Articolo metodologico

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

DOI:

10.3791/59220

⸱

9 aprile 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institut Pasteur, CNRS UMR 3569, Unité de Neuroimmunologie Virale, 2Institut Pasteur, Unité d’Epidémiologie et de Pathophysiologie des Virus Oncogènes, Université Sorbonne Paris Cité/Paris Diderot, 3Institut Pasteur, PFIA, DTPS

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Abstract

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I primi screening di farmaci del sistema nervoso su un pertinenti e affidabile nel modello BBB cellulo per la loro penetrazione e loro interazione con la barriera e il parenchima cerebrale è ancora un bisogno insoddisfatto. Per colmare questa lacuna, abbiamo progettato un 2D in modello cellulo, il BBB-Minibrain, combinando un poliestere membrana porosa cultura inserto umano BBB modello con un Minibrain formato da un tri-coltura di cellule di cervello (neuroni, astrociti e microglia). Il BBB-Minibrain ci ha permesso di testare il trasporto di un candidato della droga neuroprotective (ad esempio, Neurovita), attraverso la BBB, per determinare il targeting specifico di questa molecola ai neuroni e per mostrare che la proprietà neuroprotective della droga è stata conservata dopo la droga aveva attraversato la BBB. Abbiamo anche dimostrato che BBB-Minibrain costituisce un modello interessante per rilevare il passaggio di particelle del virus attraverso la barriera di cellule endoteliali e per monitorare l'infezione del Minibrain di particelle del virus neuroinvasive. Il BBB-Minibrain è un sistema affidabile, facile da gestire per ricercatore addestrati nella tecnologia di coltura cellulare e predittiva dei fenotipi di cellule di cervello dopo il trattamento o insulto. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: l'introduzione di derisking passaggi precocemente durante lo sviluppo di droga da un lato e riducendo l'uso di d'altra parte la sperimentazione animale.

Introduzione

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Il cervello è separato dalla circolazione sistemica da una struttura non-permeabile che limita gli scambi tra parenchima del cervello e del sangue, chiamato emato - encefalica (BBB). Principalmente composto di cellule endoteliali cerebrali, la BBB dinamicamente interagisce con gli astrociti, microglia perivascolari e neuroni del parenchima cerebrale vicine. Le tre funzioni principali della BBB sono la creazione e il mantenimento dell'omeostasi ionica per funzioni neuronali, rifornimento del cervello con le sostanze nutrienti e protezione dalle lesioni tossiche o ingresso di agenti patogeni1,2, che contribuiscono alla il mantenimento della omeostasi del cervello e sue funzioni3. Questa barriera è così efficiente che solo pochi farmaci possono attraversare la BBB,4,5. Allo stato attuale, i metodi disponibili per predire se una molecola passa la BBB e diffuso nel cervello sono costituiti ex vivo studi sul monitoraggio di immagine materiale, autopsia del cervello di volontari umani di MRI (risonanza magnetica) o PET (emissione della posizione la tomografia) o farmacodinamica e farmacocinetici studi preclinici in animali6,7,8. Queste tecniche e modelli hanno alcune limitazioni, come la risoluzione limitata dell'animale domestico e la bassa sensibilità di MRI6,8, la difficoltà di quantificare molecole (cioè, le molecole dell'anticorpo basato per esempio) che male penetrare il cervello7e per il preclinici studia il loro costo elevato e la località di sperimentazione animale.

L'ultimo punto è importante perché, secondo il 3R regole, (sostituzione, affinamento e riduzione dei test sugli animali) le amministrazioni di regolamentazione hanno chiesto che i ricercatori sviluppano urgentemente scientificamente accurata alternativa all'animale sperimentazione9,10,11,12,13,14,15.

