproductive interference in whiteflies. Animal Behaviour. 79 (3), 579-587 (2010).
  8. Tsueda, H., Tsuchida, K. Reproductive differences between Q and B whiteflies, Bemisia tabaci, on three host plants and negative interactions in mixed cohorts. Entomologia Experimentalis et Applicata. 141, 197-207 (2011).
  9. Wang, P., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Roles of mating behavioural interactions and life history traits in the competition between alien and indigenous whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 102 (4), 395-405 (2012).
  10. Sun, D. -B., Li, J., Liu, Y. -Q., Crowder, D. W., Liu, S. -S. Effects of reproductive interference on the competitive displacement between two invasive whiteflies. Bulletin of Entomological Research. 104 (3), 334-346 (2014).
  11. Liu, S. -S., Colvin, J., De Barro, P. J. Species concepts as applied to the whitefly Bemisia tabaci systematics: how many species are there? Journal of Integrative Agriculture. 11 (2), 176-186 (2012).
  12. Invasive Species Specialist Group. Global Invasive Species Database. , Available from: http://iucngisd.org/gisd/100_worst.php (2018).
  13. Gilbertson, R. L., Batuman, O., Webster, C. G., Adkins, S. Role of the insect supervectors Bemisia tabaci and Frankliniella occidentalis in the emergence and global spread of plant viruses. Annual Review of Virology. 2 (1), 67-93 (2015).
  14. Giorgini, M., et al. Rickettsia symbionts cause parthenogenetic reproduction in the parasitoid wasp Pingala soemius (Hymenoptera: Eulophidae). Applied and Environmental Microbiology. 76 (8), 2589-2599 (2010).
  15. Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
  16. Cass, B. N., et al. Dynamics of the endosymbiont Rickettsia in an insect pest. Microbial Ecology. 70 (1), 287-297 (2015).
  17. Vavre, F., de Jong, J. H., Stouthamer, R. Cytogenetic mechanism and genetic consequences of thelytoky in the wasp Trichogramma cacoeciae. Heredity. 93 (6), 592-596 (2004).
  18. Cass, B. N., et al. Conditional fitness benefits of the Rickettsia bacterial symbiont in an insect pest. Oecologia. 180 (1), 169-179 (2016).
  19. Hunter, M. S., Asiimwe, P., Himler, A. G., Kelly, S. E. Host nuclear genotype influences phenotype of a conditional mutualist symbiont. Journal of Evolutionary Biology. 30, 141-149 (2017).
  20. Gottlieb, Y., et al. Inherited intracellular ecosystem: symbiotic bacteria share bacteriocytes in whiteflies. FASEB Journal. 22 (7), 2591-2599 (2008).
  21. Luan, J., Sun, X., Fei, Z., Douglas, A. E. Maternal inheritance of a single somatic animal cell displayed by the bacteriocyte in the whitefly Bemisia tabaci. Current Biology. 28 (3), 459-465 (2018).
  22. Guo, J. -Y., Cong, L., Wan, F. -H. Multiple generation effects of high temperature on the development and fecundity of Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae) biotype B. Insect Science. 20 (4), 541-549 (2013).
  23. Cui, X., Wan, F., Xie, M., Liu, T. Effects of heat shock on survival and reproduction of two whitefly species, Trialeurodes vaporariorum and Bemisia tabaci biotype B. Journal of Insect Science. 8 (24), (2008).
  24. Boykin, L. M. Bemisia tabaci nomenclature: Lessons learned. Pest Management Science. 70 (10), 1454-1459 (2014).
  25. Qin, L., Pan, L. -L., Liu, S. -S. Further insight into reproductive incompatibility between putative cryptic species of the Bemisia tabaci whitefly complex. Insect Science. 23 (2), 215-224 (2016).

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