Vi presentiamo approcci sperimentali per studi interattori di RNA double-stranded RNA binding della chinasi di proteina RNA-attivato (PKR) durante il ciclo cellulare dei mammiferi utilizzando cellule HeLa. Questo metodo utilizza la formaldeide a crosslink RNA-PKR complessi e immunoprecipitazione per arricchire associato a PKR RNAs. Questi RNA possono essere ulteriormente analizzati mediante sequenziamento ad alte prestazioni o qRT-PCR.
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Articolo metodologico
Lo studio di RNA interattori della chinasi proteica RNA-attivato durante il ciclo cellulare dei mammiferi
In questo articolo
Sommario
Abstract
Protein chinasi attivata da RNA (PKR) è un membro della risposta immunitaria innata di proteine e riconosce la struttura secondaria del doppio filamento di RNA virale. Quando associato a virale RNA double-stranded (dsRNA), PKR subisce la dimerizzazione e successive autophosphorylation. PKR fosforilato (pPKR) diventa attivo e induce la fosforilazione della subunità alfa di fattore di iniziazione eucariotica 2 (eIF2α) per sopprimere traduzione globale. La prova aumentante suggerisce che PKR può essere attivato in condizioni fisiologiche, come durante il ciclo cellulare o in varie condizioni di stress senza infezione. Tuttavia, la nostra comprensione degli attivatori RNA di PKR è limitata a causa della mancanza di un metodo sperimentale standardizzata per acquisire e analizzare RNAds PKR-interazione. Qui, presentiamo un sperimentale protocollo specificamente arricchire e analizzare PKR associato RNAs durante il ciclo cellulare utilizzando cellule HeLa. Utilizziamo l'attività di reticolazione efficiente di formaldeide per risolvere complessi PKR-RNA e isolarli tramite immunoprecipitazione. PKR co-immunoprecipitate RNAs poi possono essere ulteriormente elaborati per generare una libreria di sequenziamento ad alte prestazioni. Una classe importante di PKR-interazione cellulare RNAds è RNA mitocondriale (mtRNAs), che può esistere come intermolecolari RNAds attraverso l'interazione complementare tra il pesante-strand e il RNAs luce-strand. Per studiare la strandedness di questi mtRNAs duplex, presentiamo anche un protocollo per la qRT-PCR strand-specific. Il nostro protocollo è ottimizzato per l'analisi di RNA associati a PKR, ma può essere facilmente modificato per studiare cellulare RNAds o RNA-interattori delle altre proteine che legano il dsRNA.
Introduzione
Protein chinasi attivata da RNA (PKR), chinasi di iniziazione eucariotica noto anche come fattore 2-alfa 2 (EIF2AK2), è una chinasi di proteina ben caratterizzati che trasmette informazioni fornite da RNA. Appartiene all'alfa subunità iniziazione 2 traduzione negli eucarioti (eIF2α) famiglia delle chinasi fosforila eIF2α a serina 51 in risposta all'infezione di sopprimere traduzione globale1. In questo contesto, PKR è attivato da virale RNA double-stranded (dsRNA), che fornisce una piattaforma per PKR dimerizzazione e autophosphorylation2. Oltre a eIF2α, PKR anche può fosforilare p53, insulina recettore substrato 1, inib....
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Protocollo
1. soluzione e cella preparazione
- Preparazione della soluzione
- Per il mezzo di coltura cellulare, preparare il supporto per la coltura delle cellule HeLa aggiungendo 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM).
Nota: Gli antibiotici possono essere aggiunti al terreno di coltura delle cellule, ma non usiamo gli antibiotici. - Per il 0,1% di paraformaldeide, sciogliere paraformaldeide al 4% (p/v) in 1 x Phosphate-Buffered salino (PBS) con riscaldamento su un piatto caldo e diluire a fare 30 mL di 0,1% (v/v) paraformaldeide aggiungendo 1X PBS.
Attenzione: Eseguire tutti i passaggi in una ....
- Per il mezzo di coltura cellulare, preparare il supporto per la coltura delle cellule HeLa aggiungendo 50 mL di siero bovino fetale (FBS) a 500 mL di Medium per volta dell'Aquila di Dulbecco (DMEM).
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Risultati
Uno schema per il processo di arrestare le cellule HeLa nella fase S o M del ciclo cellulare è illustrato nella Figura 1. Per un esempio di fase-arrestato M, possiamo visualizzare chiaramente cellule rotonde a forma sotto il microscopio (Figura 2A). Per esaminare l'efficienza dell'arresto del ciclo cellulare, il contenuto nucleare della cellula possa essere analizzato usando FACS (Figura 2B). La figura 3 Mostra dati rappr.......