Negli ultimi decenni, diversi modelli in vitro di BBB sono stati proposti16,17,18 coltivando il filtro membrana inserisce le cellule endoteliali da diverse specie come il mouse, ratto, bovino e suino. Per quanto riguarda la specie umana, la disponibilità di scarsa e difficile di cellule primarie richiesto ai ricercatori di sviluppare modelli umani basati su cellule endoteliali immortalizzate cervello o cellule staminali umane19,20, 21. Queste barriere sono surrogati corretto in vitro di BBB a condizione che esprimono gli indicatori delle cellule endoteliali, marcatori di stretta della giunzione, trasportatori di efflusso, vettori soluti, recettori e rispondere a stimoli endoteliale 20. Alcuni modelli BBB utilizzando filtro membrana inserti rivestiti da cellule endoteliali e altri tipi di cellule (cioè, gli astrociti, neuroni o periciti22,23,24) sono stati analizzati. L'obiettivo di queste co-culture era di aumentare le caratteristiche fisiche di BBB, approfittando della secrezione di fattori solubili da astrociti/neuroni o periciti.

Tuttavia, nessuno di questi modelli include il parenchima cerebrale per studiare e prevedere il destino di un candidato della droga una volta ha superato la barriera. Di conseguenza, il nostro obiettivo era quello di costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di cellule cerebrali miste in un unico kit. Il BBB-Minibrain utilizza un sistema di cultura costituito da un filtro poroso inserito in un pozzetto di una piastra di coltura delle cellule del multiwell. Il filtro è ricoperto con cellule hCMEC/D3, una linea di endothelial delle cellule di cervello umano che è stata dimostrata altamente affidabile per droga BBB test25,26,27, per formare la BBB. Il Minibrain, che è una cultura co-differenziata dei neuroni umani e astrociti derivati dal NTera/Cl2.D1 cella linea28,29 misto insieme con la linea cellulare umana microglial CHME/Cl530 in rapporto corrispondente alla microglia vs rapporti di neuroni-astrociti del cervello31, è coltivata anche nella parte inferiore della piastra.

Oltre a studiare il passaggio di farmaci attraverso la barriera emato-encefalica e il loro destino nel parenchima, l'interfaccia di emato-encefalica in cellulo modello potrebbe essere un potente strumento per affrontare l'ingresso di agenti patogeni nel cervello (neuroinvasiveness), la dispersione nel cervello (neurotropism) e la tossicità (neurovirulence) che possano esercitare sulle cellule di parenchima del cervello. Studi neurovirulence e neuroinvasiveness sarebbero beneficiare dello sviluppo di un efficiente modello di cellulo ed essere vantaggioso sostituire modelli animali. Utilizzando il kit di BBB-Minibrain32, abbiamo dimostrato il fenotipo neuroinvasive di rari mutanti virali che accumulato nel ceppo di virus neurotropi francese del Virus della febbre gialla (vale a dire, FNV-YFV33,34) utilizzato per preparare un interrotto il vaccino vivo YFV e il passaggio di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective, chiamato Neurovita (d'ora in poi denominato NV nel manoscritto)35. Perché NV né naturalmente attraversa la membrana delle cellule, né la BBB, NV è stata fusa con la parte variabile (VHH) di un anticorpo di singola catena di lama che attraversa le membrane biologiche, tra cui la BBB e funziona come una cella penetrante molecola (CPM)36. La proprietà CPM di VHH sembra dipendere il punto isoelettrico e la lunghezza dei VHH37.

Questo test cellulo dovrebbe rendere possibile ordinare le molecole che potenzialmente potrebbero attraversare la BBB prima realizzazione di farmacocinetica e farmacodinamica analisi negli animali e idealmente nello stesso tempo essere in grado di prevedere il loro comportamento nel sistema nervoso parenchima. Questo sistema è biologicamente rilevanti e facile da impostare e gestire da professionisti ben addestrati in cella cultura26,29,30,38. L'interesse di tali test cellulo sarebbe duplice: ridurre i costi di test preclinici su una mano e riducendo l'uso di sperimentazione animale d'altra parte.

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Protocollo

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1. cella lavoro della coltura di Ntera/CL2. D1 per preparare una co-coltura di hNeurons post-mitotici e hAstrocytes (NT2-n/a)

Nota: Questo è il componente di Minibrain (Figura 1).

