Vi presentiamo una semplice tecnica citogenetica usando 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) per determinare il tasso di fertilizzazione e rapporto primario del sesso del parassita invasivo haplodiploid Bemisia tabaci.
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Articolo metodologico
Determinare il tasso di fertilizzazione dell'uovo di Bemisia tabaci utilizzando una tecnica citogenetica
In questo articolo
Sommario
Abstract
Poche specie di aleurodidi sap-succhiare sono alcuni dei più dannosi parassiti terrestri in tutto il mondo a causa i danni alle colture che infliggono e virus vegetali che hanno vector. Nonostante i numerosi studi della biologia di queste specie in ambienti diversi, un parametro chiave vita storia, prole rapporti del sesso, ha ricevuto poca attenzione, è ancora importante per prevedere la dinamica di popolazione. Il rapporto primario del sesso (rapporto del sesso alla deposizione delle uova) di Bemisia tabaci non è stato segnalato mai, ma può essere trovato determinando il tasso di fertilizzazione dell'uovo di questo insetto haplodiploid. La tecnica prevede il dechorionation di uova con candeggina, una serie di passaggi di fissazione e l'applicazione della generale macchia fluorescente DNA, DAPI (4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole, una tintura fluorescente DNA-binding), da associare alla pronuclei maschili e femminili. Qui, presentiamo la tecnica e un esempio della sua applicazione, per verificare se un batterio endosimbiotica, Rickettsia SP. nr. bellii, influenzato il rapporto primario del sesso di b. tabaci. Questo metodo può aiutare negli studi di popolazione di aleurodidi, o determinare se allocazione sesso esiste con determinati stimoli ambientali.
Introduzione
Lo studio dell'allocazione di sesso, o il relativo investimento nella prole maschio e femmina, è una pietra angolare di ecologia comportamentale1,2,3. Oltre alla sua potenza per test adattivi modelli di comportamento, sapendo che la strategia di allocazione del sesso di un organismo può migliorare modelli delle sue dinamiche di popolazione. In molte specie, allocazione di sesso è controllata dalle madri. Per determinare l'allocazione di sesso, è importante determinare il rapporto primario del sesso o la percentuale di femmine al momento della deposizione dell'uovo. Anche se i....
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Protocollo
Nota: Garantire che tutto il lavoro è eseguito a temperatura ambiente in una zona ben ventilata o sotto una cappa aspirante. Tutte le 'gocce' in questo protocollo sono definiti come 5 – 20 µ l, a seconda delle preferenze dell'operatore.
1. il primo programma di installazione
- Consentire whiteflies femminile a oviposit su foglie di pulito. Sono esempi per arene di deposizione delle uova gabbie clip o foglie tagliate per adattarsi su agar in una capsula di Petri. Fare un buco copribile nella gabbia di clip o copertura di Petri da inserire e rimuovere gli adulti. In alternativa, rapidamente mettere un vaso di adulti r....
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Risultati
Per verificare se la Rickettsia colpisce il tasso di fertilizzazione di b. tabaci MEAM1 femmine, abbiamo allevato Rickettsia-infettati (R+) o non infetti (R.–) b. tabaci su piante di fagiolo dall'occhio (Vigna unguiculata) in separare le gabbie a 27 ° C, umidità relativa 70% e un fotoperiodo di 16 h luce/8 h scuro. R+ e R– quarto instar whiteflies erano accuratamente rimosso dalle foglie e isolato in .......
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Discussione
Questo protocollo è il primo a catturare il tasso di fertilizzazione o rapporto primario del sesso di b. tabaci. La sfida del presente protocollo è che richiede ai ricercatori di imparare a gestire le uova di mosche bianche rapidamente, garantendo che non più di 1 h è passato dal momento che le uova erano oviposited fino a quando non sono fissi. Durante gli esperimenti preliminari, uova che sono stati corretti alle 3h o più postoviposition erano troppo vecchie per osservare la fecondazione, come singamia aveva a.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questa ricerca è stata finanziata da una sovvenzione di NSF (DEB-1020460) a M.S.H. e una sovvenzione di USDA AFRI (2010-03752) a M.S.H. Gli autori ringraziano Brennan Zehr per la macchiatura uova di mosche bianche con molta abilità e Zen. Gli autori ringraziano Mike Riehle per consentire l'uso del suo microscopio a fluorescenza per l'imaging. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Marco Gebiola per le immagini di uovo. Gli autori ringraziano Suzanne Kelly e Jimmy Conway per aiutare nei momenti cruciali durante gli esperimenti.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1x PBS | Qualsiasi | ||
| 1x TBST | Qualsiasi | 5x soluzione composta da 30 g di Tris, 43,8 g di NaCl, 5 mL di Tween-20 e 1,0 g di NaN3 pH 7,5 e portata a 1 L con acqua di grado PCR | |
| Candeggina | Clorox | Qualsiasi candeggina per uso domestico funzionerà purché possa essere diluita allo 0,83% di ipoclorito di sodio | |
| Smalto trasparente | Qualsiasi | ||
| DAPI dilattato | Santa Cruz Biotechnology | sc300415 | |
| Etanolo | Qualsiasi | Diluire al 70% di EtOH | |
| Microscopio fluorescente | Nikon Nikon | Eclipse 50i è stato utilizzato in questo esperimento, ma qualsiasi microscopio fluorescente con filtro di eccitazione 340/380 nm e ingrandimento di almeno 4-10x può essere utilizzato | |
| Acido acetico glaciale | Mallinckrodt | UN2789 | |
| Glicerolo | Per | ||
| questo esperimento è stato utilizzato un microscopio Wild M5A, ma è possibile utilizzare qualsiasi microscopio in cui l'operatore possa vedere chiaramente le uova di mosca bianca | |||
| Per i coperchi delle diapositive più grandi sarà necessario aggiungere più supporti di montaggio. | |||
| Vetrini per microscopio | Qualsiasi | ||
| perno nadel Minuten | BioQuip | 1208SA | I perni nadel Minuten sono opzionali per la modellazione come sonde con punte per pipette |
| NaCl | Qualsiasi | ||
| NaN3 | Any | ||
| n-propil-gallato | Sigma/Santa Cruz Biotechnology | P3130/sc-250794 | |
| Parafilm | Pipette Bemis | ||
| Pasteur | Fisher Scientific | 13-678-20A | Fisherbrand Pipette monouso in vetro borosilicato Pasteur 5,75 pollici. Potrebbe essere necessario anche un bruciatore Bunsen se l'operatore desidera allungare e restringere le pipette Acqua di |
| grado PCR | Qualsiasi | ||
| Puntali per pipette | Qualsiasi | I puntali per pipette sono opzionali per la modellazione come sonde con perni nadel minuten | |
| Piccolo bulbo contagocce | Qualsiasi | Deve adattarsi alla pipetta | |
| Pasteur Tris | Any | ||
| Tween-20 | Any |
Riferimenti
- Charnov, E. L. Sex ratio in spatially structured populations. The Theory of Sex Allocation. May, R. M. , Princeton University Press. Princeton, NJ. 67-92 (1982).
- Godfray, H. C. J. Parasitoids: behavioral and evolutionary ecology. , Princeton University Press. Princeton, NJ. (1994).
- Bourke, A. F. G., Franks, N. R.
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Ristampe e permessi