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Discussione
Il processo per preparare campioni di fase-arrestato S o M è illustrato nella Figura 1. Per arrestare le cellule in fase S, abbiamo usato un metodo di blocco doppio timidina dove abbiamo trattato le cellule con timidina due volte con un rilascio di 9 h in mezzo per garantire arresto ad alta efficienza (Figura 1A). Per arresto di fase M, abbiamo trattato le cellule una volta con timidina seguita da un rilascio di 9 h e poi applicato nocodazole alle cellule di blo.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dal programma di base scienza ricerca attraverso la National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal governo coreano Ministero delle scienze e TIC (NRF-2016R1C1B2009886).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific AM9260G | ||
| 1 M Tris, pH 7,0 | Thermo Fisher Scientific | AM9855G | |
| 1 M Tris, pH 8,0 | Thermo Fisher Scientific AM9855G | ||
| 1,7 mL provetta per microcentrifuga | Axygen | MCT-175-C | |
| 10% Nonidet-p40 (NP-40) | Biosolution | BN015 | |
| 10X tampone di caricamento del DNA | TaKaRa | 9157 | |
| 15 mL provetta conica | SPL | 50015 | |
| adattatore | 5'-rApp NN NNT GGA ATT CTC GGG TGC CAA GG/3ddC/-3'3 | ||
| M Acetato di sodio pH 5,5 | Thermo Fisher Scientific | AM9740 | |
| adattatore | ' 5'-GUU CAG AGU UCU ACA GUC CGA CGA UCN NNN-3' | ||
| 5 M NaCl | Thermo Fisher Scientific | AM9760G | |
| 50 mL provetta conica | SPL | 50050 | |
| Cloroformio acido-fenolo, pH 4,5 | Thermo Fisher Scientific | AM9722 | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Perle magnetiche Pulizia DNA/RNA |
| Fosfatasi alcalina antartica | New England Biolabs | M0289S | |
| Anti-DGCR8 | Prodotto in casa | ||
| Anti-PKR (D7F7) | Tecnologia di segnalazione cellulare | 12297S | |
| Anti-PKR (Milli) | Millipore EMD | 07-151 | |
| ATP (100 mM) | GE Healthcare | GE27-2056-01 | |
| Bromofenolo sale sodico blu | Sigma-aldrich | B5525 | |
| Fosfatasi | alcalina intestinale di vitelloTaKaRa | 2250A | |
| Raschietto cellulare 25 cm 2 posizioni | Sarstedt | 83.183 | |
| CMV sequenza | promotore 5'-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGG-3'Aquila | ||
| modificata di Dulbecco medio | Welgene | LM001-05 | |
| miscela dNTP (2,5 mM) | TaKaRa | 4030 | |
| Etanolo, assoluto, grado ACS | Alfa-Aesar | A9951 | |
| Siero fetale bovino | Merck | M-TMS-013-BKR | |
| Formamide | Merck | 104008 | |
| Glicina | Bio-basico | GB0235 | |
| GlycoBlue coprecipitante (15 mg/mL) | Thermo Fisher Scientific | AM9516 | |
| Isopropanolo | Merck | 8.18766.1000 | |
| NEBNext rRNA Depletion Kit | di deplezione dell'rRNA | New England Biolabs | E6318 |
| Nocodazolo | Sigma-Aldrich | M1404 | |
| IgG di coniglio normale | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2729S | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 6148 | |
| PCR primer forward (RP1) | 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GCG ATC TAC ACG TTC AGA GTT CTA CAG TCC GA-3' | ||
| Primer inverso dell'indice PCR (RPI) | 5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNN NNN GTG ACT GGA GTT CCT TGG CAC CCG AGA ATT CCA-3'Provette | ||
| PCR con tappo piatto, 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Soluzione salina fosfato (PBS) Compressa | TaKaRa | T9181 | |
| DNA polimerasi ad alta fedeltà Phusion | New England Biolabs | M0530 | Polimerasi |
| ad alta fedeltàMicrocentrifuga PlateFuge con rotore oscillante | Benchmark | c2000 | |
| Polinucleotide chinasi (PNK) | TaKaRa | 2021A | |
| Proteinasi K, ricombinante, PCR Grade | Sigma-Aldrich | 3115879001 | |
| qPCR sequenza di primer: CO1 Pesante | Avanti/Indietro: 5′-GCCATAACCCAATACCAAACG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CO1 Light | Avanti/Indietro: 5′-TTGAGGTTGCGGTCTGTTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CO2 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CTAGTCCTGTATGCCCTTTTCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CO2 Light | Avanti/Indietro: 5′-GTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CO3 Heavy | Forward/Reverse: 5′-CCTTTTACCACTCCAGCCTAG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CO3 Light | Avanti/Indietro: 5′-CTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CYTB Heavy | Forward/Reverse: 5′-CAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: CYTB Light | Avanti/Indietro: 5′-GGATAGTAATAGGGCAAGGACG -3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: GAPDH | Avanti/Indietro: 5′-CAACGACCACTTTGTCAAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND1 Pesante | Avanti/Indietro: 5′-TCAAACTCAAACTACGCCCTG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND1 Luce | avanti/indietro: 5′-GTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND4 Pesante | Avanti/Indietro: 5′-CTCACACTCATTCTCAACCCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND4 Luce | avanti/indietro: 5′-TGTTTGTCGTAGGCAGATGG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND5 Pesante | Avanti/Indietro: 5′-CTAGGCCTTCTTACGAGCC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND5 Luce | avanti/indietro: 5′-TAGGGAGAGCTGGGTTGTTT-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND6 Pesante | Avanti/Indietro: 5′-TCATACTCTTTCACCCACAGC-3′/5′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer qPCR: ND6 Luce | avanti/indietro: 5′-TGCTGTGGGTGAAAGAGTATG-3′/5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-3′ | ||