  1. Coltura del Ntera/Cl2.D1
    1. Rimuovere una fiala di cellule congelate dal serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
    2. Scongelare le cellule rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di terreno DMEM F12 completo (per volta Eagle Medium di Dulbecco: medio di miscela nutriente F-12) completati con 10% siero bovino fetale (FBS), glutamina 2mm, 100 UI di penicillina e streptomicina µ g 100 (cioè, completare Medio DMEM F12).
    4. Centrifugare a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente (TA). Dissociare il pellet in 2 mL di terreno DMEM F12 completo.
    5. Trasferire in un matraccio di cultura del tessuto T75 in polistirolo con trattamento specifico per le cellule aderenti sensibili (T75Cell+) che contiene 13 mL di terreno DMEM F12 completo.
    6. Coltura di cellule in un incubatore mantenuto a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza (vale a dire, circa 5 giorni). Sostituire il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Subcoltura del Ntera/Cl2.D1 e amplificazione
    1. Rimuovere il supporto dal pallone.
    2. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione salina tampone fosfato (PBS) completato con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione di EDTA (conservati presso RT).
    4. Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA (0.05% tripsina, 0,02% EDTA) e incubare per 2 minuti a TA.
    5. Agitare il matraccio e assicurarsi che le cellule si staccano dalla superficie plastica.
    6. Aggiungere 10 mL di terreno DMEM F12 completo per inattivare la tripsina, trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g a TA.
    7. Dissociare la pallina con 10 mL di terreno completo e uso 1 mL per inoculare ogni nuova bottiglia contenente 14 mL di terreno DMEM F12 completo.
      Nota: Trenta boccette T75 Cell+ sono necessari per ogni differenziazione.
    8. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza.
  3. Differenziazione di NTera/Cl2.D1 in co-coltura umana del neurone-Astrocita
    Nota: Questo è il componente principale della Minibrain.
    1. Al giorno 0, dissociare le cellule con tripsina-EDTA come descritto al punto 1.2 e dissociare il pellet cellulare di ciascuna beuta con 2 mL di terreno DMEM F12 completo.
    2. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare (corrispondente a 5 x 106 cellule) a 60 capsule di Petri in plastica di diametro 85 mm che contiene 11 mL di terreno DMEM F12 completo.
      Nota: Le celle non verranno collegato alla plastica e saranno aggregato a formare pseudo neurosfere (Vedi foto nel pannello inferiore della Figura 1). Incubare il 60 capsule di Petri a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per un giorno.
    3. Al giorno 1, aggiungere 1 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 130 µM di acido all-Trans retinoico (ATRA) a capsula di Petri (concentrazione finale ATRA 10 µM) e restituire le piastre a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per 24 h.
    4. Al Day 2, trasferire molto attentamente il supporto che contiene sfere di cella di ogni Petri Dish in una provetta da 50 mL e centrifugare per 10 min a 50 x g e RT. dissociarsi attentamente il pellet sciolto con 13 mL di completa DMEM F12 supplementato con 10 µM ATRA e aggiungere th e 13 mL in un nuovo diametro di 85 mm di Petri.
      Nota: Sopra i vari passaggi, è estremamente importante mantenere la densità di sfere alta come la densità ottenuta a giorno 2 (cioè, intorno a una densità di 70%). Pertanto, se la densità della sfera sta abbassando, ridurre il numero totale delle capsule di Petri in base al numero delle cellule.
    5. Ripetere la procedura sopra descritta (punto 1.3.4) ai giorni 4, 6 e 8.
    6. Al giorno 10, ripetere la procedura sopra descritta, ma aggiungere le sfere per le beute T75 Cell+ invece di capsule di Petri. Aggiungere le celle da una capsula di Petri in un matraccio da T75 Cell+ .
    7. A giorni 11, 13, 15 e 17, cambiare il mezzo usato con 14 mL di completo F12 DMEM completate con 10 µM ATRA.
    8. Giorno 19, sostituire il terreno con 14 mL di terreno DMEM F12 completo senza ATRA per fiaschetta.
    9. Giorno 20, dissociare delicatamente le cellule con tripsina/EDTA come segue.
      1. Per ciascuna beuta T75 Cell+ , sciacquare le cellule con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +; Incubare le cellule con 4 mL di EDTA per 5 minuti a TA.
      2. Rimuovere con cautela l'EDTA e aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA e incubare per 7 minuti a RT. agitare molto delicatamente la beuta e aggiungere attentamente 8 mL di terreno DMEM F12 completo.
      3. Centrifugare 10 per min 160 x g e RT. dissociare il pellet cellulare in 13 mL di terreno DMEM F12 completo e trasferimento in un fiasco di T75 Cell+ .
        Nota: La dissociazione molto delicata con tripsina-EDTA consentirà di recuperare l'ATRA differenziato cellule dalle cellule teratocarcinoma originale, che sono fortemente collegate agli articoli in plastica.
    10. Al giorno 21, rimuovere il supporto e le cellule morte. Aggiungere 14 mL di completa DMEM F12 supplementato con 5% FBS, glutamina 2mm, penicillina 100 IU, 100 µ g streptomicina e 0,5 µM di AraC (citosina β-D-arabinofuranoside) (completare 5% FBS DMEM F12-AraC).
    11. A 23 giorni, 25 e 28, Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di 5% FBS DMEM F12-AraC.
    12. A 29 giorni fino a 49 (ogni due giorni), Sostituisci utilizzato medium con 14 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 5% di siero bovino fetale, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina, 100 µ g streptomicina, 5 µM di FudR (5-fluoro-2' deoxyuridine) e 10 µM Urd (uridina) (completare 5% FBS DMEM F12-FudR-Urd).
    13. Al giorno 50, Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di completa DMEM F12 supplementato con 5% FBS, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina, 100 µ g streptomicina e 10 µM Urd (completare 5% FBS DMEM F12-Urd).
    14. In 51 giorni fino a 95 (due volte a settimana), Sostituisci utilizzato medio con 14 mL di completare 5% FBS DMEM F12-Urd.
      Nota: Le cellule possono essere usati per esperimenti da giorno 51 ma non oltre il giorno 95. L'uso di trattamenti seriali con inibitori della mitosi permette di recuperare la popolazione pura di co-coltura di hNeuron post-mitotici e hAstrocytes (NT2-n/a).
    15. Per le cellule del seme, procedere con trypsinization dolce come descritto per il giorno 20.

