Controllo del Cluster iniziale delle cellule 3D in un ibrido Gel cubo dispositivo per reticolo ripetibile formazioni

Summary

Presentiamo una procedura per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere una formazione di reticolo ripetibile. Un dispositivo cubico contenente due diversi idrogeli è impiegato per realizzare multi-direzionale imaging per la formazione del reticolo di tessuto.

Abstract

L'importanza delle colture in vitro di 3D notevolmente è sottolineata nella coltura del tessuto e delle cellule. Tuttavia, la mancanza di ripetibilità sperimentale è una delle sue restrizioni. Producendo pochi risultati ripetibili di formazione di pattern si deteriora l'analisi dei meccanismi di auto-organizzazione. Ridurre la variazione in condizioni di coltura iniziale, come ad esempio la densità delle cellule e la distribuzione nella matrice extracellulare (ECM), è fondamentale per migliorare la ripetibilità di una cultura 3D. In questo articolo, dimostriamo una procedura semplice ma robusta per controllare la forma di cluster iniziale delle cellule in una matrice extracellulare 3D per ottenere formazioni reticolo altamente ripetibile. Un micromold con una forma desiderata è stato fabbricato utilizzando fotolitografia o un processo di lavorazione, e formava una tasca 3D in ECM contenuta in un cubo di gel ibrido (HGC). Le cellule altamente concentrate quindi sono state iniettate nella tasca affinché la forma di cluster di cellule abbinato con la forma di stampo fabbricato. Il lavoratore HGC ammessi multi-direzionale scansione dalla sua rotazione, che permetteva a imaging ad alta risoluzione e la cattura di struttura del tessuto intero anche se è stato utilizzato un basso ingrandimento lente. Cellule epiteliali bronchiali umane normali sono state usate per illustrare la metodologia.

Introduction

Notevolmente è sottolineata l'importanza di una cultura 3D, che imita meglio ambienti biologici rispetto a una cultura 2D, in cellule/tessuti cultura^1,2,3. L'interazione tra cellule e matrice extracellulare (ECM) fornisce importanti indicazioni riguardanti la morfogenesi^4,5. Molti tessuti formazioni possono emergere solo in ambienti 3D, quali la piegatura processo^6,7, invaginazione⁸e formazione tubolare^9,

Protocol

1. fabbricazione di dispositivo ibrido gel cubo

1. Preparare un telaio cubico di policarbonato (PC) tramite un processo di lavorazione o una stampante 3D. La dimensione del telaio PC dipende la dimensione del campione. In questo studio, abbiamo utilizzato un telaio di 5 mm su ciascun lato affinché i rami avevano spazio sufficiente per allungare durante la coltura.
2. Posizionare il telaio del PC su una lastra di vetro pre-raffreddata o un'altra superficie liscia in una scatola di ghiaccio (< 0 ° C) (Figura 1A).
3. Aggiungere 12 µ l di pre-riscaldata agarosio al 1.5% (p/v) dalla faccia superiore del telaio cubico alla ....

Results

Cellule (NHBE) di epiteliali bronchiali umane normali sono state utilizzate per dimostrare la metodologia illustrata e controllare la geometria iniziale delle cellule collettiva per ottenere la forma di un cilindro e una forma di prisma, rispettivamente in un ambiente di ECM. Vengono presentati i risultati di imaging multi-direzionali ottenuti dal contrasto di fase, nonché falloidina macchiatura della forma di un cilindro (fig. 4AB) e la form.......

Discussion

Il metodo presentato in questa carta è semplice e può essere eseguito senza attrezzature ad alta tecnologia. Contemporaneamente, un risultato di controllo cella precisa forma cluster nello spazio 3D di idrogel è ottenibile. Dopo il controllo iniziale, le cellule possono crescere nel HGC tanto quanto sono coltivate su un piatto. L'imaging multi-direzionale viene eseguita ruotando il campione con l'HGC utilizzando qualsiasi sistema di microscopia, e migliora significativamente la qualità delle immagini. La scelta dei mater.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
piastra a 12 pozzetti	Corning  Inc.	3513
Acetato di 2-metossi-1-metiletile	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldeide	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarosio, bassa temperatura di gelificazione  BioReagente	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 falloidina	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM	Lonza	CC-3170	Terreno specializzato per cellule NHBE
Soluzione di albumina sierica bovina (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2	Lonza	CC-3162	Terreno specializzato per cellule endoteliali
Lipidure	NOF co.		Polimero MPC
Matrigel fattore di crescita ridotto matrice della membrana basale	Corning  Inc.	354230
Siero di capra normale (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Cellule epiteliali bronchiali umane normali	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Resina di base e catalizzatore per PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Fotoresist negativo spesso (spessore: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Tripsina-EDTA (0,25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416