| Esamero casuale | Thermo Fisher Scientific | SO142 | |
| Dnasi ricombinante I (senza RNASI) (5 U/μ L) | TaKaRa | 2270A | |
| Inibitore ricombinante della RNASI (40 U/μ L) | TaKaRa | 2313A | |
| Kit di rimozione dell'rRNA Ribo-Zero | Kit di | rimozione dell'rRNA | MRZH116 |
| Rotator | FINEPCR, ROTATOR AG | D1.5-32 | |
| RT sequenza di primer: CO1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTGAGGTTGGGGTCTGTTAG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CO1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGGTAGGCGTGGCCATAACCCAATACCAAACG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CO2 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTAAAGGATGCGTAGGGATGG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CO2 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCTAGTCCTGTATGCCCTTTTCCCC-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CO3 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGGTAGGCGTGCTCCTGATGCGAGTAATACGG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CO3 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCCTTTTTTTTCCACTCCAGCCTAG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CYTB Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGATAGTAATAGGGCAAGGACG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: CYTB Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGCAATTATACCCTAGCCAACCCC-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: GAPDH | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTGAGCGATGTGGCTCGGCT-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND1 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGTTGTGATAAGGGTGGAGAGG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND1 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTCAAACTCAAACTACGGCCCTG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND4 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGGTAGGCGTGTGTGTGTGTCGTAGGCAGATGG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND4 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGGTAGGCGTGCCTCACACTCATTCTCAACCC-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND5 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTTTGGGTGGGAGGATGATG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND5 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGGGTAGGCGTGCATTGTCGCATCCACCTTTA-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND6 Heavy | 5′-CGCAAATGGGCGGTAGGCGTGGGTTGAGGTCTTGGTGAGTG-3′ | ||
| Sequenza di primer RT: ND6 Light | 5′-CGCAAATGGGCGGGTAGGCGTGCCCATAATCATACAAAGCCCCCC-3′ | ||
| Polipropilene siliconato 1,5 mL G-tube | Bio Plas | 4167SLS50 | |
| Sodio dedecil solfato | Biosesang | S1010 | |
| Sodio desossicolato | Sigma-Aldrich | D6750 | |
| SUPERasi In inibitore della RNASI | Thermo Fisher Scientific | AM2694 | |
| SuperScript III trascrittasi inversa | Thermo Fisher Scientific | 18080093 | Trascrittasi inversa per la preparazione di librerie |
| Trascrittasi inversa SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18090010 | Trascrittasi inversa per qRT-PCR |
| SYBR gold nucleic acid gl colorante | Thermo Fisher Scientific | S11494 | |
| T4 polinucleotide chinasi | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 RNA ligasi 1 (ssRNA ligasi) | New England Biolabs | M0204 | |
| T4 RNA ligasi 2, troncato KQ | New England Biolabs | M0373 | |
| Thermomixer | Eppendorf ThermoMixer C con ThermoTop | ||
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T9250 | |
| Tris-borato-EDTA tampone (TBE) | TaKara | T9122 | |
| Triton X-100 | Promega | H5142 | |
| Ultralink Perle di proteina A sefarosio | Thermo Fisher Scientific | 22810 | Perle di proteina A |
| Ultrasuonatore | Bioruptor | ||
| Urea | Bio-basic | UB0148 | |
| Miscelatore a vortice | DAIHAN Scientific | VM-10 | |
| Xilene cianolo | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| γ-32P-ATP (10 μ Ci/μ L, 3,3 & mu; M) | PerkinElmer | BLU502A100UC |
Riferimenti
- Meurs, E. F., et al. Constitutive expression of human double-stranded RNA-activated p68 kinase in murine cells mediates phosphorylation of eukaryotic initiation factor 2 and partial resistance to encephalomyocarditis virus growth. Journal of Virology. 66 (10), 5805-5814 (1992).
- Patel, R. C., Stanton, P., McMil....
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Ristampe e permessi