2. cellula cultura lavoro di umana microglial cells CHME/Cl5

Nota: Questo è il componente di microglial del Minibrain (Figura 1).

  1. Coltivando l'umano microglial cells CHME/Cl5
    1. Rimuovere una fiala di cellule congelate nel serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
    2. Scongelare rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    3. Trasferire le cellule in una provetta da 15 mL contenente 10 mL di terreno DMEM F12 completo completato con 5% di siero bovino fetale, glutamina 2mm, 100 UI di penicillina e streptomicina di 100 µ g (cioè completa 5% FBS DMEM F12 medio).
    4. Centrifugare a 200 x g per 5 min a RT. dissociarsi la pallina con 2 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    5. Trasferire in un pallone di T75 Cell+ contenente 13 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    6. Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza. Sostituire il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Subcoltura le cellule microgliali umano CHME/Cl5
    1. Rimuovere il mezzo di dal pallone.
    2. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di soluzione di EDTA (conservati presso RT).
    4. Aggiungere 3 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti a TA.
    5. Agitare il matraccio e assicurarsi che le cellule si staccano dalla superficie plastica.
    6. Aggiungere 10 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5% per inattivare la tripsina, trasferire in una provetta da 15 mL e centrifugare per 5 min a 200 x g e RT.
    7. Dissociare la pallina con 10 mL di terreno completo e uso 1 mL per inoculare ciascuna beuta nuovo contenente 14 mL di terreno di FBS DMEM F12 completo 5%.
    8. Incubare le beute a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 90% confluenza.

3. cultura lavoro con la hCMEC/D3 per rivestire inserti porosi e preparare BBB

  1. Coltura di cellule endoteliali umane hCMEC/D3 (Figura 2)
    1. Diluire il tipo io la spia del collagene a 01:30 con acqua sterile puro (grado di coltura delle cellule).
    2. Trasferire 10 mL in un matraccio da T75 Cell+ e incubare 2 ore a 37 ° C, 5% CO2 e incubatore di umidità 95%.
    3. Rimuovere la soluzione di collagene e sostituirlo con 15 mL di medium delle cellule endoteliali supplementato con 10 mM HEPES (denominati medium completo cellulare endoteliale).
    4. Rimuovere una fiala di cryo di cellule nel serbatoio di azoto liquido. Tenere il ghiaccio.
      Nota: Le cellule sono state coltivate, e un sacco di seme è stato effettuato come descritto dal produttore. La linea cellulare è coperto da un accordo di trasferimento di materiale biologico. Le cellule sono ottenute al numero 25 di passaggio e non devono essere utilizzate oltre il passaggio 35.
    5. Scongelare rapidamente in bagnomaria a 37 ° C.
    6. Trasferire le cellule nel matraccio T75 Cell+ e restituire il pallone a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità per 2-4 h.
    7. Rimuovere con attenzione il mezzo senza perdere o la rimozione delle cellule. Sciacquare le cellule una volta con 10 mL di terreno completo delle cellule endoteliali.
    8. Aggiungere 15 mL di terreno completo delle cellule endoteliali.
    9. Cellule di coltura a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 100% confluenza (non meno di 4 giorni) senza cambiare il mezzo.
  2. Subcoltura hCMEC/D3 per preparare l'inserto della BBB
    1. Rivestire una nuova staffa T75 Cell+ o inserti con il tipo I del collagene del ratto come descritto in precedenza (punto 3.1).
    2. Rimuovere il supporto dal pallone. Sciacquare il monostrato cellulare con 10 mL di PBS completati con Ca2 + e Mg2 +.
    3. Aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 5 minuti a 37 ° C.
    4. Agitare il matraccio e assicurarsi che le celle sono completamente staccate dalla superficie plastica.
    5. Aggiungere 4 mL di terreno completo delle cellule endoteliali per inattivare la tripsina.
    6. Con una pipetta di plastica da 5 mL, meccanicamente dissociare le cellule ad aspirazione e lavando la sospensione cellulare mentre mantenendo la pipetta 5ml al fondo del matraccio, almeno 5 volte.
    7. Contare le celle e USA 5 x 104 cellule/inserto per una cultura di membrana ben poliestere 12 inserti inserto e 2 x 106 cellule per un pallone da T75 Cell+ . Preparare anche tre filtri senza cellule per esperimenti con gli inserti di poliestere membrana cultura PELy (cioè, permeabilità di cellule endoteliali da vedere Lucifero giallo sotto il paragrafo 4.2).
    8. Incubare le boccette o inserti a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità fino al 100% confluenza.
    9. Non modificare il mezzo per boccetta T75 Cell+ fino a un nuovo passaggio. Al contrario per BBB sulla cultura di membrana in poliestere inserti: sostituire il terreno ai giorni 2 e 4, utilizzare il BBB per esperimenti al giorno 6.

4. costruzione e controllo di qualità del BBB-Minibrain (Figura 2)

  1. Creazione di un poliestere di BBB-Minibrain cultura membrana inserire dispositivo (Figura 2B)
    1. Crescere le cellule hCMEC/D3 su 12 ben poliestere cultura membrana inserire filtri per 6 giorni su medium cellulare endoteliale prima del loro utilizzo per l'esperimento.
    2. Rivestire un piatto ben 12 con poli-D-lisina (1 mL/pozzetto, 10 µ g/mL, 4 h a RT) e poi laminina (1 mL/pozzetto, 1 µ g/mL, pernottamento presso RT).
    3. Rimuovere la laminina e aggiungere 1 mL di medium di endothelial delle cellule completate con 5% FBS (media di 5% delle cellule endoteliali).
    4. Incubare per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    5. Delicatamente tripsinizzano il NT2-n/a (come descritto al punto 1.3.9) e CHME/Cl5 (come descritto al punto 2.2) e dissociare il pellet cellulare con supporto completo delle cellule endoteliali.
    6. Contare le celle, mix 3.6 x 105 NT2-n/a e 0,4 x 105 CHME/Cl5 cellule/pozzetto e piastra ben seme il 12.
    7. A T = 24 h (24 h dopo la semina): cambiare il mezzo usato con medium fresco completo endothelial delle cellule (cellule Minibrain e cellule endoteliali) e trasferire il filtro hCMEC/D3 poliestere membrana cultura inserto sulla parte superiore delle cellule Minibrain. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
      Nota: Il BBB-Minibrain sarà quindi composto da uno strato di cellule endoteliali umane hCMEC/D3 il filtro isolando il compartimento luminal (o compartimento di "sangue") e di una coltura mista di cellule umane hNT2-n/a e hCHME/Cl5 (Minibrain) nella parte inferiore di ben definizione il comparto abluminale (o vano "cervello") (Figura 2B).
  2. Convalida della permeabilità endoteliale del BBB-Minibrain (controllo qualità) (Figura 2)
    1. Preparare il tampone di trasporto (TB), che è HBSS (Hanks' equilibrata soluzione salina) buffer con Ca2 + e Mg2 + completati con piruvato di sodio 10 mM HEPES e 1 mM.
    2. Preparare 12 pozzetti con 1,5 mL di tampone di trasporto per pozzetto.
    3. T = 0, rendere fresca buffer di trasporto integrato con 50 µM Lucifer Yellow (LY-TB).
    4. Invertire ogni filtro capovolta per rimuovere con cautela il mezzo senza intaccare la barriera endoteliale delle cellule.
    5. Collocare il filtro sulla piastra ben 12 riempita e aggiungere 0,5 mL di LY-TB.
    6. Incubare le piastre in un incubatore a 37° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    7. A T = 10 min trasferimento i filtri su TB nuovo riempito 12 piastre a pozzetti e tenere il vano abluminale della prima piastra per lettura OD.
    8. A T = 25 min, ripetere il passaggio 4.2.7.
    9. A T = 45 min, interrompere il trasporto rimuovendo i filtri dalle piastre. Tenere abluminale e luminal scomparti per misure OD.
    10. Trasferimento in un buio 96 pozzetti dei campioni: 10 µ l con 190 µ l TB per la LY-TB e i vani di luminal, 200 µ l di campione per i comparti abluminale.
    11. Misurare la fluorescenza della LY-TB presenti nei diversi campioni a λ428 nm λ535 nm (lunghezza di eccitazione e di emissione delle onde rispettivamente).
    12. Calcolare la permeabilità endoteliale (Pe) verso LY-TB (PeLY) secondo Siflinger-Birnboim, A et al (1987)39 e Da Costa, A et al (2018)34 utilizzando la formula:
      1/PSe = (1/PSt) – (1/PSf) e PeLY= PSe/S.
      Nota: PSf è la permeabilità del filtro senza cellule, PSt è la permeabilità del filtro con le cellule, PSe è la permeabilità del tempo monostrato endoteliale la superficie di monostrato, S è la superficie di strato monomolecolare (per un filtro ben 12 = 1,12 cm2 ), PeLY è espressa in cm/min. Per hCMEC/D3 PeLY dovrebbe essere compresa tra 0,7 e 1,2 x 10-3 cm/min a seconda principalmente degli FB utilizzati negli esperimenti. Importante: un PeLY superiore a 1.2 significa che la BBB non è abbastanza stretta e qualche perdita può essere osservata. Eliminare queste barriere.

5. uso di BBB-Minibrain per evidenziare la presenza di particelle virali neuro-invasivo in un campione di vaccino Virus della febbre gialla, il virus neurotropi francese, YFV-FNV 34 (Figura 3)

  1. Attraversamento di BBB e moltiplicazione del virus di febbre gialla nella Minibrain
    1. Utilizzare il BBB-Minibrain preparata come descritto nel passaggio 4.1.7 24 h prima dell'aggiunta del virus; sostituire il mezzo per mezzo di 2% FBS endothelial delle cellule.
      Nota: È estremamente importante evitare di modificare il mezzo appena prima di aggiungere il virus. Cambiando il mezzo può attivare le cellule endoteliali umane e transitoriamente aprire la barriera che permetterà il passaggio del virus. Qui il mezzo è cambiato 24 h prima di iniziare l'esperimento.
    2. T = 0, aggiungere 3500 placca formando unità (PFU) di YFV-FNV diluito in 50 µ l del 2% medio delle cellule endoteliali FBS molto attentamente sulla parte superiore del vano luminal. Il controllo BBB-Minibrain viene inoculato con 50 µ l di terreno di cellule endoteliali di FBS 2% senza virus. Determinare PeLY il compagno bene.
    3. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 24 h, rimuovere il dispositivo di filtro membrana in poliestere inserti di cultura e determinare PeLY, campione 1 mL dal vano abluminale e titolare il virus come descritto da A. da Costa et al (2018)34. Sostituire il mezzo con mezzo di fresco 2% FBS endothelial delle cellule.
    5. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    6. Dopo 72 h, assaggiare il mezzo dal vano abluminale e titolare il virus, e/o estrarre il RNA dalle cellule Minibrain per analisi di espressione genica come descritto da A. da Costa et al (2018)34.
  2. Amplificazione delle varianti neurotropic di YFV-FNV sulle cellule Minibrain da passaggi consecutivi
    1. Uso Minibrain celle rivestite 12 piastre a pozzetti (vale a dire punti 4.1.6 e 4.1.7).
    2. In fase di lettera h 0, aggiungere 3.500 placca formando unità di YFV-FNV diluito in 50 µ l di 2% FBS delle cellule endoteliali terreno molto attentamente sulla parte superiore delle cellule (luminal vano).
    3. Dopo 1 h, rimuovere il supporto con l'inoculo di virus e sostituire con mezzo di fresco 2% FBS endothelial delle cellule.
    4. Dopo 48 h, campione 500 µ l di terreno di coltura e infettare cellule fresche di Minibrain
    5. Dopo 120 ore, campione 500 µ l di terreno di coltura e infettare cellule fresche di Minibrain.
    6. Dopo 192 h, salvare il terreno di coltura (= virus stock arricchito) ed estrarre il RNA dalle cellule Minibrain per analisi di espressione genica come descritto da A. da Costa et al (2018)34.

6. uso di BBB-Minibrain per studiare il cervello delle cellule targeting di una biomolecola e incrocio di BBB

  1. Trasporto attraverso la Bee di un neurone targeting biomolecule
    1. Utilizzare il Minibrain-BBB preparato come descritto passo 4.1.7.
    2. Al punto di tempo 0 h, aggiungere la biomolecola (nell'esempio fornito nella sezione risultato 58.75 ng/BBB delle molecole delle cellule permeante NeuroTag-NV sono stati aggiunti a BBB-Minibrain inserire.
    3. Incubare la BBB-Minibrain a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 24 h, rimuovere il dispositivo di filtro membrana in poliestere inserti di cultura e determinare PeLY, quindi macchiare le cellule di Minibrain per hNeurons dei neurofilamenti Nf200 e rilevare la presenza di biomolecole in Minibrain (nell'esempio fornito nel risultato sezione, NeuroTag-NV è stato rilevato usando un anticorpo diretto contro il Strep-Tag che contiene35,40).
  2. Trasporto attraverso la Bee di una biomolecola neuroregenerative e neuroprotective successive analisi nel Minibrain dopo la biomolecola ha attraversato la BBB
    1. Utilizzare il Minibrain-BBB preparato come descritto nel passaggio 4.1.7.
      Nota: Per molecole targeting solo i neuroni, le cellule Minibrain possono essere sostituite dai neuroni cellule (NT2-N) solo38.
    2. Al punto di tempo 0 h, aggiungere 58.75 ng/BBB-Minibrain bene delle molecole delle cellule permeante NV (forma attiva CPM-NeuroTag-NV, modulo non attivo CPM-NeuroTag-NVΔ) descritto da C. Prehaud et al (2014)35.
    3. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    4. Dopo 4 h, rendere le ferite individuali con un ago per iniezione (26GX1/2 ", 12-4.5, Terumo, Belgio) sulle cellule del Minibrain. Fare almeno 10 graffi su ogni singolo bene. Determinare PeLY sul compagno bene.
    5. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    6. Dopo 8 h, sostituire il mezzo nel vano abluminale dal mezzo fresco e completo delle cellule endoteliali.
      Nota: È importante sostituire il mezzo in questa fase poiché il ferimento delle cellule Minibrain può portare alla morte delle cellule e quindi il rilascio di composti citotossici.
    7. Incubare la BBB-Minibrain in un incubatore a 37 ° C, 5% CO2 e 95% di umidità.
    8. Dopo 48 h, macchiato le cellule per la rigenerazione dell'assone di hNeurons come descritto da C. Prehaud et al (2013)40.

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Risultati

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Il BBB-Minibrain è un cellulo in sperimentale modello di interfaccia sangue-cervello.

Il BBB-Minibrain è impostato sull'apparato di inserto cultura di membrana in poliestere per imitare un compartimento sangue al piano superiore e un cervello al livello inferiore dell'interfaccia sangue-cervello (Figura 2AB). Si compone di un vano luminal con le cellule endoteliali ...

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Discussione

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In questo articolo abbiamo dimostrato come costruire un cellulo in interfaccia di sangue/cervello, il BBB-Minibrain, combinando un modello BBB e una cultura di misto cervello cellule cerebrali (Minibrain) in un unico kit. Questo sistema è biologicamente rilevanti, facile da impostare e gestire per gli sperimentatori ben addestrati nella coltura delle cellule.

Come per qualsiasi altro modello in vitro di BBB, otterrebbe risultati affidabili se drastica controllo di tenuta della barriera viene a...

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Dichiarazioni

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La proprietà intellettuale del sistema era i brevetti a cui fa riferimento a 32, 35 e 38.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni interne dal Institut Pasteur inclusa una sovvenzione Incitative (PTR 435) e da una sovvenzione "Contrat de Soutien à la Recherche" fornita da Sanofi Pasteur a Institut Pasteur. A. da Costa è stato sostenuto da Sanofi-Pasteur sovvenzione e Florian Bakoa è destinatario di una borsa di dottorato fornita da ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Siamo grati a Pr Pierre-Olivier Couraud e Dr Florence Miller per utili discussioni.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
piastre a 12 pozzettiCorning3336
5-fluoro-2' deossiuridinaMerck-Sigma AldrichF0503
85mm Petri DishSarstedt83-3902-500
Anti-Nf200Merck-Sigma AldrichN4142
β-mercapto-etanoloMerck-Sigma AldrichM3148
CHME/Cl5Unité de Neuroimmunologie ViraleSu richiesta al Dr Lafon
CMCCalbiochem217274
Citosina β-D-arabinofuranosideMerck-Sigma AldrichC1768
Piastre scure a 96 pozzettiCorning3915
DMEM F12Thermofisher Scientific31330-038
DMSOMerck-Sigma AldrichD2650
Endogro IVMilliporeSCME004terreno a cellule endoteliali
EtanoloCarlo Erba529121
FBSHycloneSV30015-04
FormaldeideMerck-Sigma Aldrich252549
GIEMSARAL Diagnostic320310
Goat-Anti MouseJackson Immuno Research115-545-003
Goat-Anti RabbitThermofisher ScientificR37117
HBSS con Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14025-100
hCMEC/D3CedarlaneCLU512
Hepes 1MThermofisher Scientific15630-070
Hoescht 33342Merck-Sigma Aldrich33263
LaminineMerck-Sigma AldrichL6274
L-glutamminaThermofisher Scientific25030-024
Lucifero GialloMerck-Sigma AldrichL0259
MEM 10XThermofisher Scientific21430
MEM 1XThermofisher Scientific42360
Ntera/Cl2D.1ATCCCRL-1973
Microscopia elettronica paraformaldeideScienze15714
PBS senza Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14190
PBS-Ca2+-Mg2+Thermofisher Scientific14040-091
Pen/StrepEurobioCXXPES00-07
Poly-D-LysineMerck-Sigma AldrichP1149
Prolong GoldThermofisher ScientificP36930
QiashredderQIAGEN79656
Collagene di ratto ICultrex3443-100-01
Acido retinoico All-TransMerck-Sigma AldrichR2625
Kit di purificazione dell'RNAQIAGEN74104
SDSMerck-Sigma AldrichL4509
Bicarbonato di sodio 5,6%EurobioCXXBIC00-07
Sodium PyruvateThermofisher Scientific11360
T75 Cell+ FlaskSarstedt83-1813-302Pallone in polistirene per colture tissutali con trattamento superficiale specifico (Cell+) per cellule aderenti sensibili
Inserti per colture su membrana porosa in poliestereTranswellCorning3460
Trypsin-EDTAMerck-Sigma AldrichT3924
Acqua ultra puraThermofisher Scientific10977-035
UridinaMerck-Sigma AldrichU3750
VerseneThermofisher Scientific15040-033EDTA
YFV-FNVIP DakarFiala
di vaccino

Riferimenti

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